Name: isolation and decellularization of a whole porcine pancreas
Uploaded: 2018-10-10T14:00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas at JoVE.com

Cette étude a été financée par une bourse de la Fondation Anna Lindh de LUA gouvernement suédois au s

La dissection d’un pancréas porcin et la procédure de DÉCELLULARISATION présentées ici suivez les directives éthiques de l’Université de Göteborg.
1. préparation de la mise en place de DÉCELLULARISATION
<ol><li>À l’aide de tubes de silicone de 3 x 5 mm, se raccordent en série le réservoir de détergent d’entrée de la pompe peristalic et ensuite du pancréas à l’orgue de chambre via le dégazeur (voir Figure 1). Connecter un luer mâle à l’extrémité libre du tube dans la chambre de l’orgue.</li>
	<li>À l’aide d’un autre tube de silicone de 3 x 5 mm, connectez la chambre d’orgue à la sortie de détergent contenant via la pompe péristaltique pour recueillir le détergent perfusé.</li>
	<li>Connecter une pipette de 2 ml sans étiquette aux extrémités libres des tubes d’aspiration détergent contenant et détergent sortie Container.</li>
	<li>Garder la configuration entière à 4 ° C.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58302/58302fig1v2.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;"> Figure 1 : préparation de la mise en place de perfusion. En utilisant un tube de silicone de 3 x 5 mm, comme indiqué dans la mise en place, se raccordent en série le réservoir de détergent d’entrée de la pompe péristaltique, le dégazeur et la chambre de l’orgue. Les flèches noires indiquent la direction du flux du conteneur d’aspiration détergent à chambre d’orgue. Pour la sortie de détergent, utilisez un autre tube de silicone de 3 x 5 mm et branchez l’orgue chambre via la pompe péristaltique au conteneur de détergent prise. Les flèches rouges indiquent le sens d’écoulement de l’alvéole de l’orgue au conteneur de détergent prise. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58302/58302fig1v2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
2. préparation des Solutions de DÉCELLULARISATION
<ol><li>Solution 1 (tampon phosphate salin [PBS]) : ajouter 8 g de chlorure de sodium (137 mM), 0,2 g de chlorure de potassium (2,7 mM), 1,44 g de phosphate de sodium (10 mM) et 0,24 g de phosphate de potassium (1,8 mM) à 1 L d’eau ultrapure et remuer jusqu'à dissolution. Ajuster le pH à 7,4 avec l’acide chlorhydrique (HCl). Au total, 3,2 L de cette solution est nécessaire.</li>
	<li>Solution 2 (PBS + héparine) : pour 1 L de Solution 1, ajouter 3,4 mL d’héparine (17 unités internationales [UI] / ml). Préparer cette solution fraîche et gardez-le sur la glace jusqu'à ce qu’elle devienne froide. Au total, 1,2 L de cette solution est nécessaire.</li>
	<li>Solution 3 (eau ultrapure, azoture de sodium + disodique acide éthylènediaminetétracétique [EDTA]) : pour 1 L d’eau ultrapure, ajouter 1,86 g d’EDTA (5 mM) et 200 mg d’azide de sodium (0,02 %). Remuer jusqu'à ce que les sels sont dissous. Refroidir la solution à 4 ° C avant utilisation. Au total, 22 L de cette solution est nécessaire.</li>
	<li>Solution 4 (PBS + azide de sodium, EDTA) : pour 1 L de Solution 1, ajouter 200 mg d’azide de sodium (0,02 %) et 1,86 g d’EDTA (5 mM). Remuer jusqu'à ce que les sels sont dissous. Refroidir la solution à 4 ° C avant utilisation. Au total, 1 L de cette solution est nécessaire.</li>
	<li>Solution 5 (eau ultrapure + azide de sodium) : À 1 L d’eau ultrapure, ajouter 200 mg d’azide de sodium (0,02 %). Remuer jusqu'à ce que les sels sont dissous. Refroidir la solution à 4 ° C avant utilisation. Au total, 260 L de cette solution est nécessaire. NOTE : EDTA forme un précipité avec la DDC et a été exclu de la Solution 5 car il sera utilisé pour un lavage immédiat avant et après le traitement de la DDC.</li>
	<li>Solution 6 (DDC + Triton X-100) : De 940 mL d’eau ultrapure, ajouter 40 g (4 %) DDC, 60 mL (6 %) X-100 Triton, 200 mg d’azide de sodium (0,02 %) et 69,6 mg de fluorure de phénylméthylsulfonyle (0,4 mM) (PMSF). Remuer jusqu'à dissolution. Refroidir la solution à 4 ° C avant utilisation. Ajouter PMSF avant utilisation. Au total, 9,6 L de cette solution est nécessaire.</li>
	<li>Solution 7 (DNase) : Unités ajouter 10 000 Kunitz de DNase-je dans 250 mL de PBS de Dulbecco (Kunitz 40 unités/mL) contenant de CaCl2 et MgCl2. Préparer fraîche et utiliser immédiatement. Chauffer la solution à 37 ° C avant utilisation.</li>
	<li>Solution 8 (PBS + sodium azide) : pour 1 L de Solution 1, ajouter 200 mg d’azide de sodium (0,02 %). Remuer jusqu'à ce que les sels sont dissous. Refroidir la solution à 4 ° C avant utilisation. Au total, 1 L de cette solution est nécessaire.</li>
</ol>3. dissection du pancréas porcin
Remarque : Dans cette étude, pancréas porcins ont été disséqués d’euthanasiés, cochons femelles hépariné (400 UI/kg), pesant 45 kg provenant d’une ferme.
<ol><li>Placez le cochon sur la table de dissection en décubitus dorsal.</li>
	<li>Faire une incision médiane du processus xiphoidal à l’os pubien (environ 40 cm) à l’aide d’un scalpel, exposer tous les organes abdominaux.</li>
	<li>Localiser le splénique duodénales et lobes de connexion.</li>
	<li>Repérer le niveau de la papille duodénale majeure et ligaturer le duodénum par voie orale à partir de ce site à l’aide de deux sutures séparés.</li>
	<li>Ligaturer l’oesophage inférieur avec deux sutures séparés et couper entre les ligatures avec des ciseaux pour sortir de l’estomac.</li>
	<li>Séparer le tissu conjonctif du colon pour atteindre l’intestin grêle.</li>
	<li>Séparer le tissu conjonctif du côlon qui s’attache au lobe splénique du pancréas.</li>
	<li>Enlever le côlon de l’intestin grêle après ligature des artères.</li>
	<li>Trouver la veine mésentérique inférieure et l’arbre de l’artère mésentérique inférieure et ligaturer avec une suture où ils apparaissent en direction caudale du pancréas.</li>
	<li>Ligaturer l’artère splénique et la veine avec une suture, près de la rate, dans le hile et couper dans la partie distale avec des ciseaux pour enlever la rate.</li>
	<li>Suivez le duodénum jusqu'à ce que les lobes duodénales et de connexion sont effacés et ligaturer le duodénum à la fin avec deux sutures séparés.</li>
	<li>Disséquer la veine porte, elle ligaturer avec une suture pour éviter toute fuite de sang par le foie et les couper dans la partie proximale à ligature. La veine porte sert une prise pendant la DÉCELLULARISATION.</li>
	<li>Disséquer et ligaturer le canal cholédoque et l’artère hépatique avec deux sutures. Couper dans la partie distale de sutures.</li>
	<li>Trouver l’aorte sous la veine rénale et il disséquer en direction crâniale du muscle et du tissu conjonctif, jusqu'à ce qu’il atteigne la région pancréatique.</li>
	<li>Retournez le pancréas doucement et disséquer l’aorte, conservant la SMA et le CT et couper l’aorte supérieur à CT et inférieur à SMA avec des ciseaux.</li>
	<li>Couper les autres tissus environnants avec des ciseaux et extraire le pancréas.</li>
	<li>À l’aide d’une seringue de 50 mL, reliée à l’artériotomie 4 mm canule, rincer l’organe par l’intermédiaire de l’aorte avec 2 Solution jusqu'à ce qu’il alimente l’organe entier ou jusqu'à ce que l’organe entier devient froid.</li>
</ol>4. préparation du pancréas porcin DÉCELLULARISATION
<ol><li>Gardez le pancréas à 4 ° C ou sur la glace tout au long du processus.</li>
	<li>Couper les sutures du duodénum à l’aide de ciseaux, nettoyez-le de nourriture par la chasse d’eau 50-150 mL d’eau ultrapure à l’aide d’une pipette 25 mL et ligaturer il nouveau avec des sutures.</li>
	<li>Ligaturer une extrémité de l’aorte et de toutes les directions sans compter que le SMA et le CT avec des sutures pour éviter les fuites.</li>
	<li>Insérez l’autre extrémité de l’aorte une canule artériotomie 4 mm et il ligaturer avec sutures.</li>
	<li>Perfuse le pancréas avec la Solution 3 pendant 1 h à 20 mL/min à l’aide de la mise en place de DÉCELLULARISATION. NOTE : Pré-remplir les tubes de pompe avec la solution 3 tels qu’aucune bulle d’entrer dans le pancréas. Rechercher les fuites de tous les côtés de l’orgue et ligaturer les branches vasculaires tous ouverts avec des sutures, sauf la veine porte.</li>
	<li>Congeler le pancréas à-20 ° C en Solution 4 jusqu’au début de la DÉCELLULARISATION.</li>
</ol>5. DÉCELLULARISATION du pancréas porcin
<ol><li>Décongeler le pancréas à 4 ° C.</li>
	<li>Faire fonctionner la pompe péristaltique dans la mise en place de DÉCELLULARISATION avec la Solution de 3 à 20 mL/min jusqu'à ce qu’aucune bulle d’air n’est visibles dans le tube d’aspiration de détergent.</li>
	<li>Placer le pancréas dans le récipient de DÉCELLULARISATION et connecter le tuyau d’aspiration de détergent à l’aorte du pancréas. Laver l’organe par une perfusion de Solution 3 nuit à 20 mL/min à 4 ° C.</li>
	<li>Versez la solution laissée dans la chambre de l’orgue.</li>
	<li>Remplacer la Solution 3 par 5 Solution et perfuse le pancréas pendant 30 min à 20 mL/min à 4 ° C. Versez la solution dans la chambre de l’orgue.</li>
	<li>Ajouter 6 Solution et perfuse le pancréas pendant 8 h à 20 mL/min à 4 ° C. Versez la solution dans la chambre de l’orgue.</li>
	<li>Laver l’organe par une perfusion de Solution 5 pendant 96 h à 20 mL/min à 4 ° C. Versez la solution dans la chambre de l’orgue.</li>
	<li>Préparer le pancréas pour le traitement de la DNase par recirculation 500 mL de PBS de Dulbecco contenant CaCl2 et MgCl2 pendant 30 min à 37 ° C. Versez la solution dans la chambre de l’orgue.</li>
	<li>Ajouter 250 mL de Solution 7 et perfuse le pancréas pendant 4 h à 20 mL/min à 37 ° C. Versez la solution dans la chambre de l’orgue.</li>
	<li>Laver l’organe par une perfusion de Solution 5 120 h à 20 mL/min à 4 ° C.</li>
	<li>Stocker l’orgue dans la Solution 8 à 4 ° C pendant de courtes périodes ou à-20 ° C pendant de longues périodes.</li>
</ol>6. vérification de DÉCELLULARISATION
<ol><li>À l’aide de ciseaux, couper les biopsies de 3 à 10 mm de tous les lobes du pancréas et fixez-les en formaldéhyde pendant 48 h à température ambiante.</li>
	<li>Laver les morceaux dans de l’eau ultrapure pendant 15 min, les traiter dans un traitement de tissus, suite de protocoles standard et les intégrer à la paraffine.</li>
	<li>Couper des sections de 5 µm en utilisant microtome et leur tache par hématoxyline et 0,2 % alcoolique éosine Meyer (HE) à la suite de protocoles standard.</li>
	<li>Visionner les diapositives sous un microscope optique pour vérifier la perte de noyaux. Remarque : Un morceau d’un tissu frais transformé de la même manière peut servir comme un contrôle pour vérifier la présence de noyaux.</li>
</ol>

<ol>
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S détient des parts dans Verigraft, une entreprise qui a obtenu une licence de la technologie de l’ingénierie tissulaire des vaisseaux sanguins. Les autres auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole proposé, à l’aide de perfusion de la DDC et le Triton X-100 à 4 ° C, sera decellularize pancréas entier porcin avec succès. Le défi dans cette technique est la dissection du pancréas intacte contenant tous les trois lobes sans endommager le parenchyme et ses navires d’approvisionnements, ainsi que la ligature des autres branches vasculaires de l’échantillon pour perfuse l’orgue sans fuite. Le pancréas de porc a une anatomie différente par rapport au pancréas humain. Il se compose de trois lobes et reste en contact étroit avec l’intestin grêle en l’entourant en partie. Nous avons disséqué le duodénum et le pancréas, comme plusieurs petits vaisseaux sanguins du pancréas connecter l’intestin. Au cours des études d’optimisation, coupe émoussé de ces vaisseaux sanguins a montré la fuite et une perfusion incomplète des solutions.
Étant donné que l’aorte se connecte au pancréas à travers les artères mésentériques supérieures et kashers, nous avons choisi l’aorte comme une admission de garder la perfusion simple en utilisant seulement une canule et, par conséquent, une entrée. Dans notre expérience, la ligature de l’aorte, au-dessus de la CT et en dessous le SMA va diminuer le temps de la dissection et réduit le risque d’endommager un des deux navires. Outre un cochon hépariné, on a également remarqué qu’une perfusion d’héparine froid via l’aorte juste après la dissection aide dans la réalisation de la perfusion de solutions tout au long de l’orgue. Nous pensons que si cela se produit en empêchant la formation de caillots sanguins dans les vaisseaux sanguins. La perfusion initiale d’un pancréas avec de l’eau ultrapure après dissection se lyser les globules rouges et enlever les restes de sang dans l’organe, empêchant ainsi la formation de caillots sanguins. Cette période peut également servir de trouver n’importe quel unligated petites branches des veines et des artères, la circulation sanguine peut être facilement observée au-dessus de l’arrière-plan.
Nous avons choisi de maintenir la procédure entière DÉCELLULARISATION à froid (4 ° C), car cela va entraver l’action des enzymes exocrines qui libèrent des cellules exocrines du pancréas. Les enzymes exocrines, ne pas d’inhibition, peuvent provoquer un effet délétère sur les cellules et l’ECM, car elles peuvent digérer des membranes cellulaires et protéines12. Gel et de dégel peuvent effectivement d’éclatement des cellules, nous avons inclus un temps de gel/dégel, initialement avant même que la perfusion des détergents4,13. Le lavage initial après décongélation va supprimer les restes de salves de la cellule. Le traitement au détergent, nous avons utilisé est un mélange de DDC et Triton X-100 à des concentrations anormalement élevées et à une vitesse de perfusion élevé. Nous avons choisi cette approche pour atteindre DÉCELLULARISATION plus rapidement en enlevant les cellules exocrines qui endommagent l’ECM. Nous croyons qu’un protocole stricte est bénéfique pour DÉCELLULARISATION de pancréas, que moins de temps sera disponible pour des enzymes pancréatiques interagir avec l’ECM, préservant ainsi les bonnes composantes d’ECM. Pour préserver les composants de l’ECM, nous avons également ajouté inhibiteur de protéase de sérine (PMSF) pour les solutions détergentes, car qui inhibent l’activation des enzymes libérés des cellules exocrines14. L’azoture de sodium est ajouté à toutes les solutions de DÉCELLULARISATION, car il agit comme agent bactériostatique, inhibant ainsi les risques de contamination bactérienne15.
Le pancréas DECELLULARISE suivant ce protocole a montré une préservation des structures de l’ECM et l’ECM protéines collagène et d’élastine. Cependant, une perte importante de glycosaminoglycanes a été remarquée dans le pancréas DECELLULARISE. DECELLULARISE de cette façon aussi prometteuses pour la fixation des cellules souches humaines du pancréas foetales et l’expression de marqueurs exocrines et endocrines en morceaux recellularized pour 14 jours12le pancréas. Cependant, pour générer un pancréas intact et fonctionnel, effectuer d’autres recherches pour évaluer les sources de cellules correct, types de cellules, stratégies d’ensemencement cellulaire et la culture de bioréacteur.

Diabète sucré se caractérise par la présence de l’augmentation des niveaux de glucose dans le sang. Elle est reconnue comme un défi majeur de santé publique dans la plupart pays1. Des niveaux élevés de glucose dans le sang affectent les vaisseaux sanguins et le système nerveux, causant des dommages aux yeux, cœur, reins, et ischémie périphérique. Les méthodes traditionnelles de traitement comprennent des injections d’insuline exogène, des médicaments et des changements de style de vie. Mettant de côté un remède contre la maladie, dans certains cas, les traitements disponibles ne parviennent pas à conserver l’insuline au niveau thérapeutique, ce qui entraîne une hyperglycémie. Bien que la transplantation d’îlots ou de pancréas entier élimine la maladie, il n’est pas souvent fait en raison d’une pénurie d’organes du donneur et les risques et les difficultés liées à l’immunosuppression et encapsulation2.
Améliorations actuelles dans le domaine des tissus ingénierie et la médecine régénérative possèdent la capacité de fournir une solution pour ces questions. Avec la technique de DÉCELLULARISATION, le matériel cellulaire provenant d’un donneur humain ou animal peut être retiré tout les protéines importantes de la matrice extracellulaire (MEC), facteurs de croissance, et molécules de signalisation sont préservés à l’échafaud. Ces échafaudages peuvent potentiellement être transplantées sans la nécessité d’une immunosuppression, afin de restaurer la fonction d’organe après recellularization avec des cellules souches non immunogènes3,4 propre du bénéficiaire. Les organes tissulaire de sources allogéniques ou xénogéniques peuvent être utilisés en transplantation clinique, comme les protéines de la matrice extracellulaire majeure sont conservées entre les espèces et ne peuvent pas être rejetées après transplantation5.
DÉCELLULARISATION est une méthode bien explorée impliquant l’utilisation optimale des forces physiques, chimiques détergents et enzymes dans un contexte physiologique pour enlever les cellules et les matières nucléaires d’un tissu ou un organe. Recellularization est une procédure d’ensemencement des cellules dans l’orgue acellulaire. Il s’agit d’une procédure intellectuellement difficile, nécessitant un grand nombre de cellules, une stratégie optimale d’ensemencement des cellules et un système de bioréacteur pour la culture de l’orgue de conditions physiologiquement acceptables comme la température, la pression et gaz6.
Le pancréas peut être considéré comme un stimulant tissulaire pour l’ingénierie tissulaire en raison de ses capacités exocrines et endocrines. Le tissu exocrine sécrète plusieurs enzymes digestives, tandis que la partie système endocrinienne sécrète des hormones, y compris l’insuline. La DÉCELLULARISATION de pancréas intactes de souris7,8, humain9et cochon10 a déjà été signalée à l’aide d’enzymes (trypsine, désoxyribonucléase [DNase]) et non ioniques (Triton X-100) et les détergents ioniques () désoxycholate de sodium [SDC] et dodécyl sulfate de sodium [SDS]). Cependant, à la suite les protocoles publiés, nous avons lutté avec une dissection réussie et DÉCELLULARISATION tout en conservant une structure ECM et perfusion complete. Nous avons supposé que les détergents appliqués pendant la DÉCELLULARISATION provoquent la lyse des cellules, libérant ainsi les enzymes digestives dans l’organe. Les enzymes libérées causera un dommage irréversible à l’échafaud de l’ECM et rendent inefficaces pour DÉCELLULARISATION et recellularization. Une conception de la méthode qui effectivement decellularizes pancréas tout en inhibant l’action des enzymes digestives peut résoudre le problème. Nous avons choisi la stratégie de Peloso et al., de DÉCELLULARISATION du pancréas à une température froide, même si elles n’a pas indiqué pourquoi la température froide est utilisé9. Dans le même temps, nous avons conçu une stratégie de dissection sous réserve de modifications de Taylor et coll. en choisissant l’aorte comme une admission de perfusion sur le tronc coeliaque (CT) et l' artère mésentérique supérieure (AMS)11.
Dans un article récemment publié12, nous démontrons une méthode d’isolation efficace et DÉCELLULARISATION de pancréas de porc tout en préservant certains composants ECM. Dans cet article, nous montrent une description détaillée de comment disséquer un pancréas entier porcin contenant splénique, duodénale et lobes de connexion et présenter un protocole progressif pour DÉCELLULARISATION réussie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
		<tbody>
		<tr >
			<td >4mm DLP arteriotomy cannula</td>
			<td >Medtronic</td>
			<td >31104</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2ml Unlabelled pipette</td>
			<td >vWR</td>
			<td >612-3720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Degasser</td>
			<td >Biotech AB</td>
			<td >0001-6484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase-I</td>
			<td >Worthington</td>
			<td >LS0020007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s PBS with CaCl2 and MgCl2</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td >AlfaAesar</td>
			<td >A15161.OB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heparin</td>
			<td >Leo</td>
			<td >387107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Luer Male with 1/8&#34; ID Barb</td>
			<td >Oina</td>
			<td >LM-2PP-QC</td>
			<td>For 3X5mm silicon tube</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Peristaltic pump</td>
			<td >Oina</td>
			<td >SP-1X4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PMSF</td>
			<td >Roche</td>
			<td >10837091001</td>
			<td>Unstable in aqueous solution. Should be added fresh before perfusion.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium chloride</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium hydrogen phosphate</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SDC</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silicon tube 3X5mm</td>
			<td >VWR</td>
			<td >2280706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Azide</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >71290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium chloride</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >13423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium hydrogen phosphate</td>
			<td >Merck</td>
			<td >71640-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Suture</td>
			<td >V&#246;mel</td>
			<td >14817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syrringe 50mL</td>
			<td >Becton Dickinson</td>
			<td >300137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton-X-100</td>
			<td >AlfaAesar</td>
			<td >A16046.OF</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and decellularization of a whole porcine pancreas

Génie tissulaire du pancréas entier peut améliorer les traitements actuels pour le diabète sucré. Le but ultime est de pancréas ingénieur de tissus provenant d’une source allogénique ou xénogénique avec des cellules humaines. Une démonstration de méthodes pour la dissection efficace et DÉCELLULARISATION recellularization du pancréas porcin peut-être bénéficier du champ. Semblable à pancréas humains, pancréas porcins ont un arrangement spécial anatomique avec trois lobes (splénique, duodénal et connexion) arrondies par le duodénum et l’intestin grêle. Le lobe duodénal du pancréas se connecte au duodénum par plusieurs petits vaisseaux sanguins. Génie tissulaire du pancréas est compliquée en raison de son caractère exocrine et endocrine. Dans cet article, nous montrons un protocole détaillé de disséquer le pancréas entier porcin et il decellularize avec des détergents tout en économisant de sa structure et certains composants de la matrice extracellulaire. Pour atteindre la perfusion complete, l’aorte est choisie comme d’entrée et de la veine porte comme exutoire. Les autres vaisseaux (artère hépatique, la veine splénique, artère splénique, arbre de l’artère et la veine mésentérique) et biliaires sont ligaturés. Pour éviter la formation de thrombus, le cochon est hépariné et, immédiatement après la dissection, l’orgue est rincé avec de l’héparine froid. Pour inhiber l’action des enzymes exocrines, la DÉCELLULARISATION de pancréas est fixée à 4 ° C. La DÉCELLULARISATION est interprétée par perfusion de X-100 Triton, désoxycholate de sodium et désoxyribonucléase, avec un un lavage intermittent et final. Avec une succès DÉCELLULARISATION, le pancréas apparaît en blanc, et une évaluation histologique à l’hématoxyline et éosine montre une absence de noyaux avec une structure préservée de la matrice extracellulaire. Ainsi, la méthode proposée peut servir à disséquer et decellularize pancréas entier porcin avec succès.

Photos de dissection de pancréas porcins représentant, qui peuvent aider à localiser et dissection de l’artère mésentérique inférieure et la veine arbre, la veine porte, l’artère hépatique, la voie biliaire et l’aorte ramification au CT et SMA, sont indiquées dans la Figure 2 a, 2 bet 2C (jaune flèches), respectivement. Figure 3 a montre la morphologie d’un pancréas normal, qui apparaît rose clair et contient splénique, connexion et lobes duodénales. Après DÉCELLULARISATION, la couleur rose est perdue et le pancréas DECELLULARISE semble blanc pâle en couleur. L’image de la morphologie générale montrant splénique, connexion et lobes duodénales d’un pancréas DECELLULARISE est montré dans la Figure 3 b. Figure 3 montre la présence de nombreux noyaux bleus dans un pancréas normal par coloration avec HE. Dans un pancréas DECELLULARISE, HE coloration ont montré une perte de noyaux, car aucun noyaux bleus ne sont considérés (Figure 3D).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58302/58302fig2v2.jpg"> Figure 2 : photos d’une dissection de pancréas porcins. (A) emplacement de l’arborescence mésentérique inférieure de l’artère et la veine (flèche jaune). (B) la ligature de la veine porte, de l’artère hépatique et de la voie biliaire (flèche jaune). (C) aorte de ramification du tronc coeliaque et l’artère mésentérique supérieure (flèche jaune). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58302/58302fig2v2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58302/58302fig3.jpg"> Figure 3 : brut morphologie et il a une coloration du pancréas normales et DECELLULARISE. Morphologie d’un pancréas normal (A). Morphologie d’un pancréas DECELLULARISE (B). (C) il a une coloration indique la présence de noyaux bleus dans un pancréas normal. Coloration (D) il montre l’absence de noyaux bleus dans un pancréas DECELLULARISE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58302/58302fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

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Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas

Génie tissulaire du pancréas entier est un défi en raison de ses fonctions exocrines et endocrines. Nous montrons une méthode pour la dissection d’un pancréas de porc intact et le processus de DÉCELLULARISATION réussie par perfusion de détergents Triton X-100, désoxycholate de sodium et désoxyribonucléase.

Isolement et DÉCELLULARISATION d’un pancréas entier porcin

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an ...

Cette méthode peut être utilisée pour la dissection du pancréas porcin contenant des lobes de connexion, duodénaux et spléniques et la décellularisation éventuelle par la perfusion de détergents à des températures froides. Bien que cette méthode de décellularisation donne un aperçu du pancréas porcin, elle peut également être appliquée au pancréas d’autres grands animaux. Le principal avantage de cette technique est qu’elle facilite la récupération intacte d’un organe compliqué, comme le pancréas, pour d’autres applications d’ingénierie tissulaire.Généralement, les individus nouveaux à cette méthode, ils lutteront parce que la dissection du pancréas intact tout en identifiant et en ligating tous les vaisseaux sanguins environnants exige beaucoup de pratique pour maîtriser. Avant de commencer la procédure, utilisez un tube de silicone de trois par cinq millimètres pour connecter le récipient de détergent à la pompe périssaltique et un deuxième tube de silicone de trois par cinq millimètres pour connecter la pompe périistaltique à la chambre d’organe par l’intermédiaire du dégasser. Connectez un Luer mâle à l’extrémité libre du deuxième tube, et utilisez un troisième tube de silicone de trois par cinq millimètres pour connecter la chambre d’organe au récipient de collecte de détergent par l’intermédiaire de la pompe péristaltique.Enfin, connectez une pipette non étiquetée de deux millimètres aux extrémités libres des tubes dans le récipient de détergent et le récipient de collecte de détergent. Ensuite, placez la configuration de décellularisation à quatre degrés Celsius. Pour récolter le pancréas, placez un porc femelle héparinisé de 45 kilogrammes sur une table de dissection en position de supination, et utilisez un scalpel pour faire une incision médiane de 40 centimètres du processus xiphoïde à l’os pubien pour exposer les organes abdominaux.Après avoir identifié les lobes spléniques, duodénaux et de connexion, localisez la papille duodénale majeure et utilisez deux sutures individuelles pour ligate oralement le duodénum du site. Ligate l’œsophage inférieur avec sutures supplémentaires, et couper entre les ligatures avec des ciseaux pour faciliter l’ablation de l’estomac. Séparez les tissus conjonctifs du côlon pour atteindre l’intestin grêle, et séparez le tissu conjonctif du côlon qui se fixe au lobe splénique du pancréas.Les intestins grêles sont fixés au pancréas par tissu conjonctif au lobe splénique, mais entourent également le pancréas. Vous devez suivre attentivement le chemin intestinal pour démêler et séparer le tissu conjonctif entre l’intestin et le pancréas. Après avoir ligating les artères, enlever le côlon de l’intestin grêle.Identifiez la veine mesenteric inférieure, l’arbre mésentérique inférieur d’artère, et ligate les vaisseaux avec un caudal de suture au pancréas et coupé avec des ciseaux. Ligate l’artère et la veine spléniques ensemble dans le hilum, près de la rate, et couper distally avec des ciseaux pour enlever la rate. Suivez le duodène jusqu’à ce que les lobes duodénaux et de connexion soient dégagés, et ligate le duodène à la fin avec deux sutures séparées.La partie du duodène qui est en contact étroit avec la connexion et les lobes duodénaux est enlevée avec le pancréas, car la ligature de tous les petits vaisseaux sanguins entre les deux organes est trop difficile. Après avoir disséqué la veine portail, ligate le vaisseau avec une suture pour prévenir toute fuite de sang du foie, et disséquer et ligate le canal biliaire et l’artère hépatique avec deux sutures. Puis, couper la veine portail, l’artère hépatique, et le canal biliaire avec des ciseaux.Localiser l’aorte sous la veine rénale, et disséquer l’aorte dans la direction crânienne du muscle et du tissu conjonctif jusqu’à ce que le vaisseau atteigne le pancréas. Maintenant, retournez doucement le pancréas, et disséquez l’aorte, gardant l’artère mésentérique supérieure et le tronc coeliaque intacts. Couper l’aorte crânienne au tronc coeliaque, et émousser disséquer le tissu environnant restant pour permettre la récolte du pancréas.Ensuite, utilisez une seringue de 50 millilitres reliée à une canule d’artériotomie de quatre millimètres pour rincer l’organe à travers l’aorte avec la solution deux jusqu’à ce que l’organe entier soit perfusé ou jusqu’à ce que tout l’organe refroidisse. Placez la solution deux pancréas perfusé sur un plateau métallique sur la glace, avec de l’aorte face vers le haut, et utilisez des ciseaux pour couper les sutures du dudénodum. Utilisez une pipette de 25 millilitres pour rincer le dudénodum avec 50 à 150 millilitres d’eau ultrapure, et religatez le tissu avec des sutures fraîches.Ligate une extrémité de l’aorte et toutes les branches, à l’exclusion de l’artère mésenterique supérieure et le tronc coeliaque, pour prévenir les fuites, et insérer une canule artériotomie de quatre millimètres dans l’autre extrémité de l’aorte. Ensuite, placez le pancréas dans la chambre d’organe, et connectez la canule dans le pancréas à un mâle Luer. Ensuite, infuser le pancréas avec la solution trois pendant une heure à 20 millilitres par minute, et congeler le pancréas à double perfusé à moins 20 degrés Celsius dans la solution quatre jusqu’au début de la décellularisation.Le jour du début de la décellularisation, décongeler le pancréas à quatre degrés Celsius et placer le pancréas décongelé dans la chambre de l’organe de décellularisation. Connectez le tube d’entrée de détergent à l’aorte du pancréas, et lavez le pancréas avec la solution trois à 20 millilitres par minute pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, décanter toute solution restant dans la chambre d’organe, et perfuser le pancréas pendant 30 minutes à 20 millilitres par minute dans la solution cinq à quatre degrés Celsius.À la fin de la solution cinq perfusion, parcourir le pancréas pendant huit heures à 20 millilitres par minute dans la solution six et quatre degrés Celsius, suivie d’un lavage de 96 heures dans la solution fraîche cinq à 20 millilitres par minute et quatre degrés Celsius. Remplacez le lavage par 500 millilitres de DPBS complétés par du calcium et du magnésium pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius, suivis de la perfusion avec 250 millilitres de solution sept pendant quatre heures à 20 millilitres par minute et 37 degrés Celsius. Ensuite, lavez l’organe encore 120 heures avec la solution fraîche cinq à 20 millilitres par minute et quatre degrés Celsius, et stockez l’organe dans la solution huit.Ici, la morphologie brute d’un pancréas normal, qui apparaît rose clair et contient des lobes spléniques, de connexion et duodénales, peut être observée. Après la décellularisation, la couleur rose est perdue, et le pancréas traité apparaît de couleur blanche pâle. Dans un pancréas normal, de nombreux noyaux bleus sont apparents par la coloration H et E, tandis que dans un pancréas décellulaire les noyaux ne peuvent plus être visualisés, confirmant leur perte.Le pancréas porcin intact isolé, suivant cette procédure, il permettra une perfusion complète et une décellularisation réussie tout en préservant la structure et en permettant également l’obtention de certaines protéines matricielles extracellulaires. Le pancréas décellulaire peut être utilisé pour développer des stratégies de recellularisation des organes entiers dans les systèmes bioréacteurs avec des types de cellules pertinents. Après la recellularisation avec les cellules souches bénéficiaires, le pancréas conçu par les tissus peut être utilisé pour des applications cliniques et des tests de dépistage de médicaments.N’oubliez pas que travailler avec Triton X-100 et DDC peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que le port de gants et la préparation des solutions sous le capot des fumées, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

Décellularisation et Recellularization des foies entiers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Recherche

Bio-ingénierie

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

Procédure de décellularisation de coeur de porc par perfusion coronaire rétrograde

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

Une méthodologie décellularisation pour la production d&#39;un naturel acellulaire intestinale Matrice

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

Procédure pour Décellularisation du Rat Livers dans une perfusion périphérique oscillant de pression

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

Quantification of Strain in a Porcine Model of Skin Expansion Using Multi-View Stereo and Isogeometric Kinematics

Quantification de la souche dans un modèle d&#39;extension Porcine de la peau Utilisation du Multi-View stéréo et isogéométrique Cinématique

Tissue expansion is a popular technique in plastic and reconstructive surgery that grows skin in vivo for correction of large defects such as burns and ...

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

Imagerie 3D à haute résolution du réseau Neuro-insulaire pancréas humain

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological ...

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Décellularisation comparable d’Explants de tissu cardiaque foetale et adulte en 3D-comme des plateformes pour les études In Vitro

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