Name: modeling tuberculosis in mycobacterium marinum infected adult zebrafish
Uploaded: 2018-10-08T14:00:00
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Este trabajo ha sido apoyado por el finlandés Cultural Foundation (H.L.), Tampere Tuberculosis Foundation (H.L., L.-M.V., M.M.H., M.P.), Fundación de la Asociación contra la Tuberculosis finlandesa (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (H.L., M.M.H., M.P.), Sigrid frescos Juselius Fundación (M.P.), Emil Aaltonen Foundation (M.M.H.), Jane y Aatos Erkko Fundación (M.P.) y Academia de Finlandia (M.P.). Leena Mäkinen, Hanna-Leena Piippo y Jenna Ilomäki son reconocidos por su asistencia técnica. Los autores reconocen el laboratorio de pez cebra de Tampere para su servicio.

Pez cebra todos los experimentos han sido aprobados por la Junta de experimento Animal en Finlandia (ESAVI/8245/04.10.07/2015). Métodos se realizan según la ley (497/2013) y el decreto del gobierno (564/2013) sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos o educativos en Finlandia.
1. cultivo de Micobacterium marinum
Nota: Desde marinum de la micobacteria es un patógeno capaz de causar infecciones superficiales en los seres humanos...

Aquí describimos una aplicación basada en qPCR para medir cargas micobacterias de ADN extraído de los tejidos del pez cebra adulto infectados experimentalmente. Esta aplicación se basa en cartillas diseñadas alrededor de la 16S-23S rRNA espaciador transcrito interno secuencia40. La carga total de micobacterias en una muestra de pescado se calcula usando una curva estándar, preparada a partir de ADN extraído de un número conocido de micobacterias cultivadas y suponiendo que una bacteria tie...

Pez cebra (Danio rerio) es un modelo animal ampliamente utilizado en la investigación biomédica y es un modelo aceptado para la biología de vertebrados comun. El pez cebra se ha adaptado a muchos campos de investigación modelado de enfermedades humanas y trastornos que van desde cáncer1 y2 de la enfermedad cardiaca infección y estudios inmunológicos de varias bacterias 3 y las infecciones virales4 , 5. Además, el desarrollo de ex útero de embriones de pez cebra ha hecho el pez cebra un modelo popular en Biología del desarrollo6 y toxicología7,8.
En muchos campos de investigación, incluida la biología de la infección, se utilizan las larvas de pez cebra ópticamente transparente. Las primeras células inmunes aparecen dentro de fertilización post de 24 h (hpf), cuando los macrófagos primitivos son detectado9. Neutrófilos son las células inmunes próximo a aparecer alrededor 33 hpf10. Larvas de pez cebra son factibles para el estudio de las primeras etapas de la infección y el papel de la inmunidad innata en la ausencia de las células inmunes adaptantes11. Sin embargo, el pez cebra adulto con su sistema inmune adaptante completamente funcional proporciona una capa adicional de complejidad para los experimentos de infección. Las células T pueden detectarse alrededor de 3 días post fecundación12, y B las células son capaces de producir anticuerpos funcionales por 4 semanas post fecundación13. El pez cebra adulto cuenta con las principales contrapartes de los mamíferos inmunitarias innata y adaptativa. Las principales diferencias entre la immune systems de los peces y los seres humanos se encuentran en isotipos de anticuerpos, así como en la anatomía de los tejidos linfoides. El pez cebra tiene sólo tres anticuerpos clases14, mientras que los seres humanos tienen cinco15. En la ausencia de médula ósea y ganglios linfáticos, los órganos linfoides primarios en los peces son el riñón y el16 del timo y el bazo, el riñón y el intestino sirven como órganos linfoides secundarios17. A pesar de estas diferencias, con su arsenal completo inmune de células innatas y adaptativas, el pez cebra adulto es un modelo altamente aplicable, fácil de usar, no mamíferos para estudios de la interacción huésped-patógeno.
El pez cebra se ha establecido últimamente como un posible modelo para estudiar la tuberculosis18,19,20,21,22. La tuberculosis es una enfermedad aerotransportada causada por Mycobacterium tuberculosis. Según la Organización Mundial de la salud, la tuberculosis causó1,7 millones de muertes en 2016 y es la principal causa de muerte por un solo patógeno en todo el mundo23. Ratones de24,25, conejos26 y27 de primates no humanos son que los animales más conocidos modelos de investigación de tuberculosis sino cada cara sus limitaciones. El modelo de primates no humanos de infección por M. tuberculosis se asemeja a la enfermedad humana más cerca, pero con este modelo es limitado debido a serias consideraciones éticas. Otros modelos animales se ven obstaculizados por la especificidad del hospedador de M. tuberculosis que afecta a la patología de la enfermedad. El amplio espectro de infección y enfermedad los resultados en la enfermedad humana es probablemente el mayor problema en modelado de tuberculosis: la tuberculosis es una enfermedad muy heterogénea desde esterilización inmunidad a la infección latente, activa y reactivar28 , que puede ser difícil de reproducir y modelo experimental.
Mycobacterium marinum es un pariente cercano de M. tuberculosis con proteínas orthologous ~ 3.000 con el 85% del aminoácido identidad29. M. marinum naturalmente infecta peces cebra produce granulomas, los sellos de la tuberculosis, en sus órganos internos19,30. A diferencia de otros modelos animales utilizados en la investigación de la tuberculosis, pez cebra produce muchos descendientes, que requiere sólo un espacio limitado y lo importante, es el modelo de tuberculosis vertebrados menos desarrollado disponible neurophysiologically. Además, la infección de M. marinum provoca una infección latente, enfermedad activa o incluso la esterilización de la infección micobacteriológica en pez cebra adulto mímico de cerca el espectro de los resultados de la enfermedad de tuberculosis humana19, 31 , 32. aquí, se describen métodos para el modelo de tuberculosis experimental del pez cebra adulto por M. marinum de inyección en la cavidad abdominal y mediante PCR cuantitativa para medir las cargas de micobacterias y respuesta inmune del pez cebra muestras de tejido.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mycobacterium marinum</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC 927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock 7H10 agar</td>
			<td>BD, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11799042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock OADC enrichment</td>
			<td>BD, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11718173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock 7H9 medium</td>
			<td>BD, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11753473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock ADC enrichment</td>
			<td>BD, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11718173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 80</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENESYS20 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline tablets (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4710004020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4010.200V0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnican 100 30G insulin needle</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9151133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml homogenization tube</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>13119-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.8 mm ceramic beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>13114-325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, ETAX Aa</td>
			<td>Altia</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>278475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22711.290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine thiocyanate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9277</td>
			<td>FW 118.2 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1613859</td>
			<td>FW 294.1 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (free base)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TRIS-RO</td>
			<td>FW 121.14 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI reagent</td>
			<td>Molecular Research Center</td>
			<td>TR118</td>
			<td>Guanidine thiocyanate-phenol solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLyzer24 homogenizator</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator m08</td>
			<td>Finnsonic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-98005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR 96-well plate</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>HSP9601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optically transparent film</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Thermal cycler with CFX96 real-time system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase AWAY</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10666421</td>
			<td>decontamination reagent eliminating RNases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcription Master Mix</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-6298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFast Eva Green master mix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>172-5211</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling tuberculosis in mycobacterium marinum infected adult zebrafish

Mycobacterium tuberculosis es actualmente el patógeno humano más mortal causando infecciones 10,4 millones y 1,7 millones de muertes cada año. La exposición a esta bacteria causa un espectro amplio de enfermedad en los seres humanos que van desde una infección esterilizada a una mortal enfermedad activa progresiva. La forma más común es la tuberculosis latente, que es asintomática, pero tiene el potencial de reactivar en una enfermedad fulminante. Pez cebra adulto y su patógeno natural marinum de la micobacteria han demostrado recientemente para ser un modelo aplicable para estudiar el espectro amplio de enfermedad de la tuberculosis. Lo importante, se puede estudiar espontánea latencia y reactivación así como respuestas inmune adaptativas en el contexto de infección por micobacterias en este modelo. En este artículo, se describen métodos para la infección experimental del pez cebra adulto, la colección de órganos internos para la extracción de ácidos nucleicos para la medición de cargas de micobacterias y anfitrión inmunorespuestas por PCR cuantitativa. El en desarrollada internamente, M. marinum -ensayo qPCR específica es más sensible que los métodos tradicionales de la galjanoplastia como también detecta DNA de micobacterias no se dividen, latentes o recientemente muertas. Como ADN y ARN extraídos de la misma persona, es posible estudiar las relaciones entre el estado enfermo y la expresión de genes huésped y patógeno. El modelo de pez cebra adulto para la tuberculosis se presenta así como un sistema altamente aplicable, no mamíferos en vivo para el estudio de las interacciones huésped-patógeno.

El patógeno natural de pescado marinum de la micobacteria infecta los órganos internos del pez cebra y produce una infección sistémica con granulomas histológicamente visible19. Pez cebra adulto están infectadas con M. marinum por inyección intraperitoneal. Se extracción el ADN y el ARN, y la carga por micobacterias se mide por la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) usando la DNA como plantilla. El esquema del método ...

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Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Aquí, presentamos un protocolo de tuberculosis humana modelo en un pez cebra adulto utilizando su patógeno natural marinum de la micobacteria. Extraen ADN y ARN de los órganos internos del pez cebra infectado pueden utilizarse para revelar que el total de micobacterias cargas en los peces y la respuesta inmune del hospedador con qPCR.

Modelado de la Tuberculosis de Mycobacterium marinum infección pez cebra adulto

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la tuberculosis, como cuál es el papel de las respuestas inmunitarias adaptativas y la patogénesis de esta enfermedad multifactorial. La principal ventaja de este método base de ácido nucleico es que tanto las cargas bacterianas como los niveles de expresión génica se pueden medir desde el mismo individuo. Para comenzar este procedimiento, haga referencia a M.marinum en una placa 7H10 como se describe en el protocolo de texto.Transfiera 10 mililitros de medio 7H9 que contengan enriquecimiento ADC, polisorbato 80 y glicerol a un matraz de cultivo celular. A continuación, utilice un bucle de inoculación estéril de un microlitrotro para transferir asépticamente un bucle de masa bacteriana M.marinum al matraz. Deje la tapa suelta o use una tapa de filtro para permitir un intercambio de gas y un cultivo suficientes a 29 grados centígrados en la oscuridad sin agitar durante tres o cuatro días hasta que el OD600 alcance aproximadamente 0,7.Diluir y continuar cultivando las bacterias como se describe en el texto. Para comenzar a preparar la solución bacteriana para la infección, transfiera un mililitro del cultivo a un tubo fresco. Centrifugar a 10.000 g durante tres minutos.Retire el sobrenadante y resusppend el pellet en un mililitro de PBS estéril. Usando PBS estéril con un 0,3 miligramos por mililitro de fenol rojo como un trazador, diluir la suspensión para alcanzar la concentración bacteriana deseada. Después de esto, utilice una jeringa de un mililitro para tirar lentamente de la suspensión a través de una aguja de calibre 27 tres veces.Realice este paso justo antes de su uso para cada alícuota. En primer lugar, pipetear una gota de cinco microlitros de la solución bacteriana diluida en un trozo de película de parafina. Luego, tire de la gota en una aguja de insulina de calibre 30.Usa un pez de cinco a ocho meses para este experimento con uno siendo un pez de tipo salvaje y el otro un pez mutante de trapo. Coloque estos peces de lado ventral hacia arriba en las rendijas de un pedazo de plástico espumado húmedo. Inyecte la aguja de insulina entre las aletas pélvicas en un ángulo de 45 grados.Mantenga la aguja abriéndose hacia arriba para asegurarse de que toda la abertura esté dentro de la cavidad abdominal. Luego, inyecte lentamente la solución bacteriana. Después de esto, retire cuidadosamente la aguja y transfiera inmediatamente el pescado a un tanque de recuperación lleno de agua fresca del tanque.Tomar muestras de la alícuota bacteriana en uso cada 15 minutos en placas 7H10. Incubar estas muestras a 29 grados centígrados durante cinco días para verificar la dosis de infección. Compruebe el bienestar de los peces regularmente, asegurándose de eutanasiar cualquier pez con síntomas de infección incubando en agua con más de 0.02%de 3-ácido aminobenzoico éster etílico.Después de eutanasiar el pescado, inserte un pasador posterior a los rayos branchiostegal. Inserte un segundo pasador a través de la cola para atajer el pez en la plataforma. Con un bisturí, abre toda la cavidad abdominal.Luego, usa una cuchara pequeña y pinzas afiladas para recoger los órganos internos comenzando en el corazón y trabajando a lo largo de la columna vertebral hacia la cola para separar todos los órganos internos en un bloque. Utilice pinzas para separar la red intestinal de la cloaca y transferir los órganos a un tubo de homogeneización de 1,5 mililitros que contiene media docena de cuentas de cerámica de 2,8 milímetros. Coloque inmediatamente el tubo sobre hielo seco para congelar la muestra.Almacene la muestra a 80 grados celsius negativos hasta que esté lista para homogeneizarse. Después de extraer el ADN y el ARN, mida las cargas micobacterianas por PCR cuantitativo como se describe en el protocolo de texto. En este estudio, los peces cebra adultos se infectan con M.marinum mediante una inyección intraperitoneal.Se observa una dosis alta de infección que conduce a una enfermedad progresiva en la que la carga micobacteriana continúa aumentando hasta que la carga media alcanza alrededor de cinco millones de bacterias matando en última instancia a los peces. Una dosis baja, por otro lado, conduce al desarrollo de un espectro de enfermedad similar al observado en la tuberculosis humana con infecciones progresivas, latentes, reactivadas y esterilizadas. En este caso, la carga continúa aumentando durante cuatro semanas después de lo cual la enfermedad alcanza un estado estable en la mayoría de los peces.Estos datos revelan que el número inicial de micobacterias utilizadas para infectar a los peces es un determinante crítico para el resultado de la infección. Se considera que el pez cebra mutante de trapo no puede limitar suficientemente el crecimiento de las micobacterias, lo que aumenta las cargas bacterianas y aumenta la morbilidad. Esto demuestra claramente la importancia de la inmunidad adaptativa para controlar la infección micobacteriana.Los niveles de interleucina-4 son significativamente más altos en el grupo de tipo salvaje revelando que la respuesta adaptativa es necesaria para la introducción eficiente de la interleucina-4, pero prescindible para la introducción de la gamma de interferón después de la infección micobacteriana. Este protocolo permite la recopilación de ADN y ARN de la misma muestra, lo que permite combinar la carga micobacteriana de la muestra con datos de expresión génica tanto del huésped como de las bacterias. Esta técnica se puede combinar con la administración de medicamentos o candidatos a vacunas para evaluar su efecto en las cargas micobacterianas y las respuestas inmunitarias.Al intentar este procedimiento, es importante recordar seguir las pautas locales para la seguridad personal y la eliminación de residuos cuando se trabaja con un patógeno de nivel dos de bioseguridad. Esta técnica permite estudiar la tuberculosis activa y latente con micobacterias latentes en el pez cebra que es un modelo ético no mamífero in vivo.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Preparación de la muestra de<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Extractos de Estudios de Resonancia Magnética Nuclear metabolómica

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Investigación

Inmunología e Infección

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

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Crecimiento de Mycobacterium tuberculosis Las biopelículas

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

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Sistema para la eficacia y la citotoxicidad de detección de inhibidores de focalización intracelular<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

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A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

Un ensayo compatible de alto rendimiento para evaluar la eficacia del fármaco contra los macrófagos a pases<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...