Name: isolation and decellularization of a whole porcine pancreas
Uploaded: 2018-10-10T14:00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas at JoVE.com

Undersøgelsen blev finansieret af et tilskud fra den svenske regering LUA ALF til S.S.H.

Dissektion af et svin bugspytkirtlen og decellularization procedure præsenteres her følger de etiske retningslinjer for universitetet i Göteborg.
1. forberedelse af Decellularization opsætning
<ol><li>Bruger 3 x 5 mm silikone rør, tilsluttes i serie vaskemiddel inlet container peristalic pumpe og derefter på bugspytkirtlen i orglet kammer via afgasser (Se figur 1). Tilslut en mandlig luer til den frie ende af røret i orgel kammer.</li>
	<li>Ved hjælp af en anden 3 x 5 mm silicium tube, Tilslut orgel kammer til vaskemiddel outlet container via den peristaltiske pumpe til at indsamle perfused vaskemiddel.</li>
	<li>Tilslut en 2 ml umærkede pipette til de frie ender af rør i vaskemiddel inlet container og vaskemiddel outlet cointainer.</li>
	<li>Holde det hele set-up ved 4 ° C.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58302/58302fig1v2.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;"> Figur 1: forberedelse af perfusion set-up. Ved hjælp af en 3 x 5 mm silikone slange, som vist i set-up, tilsluttes i serie objektbeholderen vaskemiddel indløb den peristaltiske pumpe, afgasser og orgel kammer. De sorte pile Vis strømningsretningen fra vaskemiddel inlet beholder til orgel kammer. For den vaskemiddel outlet, bruge en anden 3 x 5 mm silikone rør og forbinde orgel kammer via den peristaltiske pumpe til objektbeholderen vaskemiddel outlet. De røde pile viser strømningsretning fra orgel kammer til vaskemiddel outlet container. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58302/58302fig1v2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
2. forberedelse af Decellularization løsninger
<ol><li>Løsning 1 (fosfatbufferet saltopløsning [PBS]): tilføje 8 g natriumchlorid (137 mM), 0,2 g (2,7 mM) kaliumchlorid, 1,44 g (10 mM) natrium fosfat og 0,24 g (1,8 mM) kalium fosfat til 1 L ultrarent vand og rør indtil opløst. PH indstilles til 7.4 med saltsyre (HCl). I alt er 3,2 L af denne løsning påkrævet.</li>
	<li>Løsning 2 (PBS + heparin): til 1 L af løsning 1, tilføje 3,4 mL af heparin (17 internationale enheder [IU] /mL). Forberede denne løsning friske og holde den på is, indtil det bliver koldt. I alt er 1,2 L af denne løsning påkrævet.</li>
	<li>Løsning 3 (ultrarent vand + natriumazid + dinatrium ethylendiamintetra syre [EDTA]): til 1 L ultrarent vand, tilføje 1.86 g (5 mM) EDTA og 200 mg (0,02%) natriumazid. Rør indtil salte er opløst. Cool løsning til 4 ° C før brug. I alt er 22 L af denne løsning påkrævet.</li>
	<li>Løsning 4 (PBS + natriumazid + EDTA): til 1 L af løsning 1, tilføje 200 mg (0,02%) natriumazid og 1,86 g (5 mm) EDTA. Rør indtil salte er opløst. Cool løsning til 4 ° C før brug. I alt er 1 L af denne løsning påkrævet.</li>
	<li>Løsning 5 (ultrarent vand + natriumazid): til 1 L ultrarent vand, tilføje 200 mg (0,02%) natriumazid. Rør indtil salte er opløst. Cool løsning til 4 ° C før brug. I alt er 260 L af denne løsning påkrævet. Bemærk: EDTA danner et bundfald med SDC og blev udelukket fra løsning 5, da det vil blive brugt til øjeblikkelig vask før og efter SDC behandling.</li>
	<li>Løsning 6 (SDC + Triton X-100): Til 940 mL i ultrarent vand, der tilsættes 40 g (4%) SDC, 60 mL (6%) Triton X-100, 200 mg (0,02%) natriumazid og 69,6 mg (0,4 mM) phenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF). Rør indtil opløst. Cool løsning til 4 ° C før brug. Tilføj PMSF før brug. I alt er 9,6 L af denne løsning påkrævet.</li>
	<li>Opklaring 7 (DNase): Tilføje 10.000 Kunitz enheder af DNase-jeg i 250 mL (40 Kunitz enheder/mL) Dulbecco PBS indeholdende CaCl2 og MgCl2. Forberede friske og bruge med det samme. Varm løsning til 37 ° C før brug.</li>
	<li>Løsning 8 (PBS + natrium indeholder): til 1 L af løsning 1, tilføje 200 mg (0,02%) natriumazid. Rør indtil salte er opløst. Cool løsning til 4 ° C før brug. I alt er 1 L af denne løsning påkrævet.</li>
</ol>3. dissektion af svin bugspytkirtlen
Bemærk: I denne undersøgelse, svin bugspytkirtel var dissekeret fra euthanized, heparinized (400 IU/kg) kvindelige svin vejer 45 kg fra en gård.
<ol><li>Sted gris på tabellen dissektion i den liggende stilling.</li>
	<li>Gøre en midterlinjen indsnit fra den xiphoidal proces til skambenet (ca 40 cm) ved hjælp af en skalpel, udsætter alle abdominale organer.</li>
	<li>Find den milt, sår på tolvfingertarmen, og forbindelsen lapper.</li>
	<li>Find niveauet af de store duodenale papilla og ligate duodenum mundtligt fra dette websted ved hjælp af to separate suturer.</li>
	<li>Ligate ringere spiserøret med to separate suturer og skære mellem ligaturer med saks til at tegne i maven.</li>
	<li>Adskille bindevæv fra tyktarmen til tyndtarmen.</li>
	<li>Adskille bindevæv af tyktarmen, der tillægger den milt lap af bugspytkirtlen.</li>
	<li>Fjerne tyktarmen fra tyndtarmen efter ligating arterier.</li>
	<li>Find den ringere mesenteriallymfeknuderne vene og træet, ringere mesenterica arterie og ligate med en sutur, hvor de vises caudally i bugspytkirtlen.</li>
	<li>Ligate milt arterie og vene sammen med en sutur, tæt på milten i hilum, og skær distalt med saks til at fjerne milten.</li>
	<li>Følg duodenum indtil den duodenale og forbindelsen fliger er ryddet og ligate duodenum enden med to separate suturer.</li>
	<li>Dissekere Vena, ligate det med en sutur til at forhindre enhver blod lækage fra leveren og skære proksimalt til ligatur. Portalen vene fungerer som en afsætningsmulighed under decellularization.</li>
	<li>Dissekere og ligate galdegang og hepatisk arterie med to suturer. Skære distalt til suturer.</li>
	<li>Finde aorta under nyre-vene og dissekere det i kraniel retning fra muskler og bindevæv, indtil den når området i bugspytkirtlen.</li>
	<li>Flip bugspytkirtlen forsigtigt og dissekere aorta, med SMA og CT intakt, og skær aorta overlegen i forhold til CT og ringere til SMA med saks.</li>
	<li>Skære de resterende omgivende væv med saks og tegne bugspytkirtlen.</li>
	<li>Ved hjælp af en 50 mL sprøjte tilsluttet 4-mm arteriotomy kanyle, skylle orgel gennem aorta med løsning 2, indtil det perfuses hele orglet, eller hele orglet bliver koldt.</li>
</ol>4. forberedelse af svin bugspytkirtlen for Decellularization
<ol><li>Holde bugspytkirtlen ved 4 ° C eller på is i hele processen.</li>
	<li>Skære suturer af duodenum ved hjælp af saks, rense det af fødevarer ved rødmen 50-150 mL i ultrarent vand bruger en 25-mL pipette, og ligate det igen med suturer.</li>
	<li>Ligate ene ende af aorta og alle grene ud over SMA og CT med suturer at forhindre lækage.</li>
	<li>Indsætte fra anden enden af aorta en 4-mm arteriotomy kanyle og ligate det med suturer.</li>
	<li>Perfuse bugspytkirtlen med løsning 3 for 1 t 20 mL/min. ved hjælp af decellularization set-up. Bemærk: Prefill rør pumpe med løsning 3, sådan at ingen bobler Angiv bugspytkirtlen. Kigge efter eventuelle lækager fra alle sider af orglet og ligate alle åbne vaskulære grene med suturer, undtagen Vena.</li>
	<li>Fryse bugspytkirtlen ved-20 ° C i løsning 4 indtil begyndelsen af decellularization.</li>
</ol>5. decellularization af svin bugspytkirtlen
<ol><li>Tø bugspytkirtlen ved 4 ° C.</li>
	<li>Køre den peristaltiske pumpe i decellularization struktur med løsning 3 på 20 mL/min., indtil ingen luftbobler ses i vaskemiddel fjorden rør.</li>
	<li>Anbring bugspytkirtlen i decellularization beholder og forbinde vaskemiddel inlet tube til aorta i bugspytkirtlen. Vaske til orglet af perfusion med løsning 3 overnatning på 20 mL/min. ved 4 ° C.</li>
	<li>Hæld opløsningen tilbage i salen, orgel.</li>
	<li>Erstatte løsning 3 med løsning 5 og perfuse bugspytkirtlen i 30 min. ved 20 mL/min. ved 4 ° C. Udøse løsning i salen, orgel.</li>
	<li>Tilføje løsning 6 og perfuse bugspytkirtlen til 8 h 20 mL/min. ved 4 ° C. Udøse løsning i salen, orgel.</li>
	<li>Vaske til orglet af perfusion med løsning 5 for 96 h på 20 mL/min. ved 4 ° C. Udøse løsning i salen, orgel.</li>
	<li>Forbered bugspytkirtlen DNase behandling ved recirkulerende 500 mL Dulbeccos PBS indeholdende CaCl2 og MgCl2 i 30 minutter ved 37 ° C. Udøse løsning i salen, orgel.</li>
	<li>Der tilsættes 250 mL løsning 7 og perfuse bugspytkirtlen for 4 h på 20 mL/min. ved 37 ° C. Udøse løsning i salen, orgel.</li>
	<li>Vaske til orglet af perfusion med løsning 5 for 120 h på 20 mL/min. ved 4 ° C.</li>
	<li>Gemme orglet i løsning 8, ved 4 ° C for korte perioder eller ved-20 ° C i lange perioder.</li>
</ol>6. kontrol af Decellularization
<ol><li>Ved hjælp af saks, klippe 3 - 10 mm biopsier fra alle kamre af bugspytkirtlen og ordne dem i formaldehyd i 48 timer ved stuetemperatur.</li>
	<li>Vaske stykker i ultrarent vand i 15 min, behandle dem på en væv processor efter standardprotokoller, og integrere dem i paraffin.</li>
	<li>Skær 5 µm sektioner ved hjælp af mikrotomen og bejdse dem af Meyers hæmatoxylin og 0,2% alkoholholdige eosin (han) efter standardprotokoller.</li>
	<li>Se dias under et lysmikroskop at tjekke for tabet af kerner. Bemærk: Et stykke fra en frisk væv behandles på samme måde kan bruges som en kontrol til at kontrollere tilstedeværelsen af kerner.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yang, H. K., Yoon, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+encapsulated+islet+transplantation.">Current status of encapsulated islet transplantation.</a> Journal of Diabetes and its Complications. 29 (5), 737-743 (2015).</li><li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-organ+tissue+engineering:+Decellularization+and+recellularization+of+three-dimensional+matrix+scaffolds.">Whole-organ tissue engineering: Decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+metazoan+extracellular+matrix.">The evolution of metazoan extracellular matrix.</a> Journal of Cell Biology. 196 (6), 671-679 (2012).</li><li>Scarritt, M. E., Pashos, N. C., Bunnell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+cellularization+strategies+for+tissue+engineering+of+whole+organs.">A review of cellularization strategies for tissue engineering of whole organs.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnol. 3, 43 (2015).</li><li>Goh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+pancreas+as+a+natural+3D+scaffold+for+pancreatic+tissue+and+whole+organ+engineering.">Perfusion-decellularized pancreas as a natural 3D scaffold for pancreatic tissue and whole organ engineering.</a> Biomaterials. 34 (28), 6760-6772 (2013).</li><li>Wu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Culture+of+MIN-6+Cells+on+Decellularized+Pancreatic+Scaffold.">3D Culture of MIN-6 Cells on Decellularized Pancreatic Scaffold.</a> In Vitro and In Vivo Study. Biomed Research International. 2015, 432645 (2015).</li><li>Peloso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Pancreas+as+a+Source+of+Protolerogenic+Extracellular+Matrix+Scaffold+for+a+New-generation+Bioartificial+Endocrine+Pancreas.">The Human Pancreas as a Source of Protolerogenic Extracellular Matrix Scaffold for a New-generation Bioartificial Endocrine Pancreas.</a> Annals of Surgery. 264 (1), 169-179 (2016).</li><li>Mirmalek-Sani, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+pancreas+extracellular+matrix+as+a+platform+for+endocrine+pancreas+bioengineering.">Porcine pancreas extracellular matrix as a platform for endocrine pancreas bioengineering.</a> Biomaterials. 34 (22), 5488-5495 (2013).</li><li>Taylor, M. J., Baicu, S., Greene, E., Vazquez, A., Brassil, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+isolation+from+juvenile+porcine+pancreas+after+24-h+hypothermic+machine+perfusion+preservation.">Islet isolation from juvenile porcine pancreas after 24-h hypothermic machine perfusion preservation.</a> Cell Transplantation. 19 (5), 613-628 (2010).</li><li>Elebring, E., Kuna, V. K., Kvarnstrom, N., Sumitran-Holgersson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold-perfusion+decellularization+of+whole-organ+porcine+pancreas+supports+human+fetal+pancreatic+cell+attachment+and+expression+of+endocrine+and+exocrine+markers.">Cold-perfusion decellularization of whole-organ porcine pancreas supports human fetal pancreatic cell attachment and expression of endocrine and exocrine markers.</a> Journal of Tissue Engineering. 8, 2041731417738145 (2017).</li><li>Gilpin, A., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+Strategies+for+Regenerative+Medicine:+From+Processing+Techniques+to+Applications.">Decellularization Strategies for Regenerative Medicine: From Processing Techniques to Applications.</a> Biomed Research International. 2017, 9831534 (2017).</li><li>James, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+the+protease+inhibitor+phenylmethylsulfonyl+fluoride+in+buffers.">Inactivation of the protease inhibitor phenylmethylsulfonyl fluoride in buffers.</a> Analytical Biochemistry. 86 (2), 574-579 (1978).</li><li>Lichstein, H. C., Soule, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+the+Effect+of+Sodium+Azide+on+Microbic+Growth+and+Respiration:+I.+The+Action+of+Sodium+Azide+on+Microbic+Growth.">Studies of the Effect of Sodium Azide on Microbic Growth and Respiration: I. The Action of Sodium Azide on Microbic Growth.</a> Journal of Bacteriology. 47 (3), 221-230 (1944).</li></ol>

S.S.H. besidder aktier i Verigraft, et selskab, der har licenseret teknologien af blodkar vævsmanipulering. Andre forfattere har intet at videregive.

Den foreslåede protokol, ved hjælp af perfusion af SDC og Triton X-100 ved 4 ° C, vil decellularize hele svin bugspytkirtlen korrekt. Udfordringen i denne teknik er dissektion af intakt bugspytkirtlen indeholdende alle de tre kamre uden at beskadige parenkym samt dens formidlende fartøjer og ligatur af andre vaskulære grene af modellen for at perfuse orgel uden lækage. Svin bugspytkirtlen har en forskellige anatomi i forhold til den menneskelige bugspytkirtlen. Det består af tre lapper og forbliver i tæt kontakt med tyndtarmen ved dels omkring den. Vi dissekeret duodenum sammen med bugspytkirtlen, som flere små blodkar fra bugspytkirtlen forbinde tarmen. Under optimering studier, har stump skæring af disse blodkar vist lækage og en ufuldstændig perfusion af løsninger.
Da aorta forbinder til bugspytkirtlen gennem cøliaki og overlegne mesenteriallymfeknuderne arterierne, valgte vi aorta som en indgang til at holde perfusion enkle ved kun at bruge én kanyle og derfor et indløb. Vores erfaring, ligatur af aorta over CT og under SMA vil formindske tid af dissektion og reducerer risikoen for at beskadige nogen af de to skibe. Ud over en heparinized gris bemærket vi også, at en perfusion af kolde heparin via aorta umiddelbart efter dissektion hjælper med at opnå perfusion af løsninger i hele orglet. Vi spekulere, hvis dette sker ved at forebygge dannelsen af blodpropper i blodkarrene. Den indledende perfusion af en bugspytkirtlen med ultrarent vand efter dissektionen vil lyse røde blodlegemer og fjerne blod resterne i orgel, derved forhindrer dannelsen af blodpropper. Denne periode kan også bruges til at finde nogen unligated små grene af vener og arterier, som blodgennemstrømning kan være let bemærket ovenfor baggrunden.
Vi valgte at holde hele decellularization procedure ved kolde temperaturer (4 ° C), da dette vil hæmme virkningen af eksokrine enzymer, der frigive fra eksokrine celler i bugspytkirtlen. De eksokrine enzymer, når ikke hæmmet, kan forårsage en skadelig indvirkning på celler og ECM, som de kan fordøje cellemembraner og proteiner12. Som nedfrysning og optøning kan effektivt brast cellerne, indgår vi et fryse/tø skridt, i første omgang selv før perfusion af vaske-og rengøringsmidler4,13. Den første vask efter optøning vil fjerne resterne af celle brister. Vaskemiddel behandling vi brugt er en blanding af SDC og Triton X-100 på usædvanligt høje koncentrationer og med en høj perfusion hastighed. Vi har valgt denne tilgang til at opnå hurtigere decellularization ved at fjerne de eksokrine celler, der skader ECM. Vi spekulere, at en hård og hurtig protokol er til gavn for bugspytkirtlen decellularization, kortere tid vil være til rådighed for pancreas enzymer til at interagere med ECM, dermed bevare gode ECM komponenter. For at bevare ECM komponenter, tilføjet vi også Serin protease hæmmer (PMSF) til vaskemiddel-løsninger, som der vil hæmme aktiveringen af enzymer frigivet fra eksokrine celler14. Natriumazid er føjet til alle decellularization løsninger, da det fungerer som en bakteriostatisk agent, dermed hæmme risikoen for bakteriel forurening15.
Bugspytkirtlen decellularized efter denne protokol, viste en bevarelse af ECM strukturer og ECM proteiner kollagen og elastin. Men et betydeligt tab af glycosaminoglycans blev bemærket i decellularized bugspytkirtlen. Bugspytkirtlen decellularized på denne måde også viste lovende for fastgørelse af menneskelige føtal pancreas stamceller og udtryk for eksokrine og endokrine markører i stykker recellularized for 14 dage12. For at generere en intakt og funktionsdygtig bugspytkirtlen, kræves yderligere forskning i evaluere korrekte celle kilder, celletyper, celle seeding strategier og bioreaktor kultur.

Diabetes mellitus er karakteriseret ved tilstedeværelsen af øgede niveauer af glukose i blodet. Det er anerkendt som en større offentlige sundhedsudfordring i de fleste lande1. Høje niveauer af blodsukker påvirker blodkar og nervesystem, forårsager skader på øjnene, hjertet, og nyrer, og ekstremiteter iskæmi. Traditionelle metoder til behandling omfatter injektioner af eksogen insulin, medicin og livsstilsændringer. At se bort fra en kur for sygdommen, i nogle tilfælde, undlader tilgængelige behandlinger at vedligeholde insulin ved terapeutiske niveauer, hvilket resulterer i hyperglykæmi. Selv om transplantation af Holme eller hele bugspytkirtlen eliminerer sygdommen, er det ikke almindeligt gjort på grund af mangel på egnet donor organer og de risici og vanskeligheder fra immunosuppression og indkapsling2.
Nuværende forbedringer inden for tissue engineering og regenerativ medicin besidder evnen til at levere en løsning for disse problemer. Med en teknik, decellularization, den cellulære materiale fra mennesker eller dyr donor kan fjernes samtidig vigtigt ekstracellulære matrix (ECM) proteiner, vækstfaktorer, og signalering molekyler er bevaret i skafottet. Sådanne stilladser kan potentielt blive transplanteret uden behov for immunosuppression, gendanne funktionen orgel efter recellularization med modtagerens egen ikke-immunogen stamceller3,4. Væv-manipuleret organer fra allogene eller xenogene kilder kan anvendes i klinisk transplantation, større ekstracellulære matrix proteiner er bevaret blandt arter og kan ikke afvises efter transplantation5.
Decellularization er et godt udforsket metode med en optimal udnyttelse af fysiske kræfter, kemiske rengøringsmidler og enzymer i en fysiologisk indstilling til at fjerne celler og nukleart materiale fra et væv eller organ. Recellularization er en procedure for såning celler tilbage i acellulær orgel. Det er et intellektuelt hård procedure, der kræver et stort antal celler, en optimal celle-seeding strategi og en bioreaktor system for kulturen i orgel på fysiologisk acceptable forhold som temperatur, tryk og gasser6.
Bugspytkirtlen kan betragtes som en udfordrende væv til vævsmanipulering på grund af sin eksokrine og endokrine kapacitet. De eksokrine væv udskiller flere fordøjelsesenzymer, mens den endokrine del udskiller hormoner, herunder insulin. Decellularization af intakt bugspytkirtel fra mus7,8, menneskelige9og gris10 er allerede blevet rapporteret ved hjælp af enzymer (trypsin, deoxyribonuclease [DNase]) og ikke-ionisk (Triton X-100) og ioniske detergenter ( natrium deoxycholate [SDC] og sodium dodecyl sulfat [SDS]). Men efter de publicerede protokoller, vi kæmpede med en vellykket dissektion og komplet perfusion og decellularization samtidig med at en ECM struktur. Vi spekulerede, at de anvendte rengøringsmidler under decellularization forårsage lysering af celler, dermed frigøre fordøjelsesenzymer ind i orglet. De frigivne enzymer vil medføre en uoprettelig skade på ECM stillads og gør det ineffektivt for decellularization og recellularization. Et design af den metode, der effektivt decellularizes bugspytkirtlen mens hæmme virkningen af fordøjelsesenzymer kan løse problemet. Vi valgte strategi af Peloso et al., af decellularization i bugspytkirtlen ved en kold temperatur, selv om de ikke rapportere om hvorfor kolde temperatur er brugt9. På samme tid, vi har designet en dissektion strategi med ændringer fra Taylor et al. ved at vælge aorta som en perfusion indløb over cøliaki stammen (CT) og den overlegne mesenteriallymfeknuderne arterie (SMA)11.
I en nylig offentliggjort artikel12viser vi en metode til effektiv isolation og decellularization af svin bugspytkirtlen samtidig bevare nogle ECM komponenter. I dette papir, vi viser en detaljeret beskrivelse af hvordan at dissekere en hele svin bugspytkirtlen indeholdende milt, sår på tolvfingertarmen, og forbindelsen lapper, og fremlægge en trinvis protokol for vellykket decellularization.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
		<tbody>
		<tr >
			<td >4mm DLP arteriotomy cannula</td>
			<td >Medtronic</td>
			<td >31104</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2ml Unlabelled pipette</td>
			<td >vWR</td>
			<td >612-3720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Degasser</td>
			<td >Biotech AB</td>
			<td >0001-6484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase-I</td>
			<td >Worthington</td>
			<td >LS0020007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s PBS with CaCl2 and MgCl2</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td >AlfaAesar</td>
			<td >A15161.OB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heparin</td>
			<td >Leo</td>
			<td >387107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Luer Male with 1/8&#34; ID Barb</td>
			<td >Oina</td>
			<td >LM-2PP-QC</td>
			<td>For 3X5mm silicon tube</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Peristaltic pump</td>
			<td >Oina</td>
			<td >SP-1X4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PMSF</td>
			<td >Roche</td>
			<td >10837091001</td>
			<td>Unstable in aqueous solution. Should be added fresh before perfusion.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium chloride</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium hydrogen phosphate</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SDC</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silicon tube 3X5mm</td>
			<td >VWR</td>
			<td >2280706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Azide</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >71290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium chloride</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >13423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium hydrogen phosphate</td>
			<td >Merck</td>
			<td >71640-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Suture</td>
			<td >V&#246;mel</td>
			<td >14817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syrringe 50mL</td>
			<td >Becton Dickinson</td>
			<td >300137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton-X-100</td>
			<td >AlfaAesar</td>
			<td >A16046.OF</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and decellularization of a whole porcine pancreas

Vævsmanipulering af hele bugspytkirtlen kan forbedre nuværende behandlinger for diabetes mellitus. Det ultimative mål er at væv ingeniør bugspytkirtlen fra en allogene eller xenogene kilde med humane celler. En demonstration af metoder til effektiv dissektion, decellularization og recellularization af svin bugspytkirtlen kan gavne feltet. Beslægtet med menneskets bugspytkirtel, svin bugspytkirtel har en særlig anatomisk ordning med tre kamre (milt, sår på tolvfingertarmen, og forbindelsen) afrundet af duodenum og tyndtarmen. Den duodenal lap af bugspytkirtlen tilsluttes duodenum ved flere små blodkar. Vævsmanipulering i bugspytkirtlen er kompliceret på grund af dens eksokrine og endokrine karakter. I dette papir vise vi en detaljeret protokol at dissekere hele svin bugspytkirtlen og decellularize det med vaske-og samtidig spare sin struktur og nogle ekstracellulære matrix komponenter. For at opnå komplet perfusion, er aorta valgt som indløb og portal vene som afsætningsmulighed. Andre blodkar (hepatisk arterie, milt vene, milt arterie, mesenterica arterie og vene træ) og galdegang er forbundet. For at forhindre dannelse af blodprop, grisen er heparinized, og straks efter dissektion, orglet er skyllet med koldt heparin. For at hæmme virkningen af eksokrine enzymer, ligger bugspytkirtlen decellularization på 4 ° C. Decellularization er udført af perfusion af Triton X-100, natrium deoxycholate og deoxyribonuclease, med en intermitterende og endelige omfattende vask. Med en vellykket decellularization, bugspytkirtlen vises hvide og en histologisk vurdering med hæmatoxylin og eosin viser en manglende kerner med en bevarede ekstracellulære matrixstruktur. Den foreslåede metode kan således bruges at dissekere og decellularize hele svin bugspytkirtlen.

Repræsentative svin bugspytkirtlen dissektion billeder, som kan hjælpe med at lokalisere og dissekere den ringere mesenterica arterie og vene træ, Vena, leverens arterie, galdegang og aorta forgrener sig til CT og SMA, er vist i figur 2A, 2bog 2 C (gule pile), henholdsvis. Figur 3A viser brutto morfologi af en normal bugspytkirtel, som vises lys pink og indeholder milt, forbindelse og duodenal lapper. Efter decellularization, den lyserøde farve er tabt og decellularized bugspytkirtlen ser bleg hvid i farve. Brutto morfologi billedet viser milt, er forbindelse og duodenal lapper i en decellularized bugspytkirtlen vist i figur 3B. Figur 3 c viser tilstedeværelsen af mange blå kerner i en normal bugspytkirtel ved farvning med han. I en decellularized bugspytkirtlen, han farvning viste et tab af cellekerner, som ingen blå kerner ses (figur 3D).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58302/58302fig2v2.jpg"> Figur 2: billeder af et svin bugspytkirtlen dissektion. (A) placering af den ringere mesenterica arterie og vene træ (gul pil). (B) ligatur af Vena, leverens arterie og galdegang (gul pil). (C) Aorta forgrener sig til cøliaki stammen og den overlegne mesenteriallymfeknuderne arterie (gul pil). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58302/58302fig2v2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58302/58302fig3.jpg"> Figur 3: brutto morfologi og han farvning af normale og decellularized bugspytkirtel. (A) brutto morfologi af en normal bugspytkirtel. (B) brutto morfologi af en decellularized bugspytkirtlen. (C) han farvning viser tilstedeværelsen af blå kerner i en normal bugspytkirtel. (D) han farvning viser mangel af blå kerner i en decellularized bugspytkirtlen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58302/58302fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas at JoVE.com

Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas

Vævsmanipulering af hele bugspytkirtlen er en udfordring på grund af dens eksokrine og endokrine funktioner. Vi viser en metode til dissektion af en intakt svin bugspytkirtlen og processen af vellykkede decellularization af perfusion af detergenter Triton X-100, natrium deoxycholate og deoxyribonuclease.

Isolation og Decellularization af en hele svin bugspytkirtel

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an ...

Denne metode kan anvendes til dissektion af svine pancreas indeholder tilslutning, duodenal, og milt lapper og eventuel decellularization via perfusion af rengøringsmidler ved kolde temperaturer. Selv om denne metode til decellularization giver indsigt i svinet bugspytkirtlen, Det kan også anvendes til pancreata fra andre store dyr. Den største fordel ved denne teknik er, at det letter intakt hentning af et kompliceret organ, såsom bugspytkirtlen, for yderligere væv engineering applikationer.Generelt, individer nye til denne metode, de vil kæmpe, fordi dissektion af den intakte bugspytkirtel samtidig identificere og ligating alle de omkringliggende blodkar kræver en masse praksis at mestre. Før du begynder proceduren, skal du bruge en tre-af-fem-millimeter silikone rør til at forbinde vaskemiddel beholder til peristaltiske pumpe og en anden tre-by-fem-millimeter silikone rør til at forbinde peristaltiske pumpe til orgel kammer via degasser. Tilslut en han luer til den frie ende af det andet rør, og brug en tredje tre-af-fem-millimeter silikone rør til at forbinde orgel kammer til vaskemiddel indsamling beholder via peristaltiske pumpe.Til sidst skal du tilslutte en to millimeter uretter uden etiket til de frie ender af rørene i vaskemiddelbeholderen og vaskemiddelopsamlingsbeholderen. Placer derefter decellulariseringsopsætningen ved fire grader Celsius. At høste bugspytkirtlen, placere en hepariniseret, 45-kilogram, hun svin på en dissektion bordet i liggende position, og bruge en skalpel til at gøre en 40-centimeter midterlinjen snit fra xiphoid processen til skambenet at udsætte abdominale organer.Efter at have identificeret milt, duodenal, og tilslutning lapper, finde de store duodenal papilla, og bruge to individuelle suturer til mundtligt ligate duodenum fra webstedet. Ligate ringere spiserøret med yderligere suturer, og skæres mellem ligaturer med en saks for at lette fjernelse af maven. Adskiv bindevæv fra tyktarmen for at nå tyndtarmen, og adskille bindevæv i tyktarmen, der tillægger miltlappen i bugspytkirtlen.Tyndtarmen er knyttet til bugspytkirtlen ved bindevæv på miltlappen, men også omgiver bugspytkirtlen. Du er nødt til nøje at følge tarmvejen for at detangle og adskille bindevæv mellem tarmen og bugspytkirtlen. Efter ligating arterierne, fjerne tyktarmen fra tyndtarmen.Identificer ringere mesenteric vene, ringere mesenteric arterie træ, og ligte fartøjerne med en sutur caudal til bugspytkirtlen og skæres med en saks. Ligate milt arterie og vene sammen i hilum, tæt på milten, og skæres distalt med en saks for at fjerne milten. Følg duodenum, indtil duodenal og tilslutning lapper er ryddet, og ligate duodenum i slutningen med to separate suturer.Den del af duodenum, der er i tæt kontakt med forbindelsen og duodenal lapper fjernes med bugspytkirtlen, som ligation af alle de små blodkar mellem de to organer er for svært. Efter dissekering af portalvenen, ligte beholderen med en sutur for at forhindre blodlækage fra leveren, og dissekere og ligte galdegang og leverpulsåren med to suturer. Derefter skæres portal vene, leverpulsåren, og galdegang med en saks.Find aorta under nyrevene, og dissekere aorta i kranieretningen fra musklen og bindevæv, indtil fartøjet når bugspytkirtlen. Nu forsigtigt vende bugspytkirtlen over, og dissekere aorta, holde den overlegne mesenteric arterie og cøliaki stammen intakt. Skær aorta kraniet til cøliaki stammen, og stump dissekere de resterende omgivende væv til at tillade høst af bugspytkirtlen.Brug derefter en 50-milliliter sprøjte forbundet til en fire-millimeter arteriotomi kanyle til at skylle orglet gennem aorta med opløsning to, indtil hele organet er perfunderet, eller indtil hele orglet bliver koldt. Anvend opløsningen to perfunderes bugspytkirtlen på en metalbakke på is, med aorta opad, og brug en saks til at skære suturerne fra duodenum. Brug en 25-milliliter pipette til at skylle duodenum med 50 til 150 milliliter ultrarent vand, og religate vævet med friske suturer.Ligate den ene ende af aorta og alle grene, bortset fra den overlegne mesenteric arterie og cøliaki stammen, for at forhindre lækage, og indsætte en fire-millimeter arterioty kanyle i den anden ende af aorta. Dernæst placere bugspytkirtlen i orgelkammeret, og forbinde kanylen i bugspytkirtlen til en mandlig Luer. Derefter, gennemgafle bugspytkirtlen med opløsning tre i en time ved 20 milliliter i minuttet, og fryse dobbelt-perfunderes bugspytkirtlen på minus 20 grader Celsius i løsning fire indtil starten af decellularization.På dagen for at starte decellularisering, tø bugspytkirtlen ved fire grader Celsius, og placere optøet bugspytkirtel i decellularization organ kammer. Tilslut vaskemiddel indløbsrør til aorta i bugspytkirtlen, og vask bugspytkirtlen med opløsning tre ved 20 milliliter i minuttet natten over ved fire grader Celsius. Den næste morgen, dekantere enhver opløsning tilbage i orgelkammeret, og gennemgå bugspytkirtlen i 30 minutter ved 20 milliliter i minuttet i opløsning fem ved fire grader Celsius.Ved afslutningen af opløsningen fem perfusion, perfem i bugspytkirtlen i otte timer ved 20 milliliter i minuttet i opløsning seks og fire grader Celsius, efterfulgt af en 96-timers vask i frisk opløsning fem ved 20 milliliter i minuttet og fire grader Celsius. Udskift vasken med 500 milliliter DPBS suppleret med calcium og magnesium i 30 minutter ved 37 grader Celsius, efterfulgt af perfusion med 250 milliliter opløsning syv i fire timer ved 20 milliliter i minuttet og 37 grader Celsius. Derefter vaskes orglet i yderligere 120 timer med frisk opløsning fem ved 20 milliliter i minuttet og fire grader Celsius, og opbevar orglet i opløsning otte.Her, brutto morfologi af en normal bugspytkirtel, som vises lys pink og indeholder milt, forbindelse, og duodenal lapper, kan observeres. Efter decellularisering, den lyserøde farve er tabt, og den forarbejdede bugspytkirtel vises bleg hvid i farven. I en normal bugspytkirtel, mange blå kerner er synlige ved H og E farvning, mens der i en decellulære bugspytkirtel kerner ikke længere kan visualiseres, bekræfter deres tab.Den isolerede intakte svinecelle bugspytkirtel, efter denne procedure, det vil give en komplet perfusion og vellykket decellularization samtidig bevare strukturen og også tillade nogle ekstracellulære matrix proteiner, der skal opnås. Den decellulariserede bugspytkirtel kan bruges til at udvikle hel-organ recellularization strategier i bioreaktor systemer med relevante celletyper. Efter recellularization med modtageren stamceller, væv manipuleret bugspytkirtlen kan anvendes til kliniske anvendelser og test af lægemidler.Glem ikke, at arbejde med Triton X-100 og SDC kan være yderst farligt, og at forholdsregler, såsom at bære handsker og forberede løsninger under røghætte, bør altid tages, mens du udfører denne procedure.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

Procedure for Decellularization af porcin Heart ved retrograd Coronarperfusionstrykket

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

En Decellularization metoden til udarbejdelse af en naturlig Acellular Intestinal Matrix

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

Human primat Lung Decellularization og Recellularization bruge en specialiseret Large-orgel bioreaktor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

Procedure for Decellularization af rottelevere i en oscillerende tryk Perfusion Device

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

Quantification of Strain in a Porcine Model of Skin Expansion Using Multi-View Stereo and Isogeometric Kinematics

Kvantificering af Strain i et porcint Model af hud Ekspansion Brug Multi-View Stereo og Isogeometric Kinematik

Tissue expansion is a popular technique in plastic and reconstructive surgery that grows skin in vivo for correction of large defects such as burns and ...

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

Høj opløsning 3D Imaging af menneskelige bugspytkirtlen Neuro-ø netværk

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological ...

Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

Sammenlignelige Decellularization af føtale og voksne hjerte væv Explants som 3D-lignende platforme til i Vitro undersøgelser

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

To metoder til Decellularization af plantevæv til Tissue Engineering applikationer

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Decellularization og Recellularization metode for menneskelige Saphenous vener

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and ...