Name: modeling tuberculosis in mycobacterium marinum infected adult zebrafish
Uploaded: 2018-10-08T14:00:00
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この作業によって、フィンランド文化財団 (H.L.)、タンペレ結核財団 (H.L.、l.-m. v.、M.M.H.、m. p.)、フィンランドの結核協会 (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (H.L. の基礎をサポートされていますM.M.H.、m. p.)、ねんどろいど Jusélius 財団 (m. p.)、エミール ・ アールト財団 (M.M.H.)、ジェーンと Aatos Erkko 財団 (融点) とフィンランド アカデミー (融点)。その技術支援のレーナ Mäkinen、ハンナ レーナ ・ ピッポ、ジェナ ・ Ilomäki を認めた著者は、彼らのサービスのタンペレ ゼブラフィッシュ研究室を認めます。

すべてのゼブラフィッシュ実験は、動物実験委員会フィンランド (ESAVI/8245/04.10.07/2015) によって承認されています。メソッドは、行為 (497/2013) とフィンランドの科学又は教育のために使用される動物の保護に関する政府令 (564/2013) に従って実行されます。
1. 培養菌 marinumの
注: 結核菌 marinum は、人間の表面的な感染症を引き起こす可能性のある病...

ここで実験感染成人ゼブラフィッシュ組織から抽出した DNA から抗酸菌の負荷を測定する qPCR ベースのアプリケーションについて述べる。このアプリケーションは、プライマー 16S 23S rRNA スペーサー シーケンス40を中心に設計に基づいています。魚サンプルの全抗酸菌荷重は、培養抗酸菌の知られている数から抽出され、その 1 つの細菌が任意の時点でそのゲノムの 1 つのコ...

ゼブラフィッシュ (動脈分布) は生物医学研究で広く使用されている動物モデル、一般的な脊椎動物の生物学のための受け入れられたモデルです。ゼブラフィッシュひと疾患モデル研究の多くの分野で採用され、感染症や免疫学的いくつか細菌3のウイルス感染4癌1から心疾患2までの障害,5します。 さらに、ゼブラフィッシュ胚の子宮 ex開発したゼブラフィッシュ人気モデル発生生物学6および毒物学7,8。
感染生物学分野を含む研究の多くの分野で光学的に透明なゼブラフィッシュ幼虫はよく使用されます。最初の免疫細胞は、原始マクロファージが検出された9と 24 h ポスト受精 (hpf) 内で表示されます。好中球は、約 33 hpf10を表示する次の免疫細胞です。ゼブラフィッシュ幼虫は感染症の初期段階と適応免疫細胞11の不在で自然免疫の役割を研究するため可能。ただし、アダルト ゼブラフィッシュ機能的適応免疫システムは感染実験のため複雑さの追加レイヤーを提供します。T 細胞は、3 日後に受精12、および B 細胞の機能性抗体を生成することが 4 週間ポスト受精13周り検出できます。大人のゼブラフィッシュは哺乳類の自然免疫と適応免疫のすべての主要なカウンター パートです。魚の immune systems と人間の主な違いは、リンパ組織の解剖学のように同様の抗体アイソタイプで発見されます。ゼブラフィッシュの人間が 5153 つしか抗体クラス14があります。骨髄とリンパ節のない場合は、魚の第一次リンパ器官は脾臓と胸腺16腎臓、腎臓と腸の二次リンパ器官17としています。自然免疫と適応セルその完全免疫の武器とのこれらの相違にもかかわらず大人のゼブラフィッシュは宿主-病原体相互作用の研究のための非常に適用可能な簡単に使用できる、非哺乳類モデルです。
ゼブラフィッシュは、結核18,19,20,21,22を勉強する実行可能なモデルとして確立されている最近。結核は、結核菌によって引き起こされる空気中の病気です。世界保健機関によると、結核は 2016 年に1.7の百万の死を引き起こしたし、単一の病原体世界23死の主要な原因は。マウス24,25、ウサギ26ヒト以外の霊長類27が最も有名な動物モデル各面しますが、結核研究の制限。人間の病気が最も酷似の結核感染症非ひと霊長類モデルがこのモデルを使用して、重大な倫理的配慮のため限定。他の動物モデルは、結核病の病理に影響を与えるの宿主特異性によって妨げられます。おそらく結核をモデリングで最大の問題は人間の病気で感染や病気の結果の広いスペクトル: 結核は潜在的なアクティブ、再アクティブ化された感染症28 への耐性を滅菌に至る非常に異質病気、ハードを再現し、模型実験できます。
結核菌 marinumは、85% のアミノ酸のアイデンティティの29〜 3,000 相同タンパク質と結核の近親です。M. marinumは、ゼブラフィッシュ肉芽腫、その内臓19、30での結核の特徴を作り出す自然感染します。結核の研究で使用される他の動物モデルとは異なりゼブラフィッシュは多くの子孫を作り出す、限られたスペースのみ必要で、重要なは、後発の脊椎結核モデルでは neurophysiologically。M. marinum感染はひと結核19,の病気の結果のスペクトルを密接に模倣した大人のゼブラフィッシュの潜伏感染、アクティブな病や抗酸菌症のも殺菌を引き起こすまた、31,32しますここでは、 M. marinumを腹腔内に注入し、抗酸菌の負荷とゼブラフィッシュから免疫を測定する定量的 PCR を使用して大人のゼブラフィッシュの実験的結核症モデル法について述べる。組織サンプル。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mycobacterium marinum</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC 927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock 7H10 agar</td>
			<td>BD, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11799042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock OADC enrichment</td>
			<td>BD, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11718173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock 7H9 medium</td>
			<td>BD, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11753473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock ADC enrichment</td>
			<td>BD, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11718173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 80</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENESYS20 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline tablets (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4710004020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4010.200V0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnican 100 30G insulin needle</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9151133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml homogenization tube</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>13119-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.8 mm ceramic beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>13114-325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, ETAX Aa</td>
			<td>Altia</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>278475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22711.290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine thiocyanate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9277</td>
			<td>FW 118.2 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1613859</td>
			<td>FW 294.1 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (free base)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TRIS-RO</td>
			<td>FW 121.14 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI reagent</td>
			<td>Molecular Research Center</td>
			<td>TR118</td>
			<td>Guanidine thiocyanate-phenol solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLyzer24 homogenizator</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator m08</td>
			<td>Finnsonic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-98005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR 96-well plate</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>HSP9601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optically transparent film</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Thermal cycler with CFX96 real-time system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase AWAY</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10666421</td>
			<td>decontamination reagent eliminating RNases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcription Master Mix</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-6298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFast Eva Green master mix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>172-5211</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling tuberculosis in mycobacterium marinum infected adult zebrafish

結核は現在毎年 170 万の死と 1040 万感染症を引き起こして最悪人間の病原体であります。この細菌への露出は、滅菌感染から積極的に進んで致命的な病気に至るまで人間の広い疾患のスペクトルを発生します。最も一般的な形式は、無症候性ですが、劇症疾患に再アクティブ化する可能性がある潜在的な結核です。アダルト ゼブラフィッシュとその自然の病原体菌 marinum結核の幅広い疾患のスペクトルを研究に該当するモデルであると証明した最近。重要なは、自発的な待機時間再活性化と抗酸菌感染症の適応の免疫反応はこのモデルで学ぶことができます。この記事で大人ゼブラフィッシュ、内臓抗酸菌荷重および量的な PCR によるホストの免疫反応の測定のための核酸の抽出のためのコレクションの実験的感染症法について述べる。社内の開発、 M. marinum -特定の qPCR の試金は非分裂、休止状態または最近死んだ抗酸菌から DNA が検出されるも、伝統的なめっきより敏感。DNA と RNA の両方は同じ個体から抽出した、病気の状態とホストと病原体の遺伝子発現との関係を研究することが可能です。結核成人ゼブラフィッシュ モデルはこうしてホスト病原体の相互作用を研究する、応用性・非哺乳類体内システムとしてそれ自身を示します。

天然魚の病原体菌 marinumゼブラフィッシュの臓器に感染し、組織学的肉芽腫19全身性感染症を生成します。大人のゼブラフィッシュは、腹腔内注入によるm. marinumに感染しています。DNA や RNA を抽出、およびテンプレートとして DNA を使用して量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) による抗酸菌の負荷を測定します。法の概要を<strong class="x...

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Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

その自然の病原体菌 marinumを使用して大人のゼブラフィッシュ モデルひと結核にプロトコルを紹介します。抽出された DNA と感染したゼブラフィッシュの内臓からの RNA は、抗酸菌の合計負荷魚と qPCR で宿主の免疫反応を明らかにする使用できます。

結核抗酸菌 marinum感染成人ゼブラフィッシュをモデル化

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

この方法は、適応免疫応答の役割やこの多因子性疾患の病因など、結核の分野における重要な質問に答える助けとなる。この核酸塩基法の主な利点は、細菌負荷と遺伝子発現レベルの両方を同じ個体から測定できることである。この手順を開始するには、テキストプロトコルで概説されているように、7H10プレート上の培養M.marinum。ADC濃縮を含む7H9培地の10ミリリットルを転写し、ポリソルベート80、およびグリセロールを細胞培養フラスコに移す。次に、滅菌1マイクロリットル接種ループを使用して、M.marinum細菌塊のループをフラスコに無菌で伝達する。キャップを緩めたままにするか、OD600が約0.7に達するまで3〜4日間揺れることなく、暗闇の中で摂氏29度で十分なガス交換と培養を可能にするためにフィルターキャップを使用してください。テキストに概説されているように、細菌を希釈し、培養し続けます。感染のための細菌溶液の調製を開始するには、培養物の1ミリリットルを新鮮なチューブに移す。遠心分離機を10,000gで3分間行う。上清を取り除き、滅菌PBSの1ミリリットルでペレットを再懸濁します。滅菌PBSをトレーサーとしてフェノールレッドのミリリットル当たり0.3ミリグラムで使用し、懸濁液を希釈して所望の細菌濃度に達する。この後、1ミリリットルの注射器を使用して、27ゲージの針を通してサスペンションを3回ゆっくりと引っ張ります。各アリコートに対して使用する直前にこの手順を実行します。まず、希釈された細菌溶液の5マイクロリットルの液滴をパラフィンフィルムの一部にピペットする。その後、液滴を30ゲージのインスリン針に引き込みます。この実験には5〜8ヶ月の魚を使用し、1つは野生のタイプの魚であり、もう1つはボロ突然変異魚です。湿った泡立ったプラスチックの破片のスリットにこれらの魚の腹側を上に置きます。45度の角度で骨盤のフィンの間にインスリン針を注入します。針を上向きに開いたままにして、開口部全体が腹腔内にあることを確認します。次いで、細菌溶液をゆっくりと注入する。この後、慎重に針を取り出し、すぐに新鮮なタンクの水で満たされた回収槽に魚を転送します。7H10プレートで15分ごとに使用されている細菌アリコートからサンプルを採取します。これらのサンプルを摂氏29度で5日間インキュベートし、感染量を確認します。魚の幸福を定期的に確認し、3アミノ安息香酸エチルエステルの0.02%以上で水中でインキュベートすることで、感染症状を伴う魚を安楽死させることを確認してください。魚を安楽死させた後、枝柱線に後方にピンを挿入します。尾に2番目のピンを挿入して、魚をプラットフォームに取り付けます。メスを使用して、腹腔全体を開きます。その後、小さなスプーンと鋭いピンセットを使用して、心臓から始まり、背骨に沿って尾に向かって働いて1つのブロック内臓を取り外します。ピンセットを使用して、クロアカから腸網を取り外し、半ダースの2.8ミリメートルセラミックビーズを含む1.5ミリリットルの均質化チューブに臓器を移します。すぐにチューブをドライアイスの上に置き、サンプルを凍結します。均質化する準備ができるまで、サンプルをマイナス80°Cで保存します。DNAとRNAを抽出した後、テキストプロトコルに概説されているように定量PCRによりマイコバクテリア負荷を測定します。この研究では、成体ゼブラフィッシュは腹腔内注射によってM.marinumに感染している。高い感染量は、平均負荷が最終的に魚を殺す約500万の細菌に達するまで、マイコバクテリア負荷が増加し続ける進行性疾患につながると見られる。一方、低用量は、進行性、潜伏、再活性化、および滅菌感染症を有するヒト結核に見られるのと同様の疾患スペクトルの発症につながる。この場合、負荷は4週間増加し続け、その後、病気は魚の大部分で安定した状態に達する。このデータは、魚に感染するために使用されるマイコバクテリアの最初の数が感染の結果のための重要な決定要因であることを明らかにします。ラグー変異ゼブラフィッシュは、高い細菌負荷と罹患率の増加につながるマイコバクテリアの成長を十分に制限することができないと見られています。これは明らかにマイコバクテリア感染を制御する適応免疫の重要性を示しています。インターロイキン-4のレベルは、インターロイキン-4の効率的な導入には適応応答が必要であるが、マイコバクテリア感染後のインターフェロンガンマの導入には欠かせないことが明らかな野生型群では有意に高い。このプロトコルは、同じサンプルからDNAとRNAの両方を収集することを可能にし、サンプルのマイコバクテリアの負担と宿主と細菌の両方の遺伝子発現データを組み合わせることを可能にする。この技術は、抗細菌性負荷および免疫応答に対するそれらの効果を評価するために、薬物またはワクチン候補の投与と組み合わせることができる。この手順を試みる間、バイオセーフティレベル2病原体で作業する際には、個人の安全と廃棄物処理に関する現地ガイドラインに従うことを忘れないでください。この技術により、生体内モデルで倫理的な非哺乳類であるゼブラフィッシュにおける休眠中のマイコバクテリアを用いた活性結核と潜伏結核の両方を研究することが可能になる。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

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のサンプル調製<em&gt;結核菌</em核磁気共鳴代謝研究のための&gt;抽出

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の成長結核バイオフィルム

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An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

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Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

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System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

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細胞内の標的阻害剤の有効性及び細胞毒性スクリーニングのためのシステム<em&gt;結核菌</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

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マクロファージ継代に対する薬効を評価するために、ハイスループットアッセイの互換性<em&gt;結核菌</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...