Name: isolation and decellularization of a whole porcine pancreas
Uploaded: 2018-10-10T14:00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas at JoVE.com

Questo studio è stato finanziato da una sovvenzione dal governo svedese LUA ALF a S.S.H.

La dissezione di un pancreas suino e la procedura di decellularizzazione presentata qui seguire le linee guida etiche della Università di Göteborg.
1. preparazione dell'assetto decellularizzazione
<ol><li>Utilizzando tubi in silicone 3 x 5 mm, collegare in serie il contenitore di aspirazione detergente alla pompa peristalic e quindi al pancreas nell'organo da camera tramite Il degassificatore (Vedi Figura 1). Collegare un raccordo maschio luer all'estremità libera del tubo nella camera di organo.</li>
	<li>Utilizzando un altro tubo di silicone di 3 x 5 mm, collegare la camera di organo per il detersivo Saldi contenitore tramite la pompa peristaltica per raccogliere il detersivo irrorato.</li>
	<li>Collegare una pipetta senza etichetta di 2 ml per le estremità libere dei tubi di aspirazione detergente contenitore e detergente scarico container.</li>
	<li>Tenere l'intero set-up a 4 ° C.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58302/58302fig1v2.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;"> Figura 1: preparazione dell'assetto aspersione. Usando un tubo di silicone di 3 x 5 mm, come mostrato nel set-up, collegare in serie il contenitore di aspirazione detergente per la pompa peristaltica, il degasaggio e l'alloggiamento dell'organo. Le frecce nere indicano la direzione di flusso dal contenitore detergente ingresso alla camera di organo. Per la presa di detersivo, utilizzare un altro tubo di silicone di 3 x 5 mm e collegare l'organo da camera tramite la pompa peristaltica per il contenitore di detergente presa. Le frecce rosse indicano la direzione di flusso dalla camera di organo al contenitore detergente presa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58302/58302fig1v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
2. preparazione delle soluzioni di decellularizzazione
<ol><li>Soluzione 1 (tampone fosfato salino [PBS]): aggiungere 8 g di cloruro di sodio (137 mM), 0,2 g di cloruro di potassio (2,7 mM), 1,44 g di fosfato di sodio (10 mM) e 0,24 g di fosfato di potassio (1,8 mM) a 1 L di acqua ultrapura e mescolare fino a scioglimento. Regolare il pH a 7.4 con acido cloridrico (HCl). In totale, 3,2 L di questa soluzione è necessaria.</li>
	<li>Soluzione 2 (PBS + eparina): aggiungere ad 1 L di soluzione 1, 3,4 mL di eparina (17 unità internazionali [UI] / ml). Preparare questa soluzione fresca e tenerlo su ghiaccio fino a quando diventa freddo. In totale, 1,2 L di questa soluzione è necessaria.</li>
	<li>Soluzione 3 (acqua ultrapura + sodio azide + disodico acido etilendiamminotetracetico [ed]): A 1 L di acqua ultrapura, aggiungere 1,86 g di EDTA (5 mM) e 200 mg di sodio azide (0,02%). Mescolare fino a quando i sali disciolti. Raffreddare la soluzione a 4 ° C prima dell'uso. In totale, 22 L di questa soluzione è necessaria.</li>
	<li>Soluzione 4 (PBS + sodio azide + EDTA): A 1 L di soluzione 1, aggiungere 200 mg di sodio azide (0,02%) e 1,86 g (5 mm) EDTA. Mescolare fino a quando i sali disciolti. Raffreddare la soluzione a 4 ° C prima dell'uso. In totale, 1 L di questa soluzione è necessaria.</li>
	<li>Soluzione 5 (acqua ultrapura + sodio azide): A 1 L di acqua ultrapura, aggiungere 200 mg di sodio azide (0,02%). Mescolare fino a quando i sali disciolti. Raffreddare la soluzione a 4 ° C prima dell'uso. In totale, 260 L di questa soluzione è necessaria. Nota: EDTA forma un precipitato con DSC ed è stato escluso dalla soluzione 5 poiché verrà utilizzato per il lavaggio immediato prima e dopo il trattamento di DSC.</li>
	<li>Soluzione 6 (DSC + Triton X-100): A 940 mL di acqua ultrapura, aggiungere 40 g di (4%) DSC, 60 mL di (6%) Triton X-100, 200 mg di sodio azide (0,02%) e 69,6 mg di fluoruro di phenylmethylsulfonyl (0,4 mM) (PMSF). Mescolare fino a scioglimento. Raffreddare la soluzione a 4 ° C prima dell'uso. Aggiungere PMSF prima dell'uso. In totale, 9,6 L di questa soluzione è necessaria.</li>
	<li>Soluzione 7 (DNasi): Aggiungere 10.000 Kunitz unità di dnasi-ho in 250 mL di PBS di Dulbecco (Kunitz 40 unità/mL) contenente CaCl2 e MgCl2. Preparare fresco e utilizzare immediatamente. Riscaldare la soluzione a 37 ° C prima dell'uso.</li>
	<li>Soluzione 8 (PBS + sodio azide): A 1 L di soluzione 1, aggiungere 200 mg di sodio azide (0,02%). Mescolare fino a quando i sali disciolti. Raffreddare la soluzione a 4 ° C prima dell'uso. In totale, 1 L di questa soluzione è necessaria.</li>
</ol>3. dissezione del Pancreas suino
Nota: In questo studio, pancreas suino sono stati sezionati da eutanasia, peso 45 kg da una farm di suini di sesso femminile di eparinizzata (400 IU/kg).
<ol><li>Posto il maiale sulla tabella di dissezione in posizione supina.</li>
	<li>Fare un'incisione del midline dal processo xiphoidal all'osso pubico (circa 40cm) usando un bisturi, esponendo tutti gli organi addominali.</li>
	<li>Individuare la splenica, duodenale e lobi di connessione.</li>
	<li>Individuare il livello della papilla duodenale maggiore e legare il duodeno oralmente da quel sito utilizzando due distinti punti di sutura.</li>
	<li>Legare l'esofago inferiore con due distinti punti di sutura e tagliare tra le legature con le forbici per togliere lo stomaco.</li>
	<li>Separare il tessuto connettivo dal colon per raggiungere l'intestino tenue.</li>
	<li>Separare il tessuto connettivo del colon che si attacca al lobo splenico del pancreas.</li>
	<li>Rimuovere i due punti dal piccolo intestino dopo legatura delle arterie.</li>
	<li>Trovare l'albero di arteria mesenterica inferiore e la vena mesenterica inferiore e legare con una sutura dove appaiono caudale del pancreas.</li>
	<li>Legare l'arteria splenica e vena insieme con una sutura, vicino alla milza, nel hilum e distalmente tagliare con le forbici per rimuovere la milza.</li>
	<li>Seguire il duodeno fino a quando i lobi duodenali e connessione vengono cancellati e legare il duodeno alla fine con due distinti punti di sutura.</li>
	<li>Sezionare la vena portale, lega i con una sutura per prevenire eventuali perdite di sangue dal fegato e tagliare prossimalmente alla legatura. Vena portale serve come una presa di corrente durante il decellularizzati.</li>
	<li>Sezionare e legare il dotto biliare e dell'arteria epatica con due punti di sutura. Tagliare distalmente alla sutura.</li>
	<li>Trovare l'aorta sotto la vena renale e sezionarla in direzione craniale dal muscolo e del tessuto connettivo, fino a quando raggiunge la zona del pancreas.</li>
	<li>Capovolgere delicatamente il pancreas e sezionare l'aorta, mantiene intatti, la SMA e la CT e tagliare l'aorta superiore a CT ed inferiore a SMA con le forbici.</li>
	<li>Tagliare i rimanenti tessuti circostanti con le forbici ed estrarre il pancreas.</li>
	<li>Usando una siringa da 50 mL collegata alla cannula arteriotomia di 4 mm, filo l'organo attraverso l'aorta con soluzione 2 fino a quando non perfuses l'intero organo o fino a quando l'intero organo diventa freddo.</li>
</ol>4. preparazione del Pancreas suino decellularizzazione
<ol><li>Mantenere il pancreas a 4 ° C o sul ghiaccio durante tutto il processo.</li>
	<li>Tagliare le suture del duodeno usando le forbici, pulirlo di cibo da vampate di calore 50-150 mL di acqua ultrapura usando una pipetta 25 mL e legare esso nuovamente con punti di sutura.</li>
	<li>Legare un'estremità dell'aorta e tutte le filiali oltre alla SMA e CT con punti di sutura per evitare perdite.</li>
	<li>Inserire l'altra estremità dell'aorta una cannula di 4 mm arteriotomia e lega i con punti di sutura.</li>
	<li>Irrorare il pancreas con soluzione 3 per 1 h a 20 mL/min utilizzando il set-up di decellularizzazione. Nota: Prefill i tubi della pompa con soluzione 3, tale che nessun bolle immettere il pancreas. Cercare eventuali perdite da tutti i lati dell'organo e lega i rami vascolari tutti aperti con suture, ad eccezione della vena portale.</li>
	<li>Congelare il pancreas a-20 ° C in soluzione 4 fino all'inizio del decellularizzati.</li>
</ol>5. decellularizzazione del Pancreas suino
<ol><li>Scongelare il pancreas a 4 ° C.</li>
	<li>Eseguire la pompa peristaltica nella confi gurazione di decellularizzazione con soluzione 3 a 20 mL/min fino a quando non sono visti bolle d'aria nel tubo di aspirazione detergente.</li>
	<li>Posizionare il pancreas nel contenitore di decellularizzazione e collegare il tubo di aspirazione detergente all'aorta del pancreas. Lavare l'organo mediante perfusione con soluzione 3 pernottamento in 20 mL/min a 4 ° C.</li>
	<li>Versare la soluzione lasciato nella camera di organo.</li>
	<li>Sostituire la soluzione 3 con soluzione 5 e irrorare il pancreas per 30 min a 20 mL/min a 4 ° C. Versare la soluzione nella camera di organo.</li>
	<li>Aggiungere la soluzione 6 e irrorare il pancreas per 8 h a 20 mL/min a 4 ° C. Versare la soluzione nella camera di organo.</li>
	<li>Lavare l'organo mediante perfusione con soluzione 5 per 96 h a 20 mL/min a 4 ° C. Versare la soluzione nella camera di organo.</li>
	<li>Preparare il pancreas per il trattamento della dnasi di ricircolo 500 mL di PBS di Dulbecco contenente CaCl2 e MgCl2 per 30 min a 37 ° C. Versare la soluzione nella camera di organo.</li>
	<li>Aggiungere 250 mL di soluzione 7 e irrorare il pancreas per 4 h a 20 mL/min a 37 ° C. Versare la soluzione nella camera di organo.</li>
	<li>Lavare l'organo mediante perfusione con soluzione 5 per 120 h a 20 mL/min a 4 ° C.</li>
	<li>Conservare l'organo in soluzione 8 a 4 ° C per brevi periodi o a-20 ° C per lunghi periodi.</li>
</ol>6. Verifica di decellularizzazione
<ol><li>Utilizzando le forbici, tagliare le biopsie 3 - 10 mm da tutti i lobi del pancreas e fissarli in formaldeide per 48 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare i pezzi in acqua ultrapura per 15 min, elaborarli in un processatore di tessuti seguendo protocolli standard e incorporarli in paraffina.</li>
	<li>Tagliare sezioni da 5 µm utilizzando microtomo e li macchia di hematoxylin e 0,2% alcolica eosina Meyer (lui) seguendo protocolli standard.</li>
	<li>Mostra i vetrini al microscopio ottico per controllare la perdita dei nuclei. Nota: Un pezzo da un tessuto fresco trattato nello stesso modo può essere utilizzato come un controllo per verificare la presenza di nuclei.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yang, H. K., Yoon, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+encapsulated+islet+transplantation.">Current status of encapsulated islet transplantation.</a> Journal of Diabetes and its Complications. 29 (5), 737-743 (2015).</li><li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-organ+tissue+engineering:+Decellularization+and+recellularization+of+three-dimensional+matrix+scaffolds.">Whole-organ tissue engineering: Decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+metazoan+extracellular+matrix.">The evolution of metazoan extracellular matrix.</a> Journal of Cell Biology. 196 (6), 671-679 (2012).</li><li>Scarritt, M. E., Pashos, N. C., Bunnell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+cellularization+strategies+for+tissue+engineering+of+whole+organs.">A review of cellularization strategies for tissue engineering of whole organs.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnol. 3, 43 (2015).</li><li>Goh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+pancreas+as+a+natural+3D+scaffold+for+pancreatic+tissue+and+whole+organ+engineering.">Perfusion-decellularized pancreas as a natural 3D scaffold for pancreatic tissue and whole organ engineering.</a> Biomaterials. 34 (28), 6760-6772 (2013).</li><li>Wu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Culture+of+MIN-6+Cells+on+Decellularized+Pancreatic+Scaffold.">3D Culture of MIN-6 Cells on Decellularized Pancreatic Scaffold.</a> In Vitro and In Vivo Study. Biomed Research International. 2015, 432645 (2015).</li><li>Peloso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Pancreas+as+a+Source+of+Protolerogenic+Extracellular+Matrix+Scaffold+for+a+New-generation+Bioartificial+Endocrine+Pancreas.">The Human Pancreas as a Source of Protolerogenic Extracellular Matrix Scaffold for a New-generation Bioartificial Endocrine Pancreas.</a> Annals of Surgery. 264 (1), 169-179 (2016).</li><li>Mirmalek-Sani, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+pancreas+extracellular+matrix+as+a+platform+for+endocrine+pancreas+bioengineering.">Porcine pancreas extracellular matrix as a platform for endocrine pancreas bioengineering.</a> Biomaterials. 34 (22), 5488-5495 (2013).</li><li>Taylor, M. J., Baicu, S., Greene, E., Vazquez, A., Brassil, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+isolation+from+juvenile+porcine+pancreas+after+24-h+hypothermic+machine+perfusion+preservation.">Islet isolation from juvenile porcine pancreas after 24-h hypothermic machine perfusion preservation.</a> Cell Transplantation. 19 (5), 613-628 (2010).</li><li>Elebring, E., Kuna, V. K., Kvarnstrom, N., Sumitran-Holgersson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold-perfusion+decellularization+of+whole-organ+porcine+pancreas+supports+human+fetal+pancreatic+cell+attachment+and+expression+of+endocrine+and+exocrine+markers.">Cold-perfusion decellularization of whole-organ porcine pancreas supports human fetal pancreatic cell attachment and expression of endocrine and exocrine markers.</a> Journal of Tissue Engineering. 8, 2041731417738145 (2017).</li><li>Gilpin, A., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+Strategies+for+Regenerative+Medicine:+From+Processing+Techniques+to+Applications.">Decellularization Strategies for Regenerative Medicine: From Processing Techniques to Applications.</a> Biomed Research International. 2017, 9831534 (2017).</li><li>James, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+the+protease+inhibitor+phenylmethylsulfonyl+fluoride+in+buffers.">Inactivation of the protease inhibitor phenylmethylsulfonyl fluoride in buffers.</a> Analytical Biochemistry. 86 (2), 574-579 (1978).</li><li>Lichstein, H. C., Soule, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+the+Effect+of+Sodium+Azide+on+Microbic+Growth+and+Respiration:+I.+The+Action+of+Sodium+Azide+on+Microbic+Growth.">Studies of the Effect of Sodium Azide on Microbic Growth and Respiration: I. The Action of Sodium Azide on Microbic Growth.</a> Journal of Bacteriology. 47 (3), 221-230 (1944).</li></ol>

S.S.H. detiene partecipazioni in Verigraft, una società che ha concesso in licenza la tecnologia dell'ingegneria tissutale del vaso sanguigno. Gli altri autori non hanno nulla a rivelare.

Proposta di protocollo, tramite aspersione di DSC e Triton X-100 a 4 ° C, sarà decellularize pancreas suino intero con successo. La sfida in questa tecnica è la dissezione del pancreas intatto contenente tutti e tre i lobi senza danneggiare il parenchima e relativi vasi fornenti, come pure la legatura degli altri rami vascolari dell'esemplare per irrorare l'organo senza perdite. Il pancreas suino ha un'anatomia differente rispetto al pancreas umano. Esso è costituito da tre lobi e rimane in stretto contatto con l'intestino tenue di parzialmente che lo circonda. Abbiamo sezionato il duodeno insieme al pancreas, come molti piccoli vasi sanguigni dal pancreas collegare l'intestino. Durante gli studi di ottimizzazione, taglio smussato di questi vasi sanguigni ha mostrato perdite e un'incompleta perfusione delle soluzioni.
Poiché l'aorta si connette al pancreas attraverso le arterie mesenteriche celiachia e superiori, abbiamo scelto l'aorta come un'insenatura per mantenere la perfusione semplice utilizzando solo una cannula e, pertanto, un ingresso. Nella nostra esperienza, legatura della aorta sopra il CT e sotto la SMA diminuirà il tempo di dissezione e riduce il rischio di danneggiare qualsiasi delle due navi. Oltre a un maiale eparinizzato, abbiamo anche notato che un'aspersione di eparina freddo tramite l'aorta immediatamente dopo la dissezione aiuta a raggiungere una perfusione di soluzioni in tutto l'organo. Speculiamo che se ciò si verifica, impedendo la formazione di coaguli di sangue nei vasi sanguigni. La perfusione iniziale di un pancreas con acqua ultrapura dopo dissezione sarà lisare cellule rosse del sangue e rimuovere i resti di sangue nell'organo, impedendo così la formazione di coaguli di sangue. Questo periodo consente anche di trovare qualsiasi deossiHb piccoli rami di vene e arterie, come flusso sanguigno può essere facilmente notato sopra lo sfondo.
Abbiamo scelto di mantenere la procedura di decellularizzazione tutta a freddo (4 ° C), come questo ostacolerà l'azione degli enzimi exocrine che liberano dalle cellule exocrine del pancreas. Gli enzimi exocrine, quando non inibita, possono causare un effetto deleterio sulle cellule ed ECM, come sono in grado di digerire le membrane cellulari e proteine12. Come il congelamento e lo scongelamento possono scoppiare in modo efficace le cellule, abbiamo incluso un passaggio di gelo/disgelo, inizialmente anche prima la perfusione di detergenti4,13. Il lavaggio iniziale dopo lo scongelamento rimuoverà i resti della cella scoppia. Il trattamento detergente che abbiamo utilizzato è un mix di DSC e Triton X-100 alle concentrazioni insolitamente elevate e ad una velocità alta perfusione. Abbiamo scelto questo approccio per raggiungere più veloce decellularizzazione rimuovendo le cellule esocrine che danneggiano l'ECM. Speculiamo che un protocollo rigido e veloce è utile per decellularizzazione di pancreas, come meno tempo sarà disponibile per gli enzimi pancreatici interagire con la ECM, preservando in tal modo buoni componenti della ECM. Per mantenere i componenti della ECM, abbiamo anche aggiunto inibitore della serina proteasi (PMSF) per le soluzioni detergenti, che inibisce l'attivazione di enzimi rilasciati da cellule esocrine14. Azoturo di sodio viene aggiunto a tutte le soluzioni di decellularizzazione, in quanto agisce come un agente batteriostatico, quindi inibente la possibilità di contaminazione batterica15.
Il pancreas decellularized seguendo questo protocollo ha mostrato una conservazione di strutture di ECM e la ECM proteine collagene ed elastina. Tuttavia, una perdita significativa di glicosaminoglicani è stata notata nel pancreas decellularizzati. Il pancreas decellularized in questo modo inoltre ha mostrato la promessa per l'attaccamento di cellule staminali embrionali umane del pancreas e l'espressione di marcatori esocrini ed endocrini in pezzi recellularized per 14 giorni12. Tuttavia, per generare un pancreas intatto e funzionale, ulteriore ricerca è richiesta nella valutazione di fonti di cellule corrette, tipi di cellule, cellula semina strategie e cultura bioreattore.

Diabete mellito è caratterizzato dalla presenza di elevati livelli di glucosio nel sangue. È riconosciuto come una sfida importante di sanità pubblica nella maggior parte dei paesi1. Alti livelli di glucosio nel sangue influenzano i vasi sanguigni e il sistema nervoso, causando danni agli occhi, cuore, reni, e l'ischemia dell'arto. I metodi tradizionali di trattamento comprendono le iniezioni di insulina esogena, farmaci e cambiamenti di stile di vita. Mettendo da parte una cura per la malattia, in alcuni casi, disponibili trattamenti non riescono a mantenere l'insulina a livelli terapeutici, con conseguente iperglicemia. Sebbene il trapianto di isole o intero pancreas elimini la malattia, non è fatto comunemente a causa di una carenza di organi del donatore adatto e per i rischi e le difficoltà insite da immunosoppressione e incapsulamento2.
Correnti miglioramenti nel campo della medicina rigenerativa e ingegneria dei tessuti possiedono la capacità di fornire una soluzione per questi problemi. Con la tecnica di decellularizzazione, il materiale cellulare da un donatore umano o animale può essere rimosso mentre le proteine importanti della matrice extracellulare (ECM), fattori di crescita e molecole di segnalazione sono conservate nell'impalcatura. Tali impalcature possono potenzialmente essere trapiantate senza la necessità di immunosoppressione, per ripristinare la funzione di organo dopo ricellularizzazione con le cellule staminali non immunogenico3,4 del destinatario. Gli organi da trapianto allogeneic o xenogeniche fonti tessutale possono essere utilizzati nel trapianto clinico, come le proteine della matrice extracellulare principali sono conservate tra le specie e non potrebbero essere respinta dopo trapianto5.
Decellularizzazione è un metodo ben esplorato che coinvolgono l'uso ottima delle forze fisiche, detergenti chimici ed enzimi in un ambiente fisiologico per rimuovere le cellule e materiale nucleare da un tessuto o organo. Ricellularizzazione è una procedura di semina di cellule nuovamente dentro l'organo acellulare. È una procedura intellettualmente difficile, che richiedono un gran numero di cellule, una strategia ottimale di semina delle cellule e un sistema di bioreattore per la cultura dell'organo alle condizioni fisiologicamente accettabili come temperatura, pressione e gas6.
Il pancreas può essere considerato un tessuto impegnativo per l'ingegneria tissutale a causa della sua capacità esocrina ed endocrina. Il tessuto exocrine secerne enzimi digestivi diversi, mentre la parte endocrina secerne ormoni, compresa l'insulina. Il decellularizzazione di pancreas intatto da mouse7,8, umano9e maiale10 è già stato segnalato usando gli enzimi (tripsina, desossiribonucleasi [dnasi]) e non ionici (Triton X-100) e detergenti ionici ( sodio desossicolato [SDC] e solfato dodecilico di sodio [SDS]). Tuttavia, seguendo i protocolli pubblicati, abbiamo lottato con successo dissezione e completa perfusione e decellularizzati pur mantenendo una struttura di ECM. Abbiamo speculato che i detergenti applicati durante il decellularizzazione causano la lisi delle cellule, liberando gli enzimi digestivi nell'organo. Gli enzimi rilasciati causerà un danno irreversibile al patibolo ECM e renderlo inefficiente per decellularizzazione e ricellularizzazione. Un design del metodo che efficacemente decellularizes pancreas mentre inibendo l'azione degli enzimi digestivi può risolvere il problema. Abbiamo scelto la strategia di Peloso et al., di decellularizzazione del pancreas ad una temperatura fredda, anche se non hanno segnalato sul perché la temperatura fredda è usato9. Allo stesso tempo, abbiamo progettato una strategia di dissezione con modifiche da Taylor et al. , scegliendo l'aorta come un ingresso di aspersione sopra il tronco celiaco (CT) e l' arteria mesenterica superiore (SMA)11.
In un articolo recentemente pubblicato12, dimostriamo un metodo per l'isolamento efficace e decellularizzazione di pancreas suino preservando alcuni componenti della ECM. In questa carta, ci mostra una descrizione dettagliata di come sezionare un pancreas intero suino contenente splenici, duodenale e lobi di connessione e presentare un protocollo graduale per successo decellularizzati.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
		<tbody>
		<tr >
			<td >4mm DLP arteriotomy cannula</td>
			<td >Medtronic</td>
			<td >31104</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2ml Unlabelled pipette</td>
			<td >vWR</td>
			<td >612-3720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Degasser</td>
			<td >Biotech AB</td>
			<td >0001-6484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase-I</td>
			<td >Worthington</td>
			<td >LS0020007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s PBS with CaCl2 and MgCl2</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td >AlfaAesar</td>
			<td >A15161.OB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heparin</td>
			<td >Leo</td>
			<td >387107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Luer Male with 1/8&#34; ID Barb</td>
			<td >Oina</td>
			<td >LM-2PP-QC</td>
			<td>For 3X5mm silicon tube</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Peristaltic pump</td>
			<td >Oina</td>
			<td >SP-1X4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PMSF</td>
			<td >Roche</td>
			<td >10837091001</td>
			<td>Unstable in aqueous solution. Should be added fresh before perfusion.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium chloride</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium hydrogen phosphate</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SDC</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silicon tube 3X5mm</td>
			<td >VWR</td>
			<td >2280706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Azide</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >71290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium chloride</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >13423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium hydrogen phosphate</td>
			<td >Merck</td>
			<td >71640-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Suture</td>
			<td >V&#246;mel</td>
			<td >14817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syrringe 50mL</td>
			<td >Becton Dickinson</td>
			<td >300137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton-X-100</td>
			<td >AlfaAesar</td>
			<td >A16046.OF</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and decellularization of a whole porcine pancreas

Ingegneria tissutale di intero pancreas può migliorare i trattamenti correnti per il diabete mellito. L'obiettivo finale è quello di pancreas di ingegnere di tessuto da un'origine allogenica o xenogeniche con le cellule umane. Una dimostrazione dei metodi per la dissezione efficiente, decellularizzazione e ricellularizzazione del pancreas suino potrebbe beneficiare il campo. Simile al pancreas umano, pancreas suino hanno uno speciale ordinamento anatomico con tre lobi (splenici, duodenale e connessione) arrotondato dal duodeno e intestino tenue. Il lobo duodenale del pancreas si connette al duodeno diversi piccoli vasi sanguigni. Ingegneria dei tessuti del pancreas è complicato a causa della sua natura esocrina ed endocrina. In questa carta, indichiamo un protocollo dettagliato per sezionare il pancreas suino intero e si decellularize con detergenti, risparmiando la sua struttura e alcune componenti della matrice extracellulare. Per ottenere la completa perfusione, l'aorta viene scelto come ingresso e la vena portale come sbocco. Altri vasi sanguigni (arteria epatica, della vena splenica, arteria splenica, albero dell'arteria e della vena mesenterica) e dei dotti biliari sono legati. Per evitare la formazione di trombi, il maiale è eparinizzato e, immediatamente dopo la dissezione, l'organo è lavato con eparina freddo. Per inibire l'azione di enzimi esocrini, decellularizzazione il pancreas è impostato a 4 ° C. Il decellularizzazione viene eseguita tramite aspersione di Triton X-100, sodio desossicolato e desossiribonucleasi, con un lavaggio esteso intermittente e finale. Con un successo decellularizzazione, pancreas appare bianco, e una valutazione istologica con ematossilina ed eosina Mostra un'assenza dei nuclei con una struttura di matrice extracellulare conservata. Così, il metodo proposto può essere utilizzato per sezionare e decellularize pancreas suino intero con successo.

Immagini di dissezione pancreas suino rappresentativo, che possono aiutare nell'individuazione e nella dissezione dell'arteria mesenterica inferiore e vena albero, vena portale, l'arteria epatica, dotto biliare e l'aorta diramazione a CT e SMA, sono mostrate in Figura 2A, 2Be 2C (giallo frecce), rispettivamente. Figura 3A Mostra la morfologia lorda di un pancreas normale, che appare rosa chiaro e contiene splenica, connessione e lobi duodenali. Dopo decellularizzazione, il colore rosa è perso e pancreas decellularizzati sembra bianco pallido a colori. L'immagine di morfologia lordo risultati splenica, connessione e duodenali lobi di un pancreas decellularizzato è mostrato in Figura 3B. Figura 3 Mostra la presenza di molti nuclei blu in un pancreas normale macchiando con lui. In un pancreas decellularizzato, HE colorazione ha mostrato una perdita dei nuclei, come nessun nuclei blu sono veduti (Figura 3D).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58302/58302fig2v2.jpg"> Figura 2: immagini di una dissezione del pancreas suino. (A) posizione dell'inferiore albero di arteria e vena mesenterica (freccia gialla). (B) la legatura della vena portale, l'arteria epatica e del dotto biliare (freccia gialla). (C) Aorta ramificazione per il tronco celiaco e dell'arteria mesenterica superiore (freccia gialla). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58302/58302fig2v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58302/58302fig3.jpg"> Figura 3: lordo morfologia e lui la macchiatura del pancreas normale e decellularizzati. (A) lordo morfologia di un pancreas normale. (B) lordo morfologia di un pancreas decellularizzato. Colorazione (C), egli mostra la presenza di nuclei blu in un pancreas normale. Colorazione (D), ha illustrato l'assenza dei nuclei blu in un pancreas decellularizzato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58302/58302fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas

Ingegneria tissutale di intero pancreas è una sfida a causa delle sue funzioni esocrine ed endocrine. Vi mostriamo un metodo per la dissezione di un pancreas suino intatto e il processo di decellularizzazione successo tramite aspersione di detergenti Triton X-100, sodio desossicolato e desossiribonucleasi.

Isolamento e decellularizzazione di un Pancreas suino intero

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an ...

Questo metodo può essere utilizzato per la dissezione del pancreas suino contenente connessione, lobi duodenali e splenici ed eventuale decellularizzazione attraverso la perfusione di detergenti a temperature fredde. Sebbene questo metodo di decellularizzazione fornisca informazioni sul pancreas suino, può anche essere applicato alla pancreata di altri grandi animali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che facilita il recupero intatto di un organo complicato, come il pancreas, per ulteriori applicazioni di ingegneria tissutale.Generalmente, individui nuovi a questo metodo, faranno fatica perché la dissezione del pancreas intatto mentre identifica e lega tutti i vasi sanguigni circostanti richiede molta pratica da padroneggiare. Prima di iniziare la procedura, utilizzare un tubo di silicone di tre per cinque millimetri per collegare il contenitore del detergente alla pompa peristaltica e un secondo tubo in silicone da tre per cinque millimetri per collegare la pompa peristaltica alla camera d'organo tramite il degassatore. Collegare un Luer maschio all'estremità libera del secondo tubo e utilizzare un terzo tubo di silicone di tre per cinque millimetri per collegare la camera d'organo al contenitore di raccolta dei detergenti tramite la pompa peristaltica.Infine, collegare una pipetta senza etichetta di due millimetri alle estremità libere dei tubi nel contenitore del detergente e nel contenitore di raccolta dei detergenti. Quindi, posizionare la configurazione di decellularizzazione a quattro gradi Celsius. Per raccogliere il pancreas, posizionare un maiale femmina eparinizzato di 45 chilogrammi su una tabella di dissezione in posizione supina e utilizzare un bisturi per fare un'incisione della linea mediana di 40 centimetri dal processo xifoide all'osso pubico per esporre gli organi addominali.Dopo aver identificato i lobi splenici, duodenali e di connessione, individuare la papilla duodenale maggiore e usare due suture individuali per ligare oralmente il duodeno dal sito. Legare l'esofago inferiore con suture aggiuntive e tagliare tra le legature con forbici per facilitare la rimozione dello stomaco. Separare i tessuti connettivi dal colon per raggiungere l'intestino tenue e separare il tessuto connettivo del colon che si attacca al lobo splenico del pancreas.L'intestino tenue è attaccato al pancreas dal tessuto connettivo al lobo splenico, ma circonda anche il pancreas. Devi seguire attentamente il percorso intestinale per districare e separare il tessuto connettivo tra l'intestino e il pancreas. Dopo aver legato le arterie, rimuovere il colon dall'intestino tenue.Identificare la vena mesenterica inferiore, l'arteria mesenterica inferiore e ligarare i vasi con una sutura caudale al pancreas e tagliare con le forbici. Ligate l'arteria splenica e la vena insieme nell'ilum, vicino alla milza, e tagliare disstogli con le forbici per rimuovere la milza. Seguire il duodeno fino a quando i lobi duodenali e di connessione non vengono cancellati e ligare il duodeno alla fine con due suture separate.La parte di duodeno che è a stretto contatto con la connessione e i lobi duodenali viene rimossa con il pancreas, poiché la legatura di tutti i piccoli vasi sanguigni tra i due organi è troppo difficile. Dopo aver sezionato la vena portale, legare il vaso con una sutura per evitare perdite di sangue dal fegato e sezionare e legare il condotto biliare e l'arteria epatica con due suture. Quindi, tagliare la vena portale, l'arteria epatica e il condotto biliare con le forbici.Individuare l'aorta sotto la vena renale e sezionare l'aorta nella direzione cranica dal muscolo e dal tessuto connettivo fino a quando il vaso raggiunge il pancreas. Ora, capovolgere delicatamente il pancreas e sezionare l'aorta, mantenendo intatti l'arteria mesenterica superiore e il tronco celiaco. Tagliare l'aorta cranial al tronco celiaco e sezionare smussato il tessuto circostante rimanente per consentire la raccolta del pancreas.Quindi, utilizzare una siringa da 50 millilitri collegata a una cannula di arteriotomia di quattro millimetri per sciacquare l'organo attraverso l'aorta con la soluzione due fino a quando l'intero organo non viene perfuso o fino a quando l'intero organo diventa freddo. Posizionare la soluzione due pancreas perfuso su un vassoio metallico sul ghiaccio, con aorta rivolta verso l'alto, e utilizzare le forbici per tagliare le suture dal duodeno. Utilizzare una pipetta da 25 millilitri per lavare il duodeno con da 50 a 150 millilitri di acqua ultrapura e riligare il tessuto con suture fresche.Ligate un'estremità dell'aorta e tutti i rami, esclusa l'arteria mesenterica superiore e il tronco celiaco, per evitare perdite, e inserire una cannula di arteriotomia di quattro millimetri nell'altra estremità dell'aorta. Quindi, posizionare il pancreas nella camera dell'organo e collegare la cannula nel pancreas a un Luer maschio. Quindi, perfondere il pancreas con la soluzione tre per un'ora a 20 millilitri al minuto e congelare il pancreas doppio perfuso a meno 20 gradi Celsius nella soluzione quattro fino all'inizio della decellularizzazione.Il giorno dell'inizio della decellularizzazione, scongelare il pancreas a quattro gradi Celsius e posizionare il pancreas scongelato nella camera dell'organo di decellularizzazione. Collegare il tubo di ingresso del detergente all'aorta del pancreas e lavare il pancreas con la soluzione tre a 20 millilitri al minuto durante la notte a quattro gradi Celsius. La mattina seguente, decantare qualsiasi soluzione rimasta nella camera d'organo e perfondere il pancreas per 30 minuti a 20 millilitri al minuto in soluzione cinque a quattro gradi Celsius.Alla fine della soluzione cinque perfusioni, perfondere il pancreas per otto ore a 20 millilitri al minuto in soluzione sei e quattro gradi Celsius, seguito da un lavaggio di 96 ore in soluzione fresca cinque a 20 millilitri al minuto e quattro gradi Celsius. Sostituire il lavaggio con 500 millilitri di DPBS integrati con calcio e magnesio per 30 minuti a 37 gradi Celsius, seguito da perfusione con 250 millilitri di soluzione sette per quattro ore a 20 millilitri al minuto e 37 gradi Celsius. Quindi, lavare l'organo per altre 120 ore con soluzione fresca cinque a 20 millilitri al minuto e quattro gradi Celsius e conservare l'organo nella soluzione otto.Qui, si può osservare la morfologia grossolana di un pancreas normale, che appare rosa chiaro e contiene lobi splenici, di connessione e duodenali. Dopo la decellularizzazione, il colore rosa viene perso e il pancreas elaborato appare di colore bianco pallido. In un pancreas normale, molti nuclei blu sono evidenti dalla colorazione H ed E, mentre in un pancreas decellularizzato i nuclei non possono più essere visualizzati, confermando la loro perdita.Il pancreas suino intatto isolato, seguendo questa procedura, consentirà una perfusione completa e una decellularizzazione riuscita preservando la struttura e consentendo anche di ottenere alcune proteine della matrice extracellulare. Il pancreas decellularizzato può essere utilizzato per sviluppare strategie di ricellularizzazione di organi interi in sistemi bioreattori con tipi di cellule pertinenti. Dopo la ricellularizzazione con cellule staminali ricevente, il pancreas ingegnerizzato dai tessuti può essere utilizzato per applicazioni cliniche e test farmacologici.Non dimenticare che lavorare con Triton X-100 e SDC può essere estremamente pericoloso e che le precauzioni, come indossare guanti e preparare le soluzioni sotto il cofano dei fumi, dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Ricerca

Bioingegneria

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

Procedura per decellularizzazione del Cuore di suino da retrograda perfusione coronarica

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

Un Decellularization Metodologia per la produzione di un naturale acellulare intestinale Matrix

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Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

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La quantificazione di Strain in un modello suino di espansione pelle con Multi-View stereo e isogeometrica Cinematica

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