Name: modeling tuberculosis in mycobacterium marinum infected adult zebrafish
Uploaded: 2018-10-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish at JoVE.com

Эта работа оказывает поддержку путем финский культурный фонд (H.L.), Тампере туберкулезом Foundation (H.L., л-м.в., M.M.H., м.п.), Фонд финской ассоциации борьбы с туберкулезом (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (H.L., M.M.H., м.п.), Зигрид Jusélius фонда (м.п.), Эмиля Аалтонена фонда (M.M.H.), Джейн и Aatos Эркко фонда (м.п.) и Академия Финляндии (м.п.). Leena Мякинен, Ханна-Леена Piippo и Дженна Ilomäki признаны за их технической помощи. Авторы признают Тампере данио рерио лаборатории для их обслуживания.

Все данио рерио эксперименты были одобрены Советом эксперимент животное в Финляндии (ESAVI/8245/04.10.07/2015). Методы выполняются согласно закону (497/2013) и постановление правительства (564/2013) о защите животных, используемых для научных или образовательных целях в Финляндии.
1. выращив...

Здесь мы описываем ПЦР-приложения на основе измерения микобактериальной нагрузок от ДНК, извлеченные из экспериментально зараженных взрослых рыбок данио тканей. Это приложение основано на грунты, построена вокруг 16S-23S рРНК внутренней трансляции распорку последовательности...

Данио рерио (Danio рерио) широко используется модель животных в биомедицинских исследованиях и это принятой модели для общей биологии позвоночных. Данио рерио была адаптирована для многих областях исследований, моделирования человеческих заболеваний и расстройств, начиная от1 рак и болезни сердца2 инфекции и иммунологических исследований ряда бактериальных 3 и вирусных инфекций4 , 5. Кроме того, бывший внутриутробное развитие зародышей данио рерио сделал данио рерио популярная модель в биологии развития6 и токсикологии7,,8.
Во многих областях исследований, включая инфекции биологии оптически прозрачные данио рерио личинки обычно используются. Первый иммунные клетки появляются в течение 24 ч пост оплодотворение (hpf), когда примитивные макрофаги обнаружены9. Нейтрофилы являются следующий иммунные клетки появляться около 33 hpf10. Данио рерио личинки таким образом целесообразно для изучения на ранних стадиях инфекции и роль врожденного иммунитета при отсутствии адаптивных иммунные клетки11. Однако взрослые данио рерио с ее полностью функциональный адаптивной иммунной системы обеспечивает дополнительный уровень сложности для инфекции экспериментов. Т-клетки могут быть обнаружены вокруг 3 дней после оплодотворения12, и B клетки способны производить функциональных антител 4 недели поста оплодотворение13. Взрослый данио рерио обладает всеми основными партнерами врожденного и адаптивного иммунной системе млекопитающих. Основные различия между immune systems рыбы и люди находятся в антитела изотипов, а также Анатомия лимфоидной ткани. Данио рерио имеет только три антитела классов14, тогда как люди имеют пять15. В отсутствие лимфатических узлов и костного мозга первичных лимфоидных органов рыб являются почки и тимуса16 и селезенка, почки и кишечник служат в качестве вторичных лимфоидных органов17. Несмотря на эти различия, с его полной иммунной Арсенал врожденного и адаптивного клеток взрослых рыбок данио — весьма возможно, easy-to-use, не млекопитающих модель для исследования взаимодействия хост патогена.
Данио рерио в последнее время был создан как возможно модель для изучения туберкулеза18,19,20,21,22. Бортовых заболевание, вызываемое микобактериями туберкулезаявляется туберкулез. По данным Всемирной организации здравоохранения туберкулеза умерли1,7 миллионов в 2016 году и является ведущей причиной смерти во всем мире один возбудитель23. Мышей24,25, кроликов26 и27 нечеловеческих приматов являются наиболее известных животных моделей исследования туберкулеза, но каждое лицо их ограничения. Нечеловеческих приматов модель микобактерий инфекции напоминает человеческие заболевания наиболее тесно, но с помощью этой модели ограничена из-за серьезных этических соображений. Другие животные модели препятствуют хост специфика микобактерий туберкулеза , которая влияет на заболевания патология. Вероятно, самая большая проблема в моделировании туберкулеза является широкий спектр инфекции и болезни результатов в заболеваний человека: туберкулез является болезнью весьма неоднородной, начиная от стерилизации иммунитет к скрытой, активных и возобновленные инфекции28 , который может быть трудно воспроизвести и модель экспериментально.
Mycobacterium marinum является близким родственником микобактерий туберкулеза с ~ 3000 orthologous белки с 85% аминокислот личность29. М. marinum естественно заражает данио рерио, производство гранулемы, признаки туберкулеза, в его внутренних органов19,30. В отличие от других животных моделей, используемых в исследованиях туберкулеза данио рерио производит много потомства, он требует только ограниченное пространство и главное, это neurophysiologically наименее развитых позвоночных туберкулезом модель доступна. Кроме того м. marinum инфекция вызывает латентной инфекции, активной болезни или даже стерилизации микобактериальной инфекции в взрослых рыбок данио, тесно имитирует спектр заболеваний результаты человека туберкулезом19, 31 , 32. здесь, мы описываем методы для экспериментальной туберкулезом модель взрослых рыбок данио путем впрыскивать marinum м. в брюшной полости и количественного PCR для измерения микобактериальной нагрузок и иммунные реакции от данио рерио образцы тканей.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mycobacterium marinum</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC 927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock 7H10 agar</td>
			<td>BD, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11799042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock OADC enrichment</td>
			<td>BD, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11718173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock 7H9 medium</td>
			<td>BD, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11753473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock ADC enrichment</td>
			<td>BD, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11718173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 80</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENESYS20 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline tablets (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4710004020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4010.200V0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnican 100 30G insulin needle</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9151133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml homogenization tube</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>13119-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.8 mm ceramic beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>13114-325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, ETAX Aa</td>
			<td>Altia</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>278475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22711.290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine thiocyanate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9277</td>
			<td>FW 118.2 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1613859</td>
			<td>FW 294.1 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (free base)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TRIS-RO</td>
			<td>FW 121.14 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI reagent</td>
			<td>Molecular Research Center</td>
			<td>TR118</td>
			<td>Guanidine thiocyanate-phenol solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLyzer24 homogenizator</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator m08</td>
			<td>Finnsonic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-98005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR 96-well plate</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>HSP9601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optically transparent film</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Thermal cycler with CFX96 real-time system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase AWAY</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10666421</td>
			<td>decontamination reagent eliminating RNases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcription Master Mix</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-6298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFast Eva Green master mix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>172-5211</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling tuberculosis in mycobacterium marinum infected adult zebrafish

Микобактерии туберкулеза в настоящее время смертоносных человеческий патоген, вызывая 1,7 миллиона смертей и 10,4 миллиона инфекций каждый год. Воздействие эта бактерия вызывает широкий болезни спектра в организме человека, начиная от стерилизованные инфекции активно прогрессирующей смертельной болезни. Наиболее распространенной формой является латентный туберкулез, который протекает бессимптомно, но имеет потенциал, чтобы активировать в молниеносный заболевание. Взрослый данио рерио и его природного патогена Mycobacterium marinum недавно оказались применимыми модель для изучения заболевание широкий спектр туберкулеза. Важно отметить, что спонтанное задержки и возобновления, а также адаптивного иммунного ответа в контексте микобактериальной инфекции могут быть изучены в этой модели. В этой статье мы описываем методы для экспериментальной инфекции взрослых рыбок данио, коллекции внутренних органов для извлечения нуклеиновых кислот для измерения микобактериальной нагрузок и принимающих иммунные реакции путем количественного PCR. В-дом-развитых, м. marinum -конкретного ПЦР анализа более чувствительны, чем традиционных покрытий методами, как он также обнаруживает ДНК от-деления, спящие или недавно мертвых микобактерий. Как ДНК и РНК извлекаются из того же лица, это возможно для изучения взаимосвязи между состояние больного и хозяин и возбудителя экспрессии генов. Взрослый zebrafish модель для туберкулеза таким образом позиционирует себя как очень применимо, не млекопитающих в естественных условиях системы для изучения взаимодействия хост патогена.

Природные рыбы возбудителя Mycobacterium marinum заражает внутренних органов у рыбок данио и производит системной инфекции с гистологически видимых гранулемы19. С . м. marinum взрослых рыбок данио заражены внутрибрюшинной инъекции. ДНК и РНК извлекаются, и ми?...

Watch this Scientific Journal Video about Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish at JoVE.com

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Здесь мы представляем протокол к модели людских туберкулезом в взрослых рыбок данио, используя свой естественный возбудитель Mycobacterium marinum. Извлечения ДНК и РНК от внутренних органов зараженных данио рерио может использоваться для показывают, что всего микобактериальной загружает в рыбы и хозяина иммунной реакции с ПЦР.

Моделирование туберкулеза Mycobacterium marinum инфицированных взрослых рыбок данио

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области туберкулеза, такие как роль адаптивной иммунной реакции и патогенез этого многофакторного заболевания. Основным преимуществом этого базового метода нуклеиновой кислоты является то, что как бактериальные нагрузки, так и уровни экспрессии генов могут быть измерены одним и тем же человеком. Чтобы начать эту процедуру, культура M.marinum на пластине 7H10, как указано в текстовом протоколе.Перенесите 10 миллилитров среды 7H9, содержащей обогащение ADC, полисорбат 80 и глицерол в колбу клеточной культуры. Затем используйте стерильную одну цикл прививки микролитара, чтобы асептически перенести одну петлю бактериальной массы M.marinum в колбу. Оставьте крышку свободной или использовать крышку фильтра, чтобы обеспечить достаточный обмен газа и культуры при 29 градусов по Цельсию в темноте без встряхивания в течение трех-четырех дней, пока OD600 достигает около 0,7.Разбавить и продолжать культивирование бактерий, как указано в тексте. Чтобы начать готовить бактериальный раствор к инфекции, перенесите один миллилитр культуры в свежую трубку. Центрифуга при 10 000 г в течение трех минут.Удалите супернатант и повторно посовелите гранулы в один миллилитр стерильного PBS. Используя стерильный PBS с 0,3 миллиграмма на миллилитр фенола красного в качестве трассировщика, разбавить суспензию, чтобы достичь желаемой бактериальной концентрации. После этого используйте один миллилитровый шприц, чтобы медленно тянуть подвеску через 27 калибровочных игл три раза.Выполните этот шаг перед использованием для каждого aliquot. Во-первых, пипетка пять микролитров капли разбавленного бактериального раствора на кусок парафиновой пленки. Затем потяните каплю в иглу инсулина 30 калибра.Используйте пять-восемь месяцев рыбы для этого эксперимента с одним из которых дикий тип рыбы, а другой является тряпкой мутант рыбы. Распорежьте эти рыбы брюшной стороны вверх в щелях кусок влажного вспененной пластика. Ввимить инсулиновую иглу между тазовыми плавниками под углом 45 градусов.Держите иглу открытия вверх, чтобы убедиться, что все отверстие находится внутри брюшной полости. Затем медленно вводят бактериальный раствор. После этого аккуратно снимите иглу и немедленно перенесите рыбу в восстановительный резервуар, наполненный пресной водой.Возьмите образцы из бактериальной aliquot в использовании каждые 15 минут на 7H10 пластин. Инкубировать эти образцы при 29 градусах по Цельсию в течение пяти дней, чтобы проверить дозу инфекции. Регулярно проверяйте самочувствие рыбы, убедившись, что усылать любую рыбу с симптомами инфекции, инкубируя их в воде более чем на 0,02% от 3-аминобензойной кислоты этилового эстера.После усыпления рыбы, вставьте булавку задней в branchiostegal лучей. Вставьте второй штифт через хвост, чтобы прикрепить рыбу на платформу. Используя скальпель, откройте всю брюшную полость.Затем используйте небольшую ложку и острым пинцетом, чтобы собрать внутренние органы, начиная с сердца и работая вдоль позвоночника к хвосту, чтобы отделить все внутренние органы в одном блоке. Используйте пинцет, чтобы отделить китроу от клоакы и перенести органы в 1,5 миллилитровую гомогенизацию трубки, содержащей полдюжины 2,8-миллиметровых керамических бусин. Немедленно поместите трубку на сухой лед, чтобы заморозить образец.Храните образец при отрицательном 80 градусов по Цельсию до готовности к гомогенизации. После извлечения ДНК и РНК, измерить микобактериальные нагрузки по количественным ПЦР, как указано в текстовом протоколе. В этом исследовании взрослые зебры заражены M.marinum внутриперитонеальной инъекцией.Высокая доза инфекции, как видно, приведет к прогрессирующему заболеванию, при котором микобактериальная нагрузка продолжает увеличиваться до тех пор, пока средняя нагрузка не достигнет около пяти миллионов бактерий, в конечном счете убивая рыбу. Низкая доза, с другой стороны, приводит к развитию спектра заболеваний, аналогичного тому, который наблюдается при туберкулезе человека с прогрессирующими, скрытыми, реактивированными и стерилизованными инфекциями. В этом случае нагрузка продолжает увеличиваться в течение четырех недель, после чего болезнь достигает стабильного состояния у большинства рыб.Эти данные показывают, что первоначальное число микобактерий, используемых для заражения рыбы является критическим фактором, определяющим исход инфекции. Rag мутант зебры, как видно, не в состоянии достаточно ограничить рост микобактерий, ведущих к более высоким бактериальным нагрузкам и повышенной заболеваемости. Это наглядно демонстрирует важность адаптивного иммунитета в борьбе с микобактериальной инфекцией.Уровни интерлекина-4 значительно выше в группе дикого типа, что показывает, что адаптивная реакция необходима для эффективного введения интерлейкина-4, но может быть незаменима для введения интерферон гамма после микобактериальной инфекции. Этот протокол позволяет сбор как ДНК, так и РНК из одного и того же образца, что позволяет сочетать микобактериальное бремя образца с данными экспрессии генов как хозяина, так и бактерий. Этот метод может быть объединен с введения препаратов или вакцин кандидатов для оценки их влияния на микобактериальные нагрузки и иммунные реакции.При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы следовать местным руководящим принципам для личной безопасности и удаления отходов при работе с биобезопасности уровне два патогена. Этот метод позволяет изучать как активный, так и скрытый туберкулез с спящими микобактериями у зебры, которая является этической моделью in vivo, не являющейся млекопитающим.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Пример подготовки<em&gt; Микобактерий туберкулеза</em&gt; Экстракты для ядерно-магнитного резонанса исследований Metabolomic

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Рост Микобактерий туберкулеза Биопленки

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Экспериментальная модель для изучения Туберкулез-малярией Коинфекция на естественной передачи Микобактерии туберкулеза И Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Демонстрация с множественной лекарственной устойчивостью<em&gt; Микобактерии туберкулеза</em&gt; Усиление микрочипов

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Создание и Оптимизация Верховного установки пропускной изучать<em&gt; Эпидермальный стафилококк</em&gt; И<em&gt; Mycobacterium Marinum</em&gt; Инфекция в качестве модели для Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Моделирование слизистой оболочки кандидоз мальков данио рерио по плавательного пузыря инъекций

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

3D-человека легочной ткани Модель функциональных исследований по<em&gt; Микобактерии туберкулеза</em&gt; Инфекция

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Расшифровка и визуализации патогенез и запи-<em&gt; Микобактерии abscessus</em&gt; У эмбрионов данио рерио

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Система для эффективности и цитотоксичности скрининга ингибиторов Таргетинг внутриклеточных<em&gt; Микобактерии туберкулеза</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

Высокая пропускная способность Совместимость анализа для оценки эффективности против наркотиков пассировать макрофагов<em&gt; Микобактерии туберкулеза</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...