Name: isolation and decellularization of a whole porcine pancreas
Uploaded: 2018-10-10T14:00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas at JoVE.com

Denne studien ble finansiert av en bevilgning fra den svenske regjeringen LUA ALF til S.S.H.

Disseksjon av et svin bukspyttkjertel og decellularization prosedyren presenteres her følger etiske retningslinjer Universitetet i Gøteborg.
1. forberedelse av Decellularization-oppsett
<ol><li>Bruk 3 x 5 mm silikon rør, koble i serien beholderen vaskemiddel innløpet til peristalic pumpen og deretter å bukspyttkjertelen i organ kammer via degasser (se figur 1). Koble en mannlig luer til gratis slutten av rør i orgel kammer.</li>
	<li>Bruker en annen 3 x 5 mm silisium rør, koble orgel kammeret til den vaskemiddel stikkontakt beholder via peristaltiske pumpen å samle perfused vaskemiddel.</li>
	<li>Koble en 2 ml umerkede pipette til de ledige endene på rør i vaskemiddel innløp container og vaskemiddel stikkontakt cointainer.</li>
	<li>Holde hele oppsettet på 4 ° C.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58302/58302fig1v2.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;"> Figur 1: Forberedelse av perfusjon opplegget. Bruker en 3 x 5 mm silikon tube, som vist i oppsettet, koble i serien beholderen vaskemiddel innløpet til peristaltiske pumpen, degasser og orgel kammeret. Svarte pilene viser flytretningen fra vaskemiddel innløp beholder til orgel kammer. For vaskemiddel uttaket, bruke en annen 3 x 5 mm silikon rør og koble den orgel kammer via peristaltiske pumpen til beholderen vaskemiddel stikkontakt. Den røde piler vise flytretningen fra orgel kammer til vaskemiddel stikkontakt beholder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58302/58302fig1v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
2. forberedelse av Decellularization løsninger
<ol><li>Løsning 1 (fosfat-bufret saline [PBS]): legge til 8 g (137 mM) natriumklorid, 0.2 g (2,7 mM) kalium klorid, 1,44 g (10 mM) natrium fosfat og 0,24 g (1,8 mM) kalium fosfat 1 L ultrapure vann og rør til oppløst. Justere pH 7,4 med saltsyre (HCl). Totalt er 3,2 L denne løsningen nødvendig.</li>
	<li>Løsning 2 (PBS + heparin): 1 L løsning 1, legge til 3,4 mL av heparin (17 internasjonale enheter [IU] /mL). Forberede denne løsning frisk og holde det på is til det blir kaldt. Totalt er 1,2 L denne løsningen nødvendig.</li>
	<li>Løsning 3 (ultrapure vann + Natriumazid + disodium ethylenediaminetetraacetic syre [EDTA]): 1 L ultrapure vann, legge 1,86 g av EDTA (5 mM) og 200 mg (0,02%) Natriumazid. Rør til oppløst salter. Cool løsningen på 4 ° C før bruk. Totalt er 22 L denne løsningen nødvendig.</li>
	<li>Løsning 4 (PBS + Natriumazid + EDTA): 1 L løsning 1, legge til 200 mg (0,02%) Natriumazid og 1,86 g (5 mM) EDTA. Rør til oppløst salter. Cool løsningen på 4 ° C før bruk. Totalt er 1 L denne løsningen nødvendig.</li>
	<li>Løsning 5 (ultrapure vann + Natriumazid): 1 L ultrapure vann, legge til 200 mg (0,02%) Natriumazid. Rør til oppløst salter. Cool løsningen på 4 ° C før bruk. Totalt er 260 L denne løsningen nødvendig. Merk: EDTA danner en utløse med SDC og ble ekskludert fra løsning 5 siden det vil bli brukt for umiddelbar vask før og etter SDC behandling.</li>
	<li>Løsning 6 (SDC + Triton X-100): Til 940 mL ultrapure vann, legger 40 g (4%) SDC, 60 mL (6%) Triton X-100, 200 mg (0,02%) Natriumazid og 69,6 mg (0.4 mM) phenylmethylsulfonyl fluor (PMSF). Rør helt oppløst. Cool løsningen på 4 ° C før bruk. Legg til PMSF før bruk. Totalt er 9,6 L denne løsningen nødvendig.</li>
	<li>Løsning 7 (DNase): Legge til 10.000 Kunitz enheter av DNase-I 250 mL (40 Kunitz enheter/mL) Dulbecco's PBS inneholder CaCl2 og MgCl2. Forberede frisk og bruke umiddelbart. Varm løsningen på 37 ° C før bruk.</li>
	<li>Løsning 8 (PBS + natrium azide): 1 L løsning 1, legge til 200 mg (0,02%) Natriumazid. Rør til oppløst salter. Cool løsningen på 4 ° C før bruk. Totalt er 1 L denne løsningen nødvendig.</li>
</ol>3. Disseksjon av svin bukspyttkjertelen
Merk: I denne studien svin pancreases ble dissekert fra euthanized, heparinized (400 IU/kg) kvinnelige griser veier 45 kg fra en gård.
<ol><li>Plass grisen på tabellen disseksjon i supine posisjon.</li>
	<li>Gjøre en midtlinjen snitt fra xiphoidal prosessen til skambenet (ca. 40 cm) ved hjelp av en skalpell, utsette alle abdominal organer.</li>
	<li>Finn den splenic, duodenalsår, og tilkoblingen lobes.</li>
	<li>Finn nivået av store duodenalsår papilla og ligate tolvfingertarmen muntlig fra det stedet benytter to separate suturer.</li>
	<li>Ligate underlegne spiserøret med to separate suturer og kutt mellom ligaturer med saks å ta magen ut.</li>
	<li>Skille connective vev fra kolon nå tynntarmen.</li>
	<li>Skille bindevevet i tykktarmen som festes til den splenic flik av bukspyttkjertelen.</li>
	<li>Fjerne tykktarmen fra tynntarm etter ligating arteriene.</li>
	<li>Finn dårligere hvem venen og mindreverdig hvem arterien treet og ligate med én Sutur hvor de vises caudally i bukspyttkjertelen.</li>
	<li>Ligate splenic arterien og vene med en Sutur, nær milten, i hilum, og kutte distally med saks fjerne milten.</li>
	<li>Følg tolvfingertarmen til duodenalsår og tilkobling lobes tømmes og ligate tolvfingertarmen nederst med to separate suturer.</li>
	<li>Analysere portalen blodåre, ligate det med en Sutur å hindre eventuell blod lekkasje fra leveren og kutte proximally til ligatur. Portalen blodåre fungerer som en stikkontakt i løpet av decellularization.</li>
	<li>Analysere og ligate av galle duct og hepatic arterie med to suturer. Kutte distally til suturer.</li>
	<li>Finn aorta under nyre venen og dissekere den i skallen retning fra muskler og bindevev før den når bukspyttkjertelen området.</li>
	<li>Snu bukspyttkjertelen forsiktig og dissekere aorta, holde SMA og CT intakt, og kutte aorta overlegen til CT og mindreverdig til SMA med saks.</li>
	<li>Skjær resten av omkringliggende vev med saks og benytt bukspyttkjertelen.</li>
	<li>50 mL sprøyte er koblet til 4 mm arteriotomy kanyle, flush organ gjennom aorta med løsning 2 til det perfuses hele orgel eller til hele organ blir kald.</li>
</ol>4. forberedelse av svin bukspyttkjertelen til Decellularization
<ol><li>Holde bukspyttkjertelen 4 ° C eller is gjennom hele prosessen.</li>
	<li>Klippe bildet av tolvfingertarmen med saks, rengjøre den mat ved flushing 50-150 mL ultrapure vann med en 25-mL pipette, og ligate det igjen med suturer.</li>
	<li>Ligate ene enden av aorta og alle grenene i tillegg til SMA og CT med suturer å hindre lekkasje.</li>
	<li>Sett inn fra den andre enden av aorta en 4 mm arteriotomy kanyle og ligate det med suturer.</li>
	<li>Perfuse bukspyttkjertelen med løsning 3 1t på 20 mL/min bruker decellularization oppsett. Merk: Prefill rørene av pumpen med løsning 3 slik at ingen bobler angi bukspyttkjertelen. Se etter eventuelle lekkasjer fra alle sider av orgel og ligate alle åpne vaskulær grener med bildet, unntatt portalen blodåre.</li>
	<li>Fryse bukspyttkjertelen på 20 ° C i løsning 4 til starten av decellularization.</li>
</ol>5. decellularization av svin bukspyttkjertelen
<ol><li>Tine bukspyttkjertelen på 4 ° C.</li>
	<li>Løpe peristaltiske pumpen i decellularization oppsettet med løsning 3 på 20 mL/min til ingen luftbobler er sett i vaskemiddel innløp røret.</li>
	<li>Plasser bukspyttkjertelen i beholderen decellularization og koble vaskemiddel innløp røret til aorta i bukspyttkjertelen. Vask organ av perfusjon med løsning 3 overnatting på 20 mL/min på 4 ° C.</li>
	<li>Hell løsningen i orgel kammeret.</li>
	<li>Erstatt løsning 3 med løsning 5 og perfuse bukspyttkjertelen i 30 min på 20 mL/min på 4 ° C. Hell ut løsningen i orgel kammeret.</li>
	<li>Legg løsning 6 og perfuse bukspyttkjertelen 8 h på 20 mL/min på 4 ° C. Hell ut løsningen i orgel kammeret.</li>
	<li>Vask organ av perfusjon med løsning 5 96 h på 20 mL/min på 4 ° C. Hell ut løsningen i orgel kammeret.</li>
	<li>Forberede bukspyttkjertelen DNase behandling ved resirkulering 500 mL Dulbecco's PBS inneholder CaCl2 og MgCl2 i 30 min på 37 ° C. Hell ut løsningen i orgel kammeret.</li>
	<li>Legge til 250 mL løsning 7 og perfuse bukspyttkjertelen 4 h på 20 mL/min på 37 ° C. Hell ut løsningen i orgel kammeret.</li>
	<li>Vask organ av perfusjon med løsning 5 120 h på 20 mL/min på 4 ° C.</li>
	<li>Lagre orgelet i løsningen 8 på 4 ° C i korte tidsperioder eller på 20 ° C i lange perioder.</li>
</ol>6. bekreftelse av Decellularization
<ol><li>Med saks, klipp 3 til 10 mm biopsier fra alle lobes av bukspyttkjertelen og løse dem i formaldehyd 48 h ved romtemperatur.</li>
	<li>Vask bitene i ultrapure vann i 15 min, behandle dem i en vevsprosessor etter standardprotokoller og bygge dem inn i parafin.</li>
	<li>Skjær 5 µm inndelinger ved hjelp av mikrotomen og stain dem av Meyers hematoxylin og 0,2% alkoholholdig eosin (han) etter standardprotokoller.</li>
	<li>Vis lysbildene under en lys mikroskop etter tapet av kjerner. Merk: Et stykke fra en ferskt vev behandlet på samme måte kan brukes som en kontroll etter tilstedeværelsen av kjerner.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yang, H. K., Yoon, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+encapsulated+islet+transplantation.">Current status of encapsulated islet transplantation.</a> Journal of Diabetes and its Complications. 29 (5), 737-743 (2015).</li><li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-organ+tissue+engineering:+Decellularization+and+recellularization+of+three-dimensional+matrix+scaffolds.">Whole-organ tissue engineering: Decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+metazoan+extracellular+matrix.">The evolution of metazoan extracellular matrix.</a> Journal of Cell Biology. 196 (6), 671-679 (2012).</li><li>Scarritt, M. E., Pashos, N. C., Bunnell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+cellularization+strategies+for+tissue+engineering+of+whole+organs.">A review of cellularization strategies for tissue engineering of whole organs.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnol. 3, 43 (2015).</li><li>Goh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+pancreas+as+a+natural+3D+scaffold+for+pancreatic+tissue+and+whole+organ+engineering.">Perfusion-decellularized pancreas as a natural 3D scaffold for pancreatic tissue and whole organ engineering.</a> Biomaterials. 34 (28), 6760-6772 (2013).</li><li>Wu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Culture+of+MIN-6+Cells+on+Decellularized+Pancreatic+Scaffold.">3D Culture of MIN-6 Cells on Decellularized Pancreatic Scaffold.</a> In Vitro and In Vivo Study. Biomed Research International. 2015, 432645 (2015).</li><li>Peloso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Pancreas+as+a+Source+of+Protolerogenic+Extracellular+Matrix+Scaffold+for+a+New-generation+Bioartificial+Endocrine+Pancreas.">The Human Pancreas as a Source of Protolerogenic Extracellular Matrix Scaffold for a New-generation Bioartificial Endocrine Pancreas.</a> Annals of Surgery. 264 (1), 169-179 (2016).</li><li>Mirmalek-Sani, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+pancreas+extracellular+matrix+as+a+platform+for+endocrine+pancreas+bioengineering.">Porcine pancreas extracellular matrix as a platform for endocrine pancreas bioengineering.</a> Biomaterials. 34 (22), 5488-5495 (2013).</li><li>Taylor, M. J., Baicu, S., Greene, E., Vazquez, A., Brassil, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+isolation+from+juvenile+porcine+pancreas+after+24-h+hypothermic+machine+perfusion+preservation.">Islet isolation from juvenile porcine pancreas after 24-h hypothermic machine perfusion preservation.</a> Cell Transplantation. 19 (5), 613-628 (2010).</li><li>Elebring, E., Kuna, V. K., Kvarnstrom, N., Sumitran-Holgersson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold-perfusion+decellularization+of+whole-organ+porcine+pancreas+supports+human+fetal+pancreatic+cell+attachment+and+expression+of+endocrine+and+exocrine+markers.">Cold-perfusion decellularization of whole-organ porcine pancreas supports human fetal pancreatic cell attachment and expression of endocrine and exocrine markers.</a> Journal of Tissue Engineering. 8, 2041731417738145 (2017).</li><li>Gilpin, A., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+Strategies+for+Regenerative+Medicine:+From+Processing+Techniques+to+Applications.">Decellularization Strategies for Regenerative Medicine: From Processing Techniques to Applications.</a> Biomed Research International. 2017, 9831534 (2017).</li><li>James, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+the+protease+inhibitor+phenylmethylsulfonyl+fluoride+in+buffers.">Inactivation of the protease inhibitor phenylmethylsulfonyl fluoride in buffers.</a> Analytical Biochemistry. 86 (2), 574-579 (1978).</li><li>Lichstein, H. C., Soule, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+the+Effect+of+Sodium+Azide+on+Microbic+Growth+and+Respiration:+I.+The+Action+of+Sodium+Azide+on+Microbic+Growth.">Studies of the Effect of Sodium Azide on Microbic Growth and Respiration: I. The Action of Sodium Azide on Microbic Growth.</a> Journal of Bacteriology. 47 (3), 221-230 (1944).</li></ol>

S.S.H. har aksjer i Verigraft, et selskap som har lisensiert teknologi av blod fartøy tissue engineering. Andre forfattere ikke avsløre.

Den foreslåtte protokollen, benytter perfusjon av SDC og Triton X-100 på 4 ° C, vil decellularize hele svin bukspyttkjertelen vellykket. Utfordringen i denne teknikken er Disseksjon av intakt bukspyttkjertelen som inneholder alle tre lobes uten å skade parenchyma og dens leverer fartøy, samt ligation av den andre vaskulære grener av prøven for å perfuse orgel uten lekkasje. Svin bukspyttkjertelen har en annen anatomi sammenlignet med menneskelige bukspyttkjertelen. Det består av tre lobes opphold i nær kontakt med tynntarmen av delvis omgir den. Vi dissekert tolvfingertarmen sammen med bukspyttkjertelen, som flere små blodkar fra bukspyttkjertelen koble tarmen. Under optimalisering studiene vist sløv kutting av blodkar lekkasje og en ufullstendig perfusjon av løsninger.
Siden aorta kobles til bukspyttkjertelen gjennom cøliaki og overlegen hvem arteriene, valgte vi aorta som en vik å holde perfusjonen enkelt ved bare å bruke en kanyle, og derfor en vik. I vår erfaring, ligation av aorta over CT og under SMA reduseres av disseksjon og reduserer risikoen for skade noen av de to blodårene. I tillegg til en heparinized gris, vi la også merke at et perfusjon av kaldt heparin via aorta umiddelbart etter dissection hjelper i å oppnå perfusjon av løsninger gjennom orgel. Vi spekulere Hvis dette skjer ved å hindre dannelse av blodpropp i blodkar. Den første perfusjonen av en bukspyttkjertelen med ultrapure vann etter disseksjon vil lyse røde blodlegemer og fjerne blod restene i organ, og dermed hindre dannelse av blodpropp. Denne perioden kan også brukes til å finne unligated liten grenene av vener og arterier, som blodstrøm kan enkelt merke over bakgrunnen.
Vi valgte å holde hele decellularization prosedyren på kalde temperaturer (4 ° C), da dette vil hindre av exocrine enzymer som fra exocrine celler i bukspyttkjertel. Exocrine enzymer, når ikke hemmet, kan føre til en skadelig effekt på celler og ECM, som de kan fordøye cellemembraner og proteiner12. Som fryses kan effektivt brast cellene, inkludert vi et fryse/tine skritt, først før perfusjonsmåling vaskemidler4,13. Første vask etter tining vil fjerne restene av cellen serieopptak. Vaskemiddel behandling vi brukte er en blanding av SDC og Triton X-100 i uvanlig høy konsentrasjoner og en høy perfusjon hastighet. Vi valgte denne tilnærmingen å oppnå raskere decellularization ved å fjerne exocrine cellene skade ECM. Vi spekulere at en hard og rask protokoll er gunstig for bukspyttkjertelen decellularization, som mindre tid vil være tilgjengelig for bukspyttkjertelen enzymer til å samhandle med ECM, dermed bevare god ECM-komponenter. For å bevare ECM komponentene, lagt vi også serine protease hemmer (PMSF) til vaskemiddel løsningene, som som vil hemme aktivering av enzymer fra exocrine celler14. Natriumazid legges til alle decellularization løsninger, det fungerer som en bakteriostatisk agent, og dermed begrenser sjansen for bakteriell forurensning15.
Bukspyttkjertelen decellularized etter denne protokollen viste en bevaring av ECM strukturer og ECM proteiner kollagen og elastin. Imidlertid ble betydelig tap av glycosaminoglycans oppdaget i decellularized bukspyttkjertelen. Bukspyttkjertelen decellularized på denne måten viste også løftet for feste menneskelige fosterets bukspyttkjertelen stamceller og uttrykk for exocrine og endokrine markører i stykker recellularized for 14 dager12. Imidlertid vil generere en intakt og funksjonell bukspyttkjertelen, er videre forskning nødvendig i å vurdere riktig celle kilder, celletyper, celle seeding strategier og bioreactor kultur.

Diabetes mellitus er preget av tilstedeværelsen av økte nivåer av glukose i blodet. Det er anerkjent som en stor offentlig helse utfordring i de fleste land1. Høye nivåer av blodsukker påvirker blodårene og nervesystemet, forårsaker skade på øynene, hjertet, og nyrene og extremity ischemia. Tradisjonelle omfatter behandlingsmetodene injeksjoner av eksogene insulin, narkotika og livsstilsendringer. Sette til side en kur for sykdommen, i noen tilfeller, mislykkes tilgjengelig behandlinger å opprettholde insulin på terapeutisk nivåer, noe som resulterer i hyperglykemi. Selv om transplantasjon av holmer eller hele bukspyttkjertelen eliminerer sykdommen, er det ikke ofte gjort på grunn av mangel på passende donor organer og risikoer og problemer involvert immunsuppresjon og innkapsling2.
Gjeldende forbedringer innen tissue engineering og regenerativ medisin har kapasitet for å gi en løsning for disse problemene. Med teknikken for decellularization, mobilnettet materialet fra mennesker eller dyr giver kan fjernes mens viktig ekstracellulær matrix (EFM) proteiner, vekstfaktorer, og signalnettverk molekylene er bevart i stillaset. Slike stillaser kan potensielt være transplantert uten behov for immunsuppresjon, gjenoppretter funksjonen orgel etter recellularization med mottakerens egen ikke er immunogenic stamceller3,4. Vev-konstruert organer fra allogene eller xenogeneic kan brukes i klinisk transplantasjon, som store ekstracellulær matrix proteiner er bevart blant arter og kan ikke bli avvist etter transplantasjon5.
Decellularization er en godt utforsket med optimal bruk av fysiske krefter, kjemiske rengjøringsmidler og enzymer i en fysiologisk fjerne celler og kjernefysisk materiale fra en vev eller organ. Recellularization er en prosedyre til såing celler i acellular orgel. Det er en intellektuelt tøff prosedyre, krever et stort antall celler, en optimal celle-såing strategi og en bioreactor system for kulturen av orgelet på fysiologisk akseptabel forhold som temperatur, trykk og gasser6.
Bukspyttkjertelen kan betraktes som en utfordrende vev tissue engineering på grunn av sin exocrine og endokrine kapasiteter. Exocrine vevet ut flere fordøyelsesenzymer, mens delen endokrine skiller ut hormoner, inklusive insulin. Decellularization av intakt pancreases fra musen7,8, menneskelige9og gris10 allerede er rapportert ved hjelp av enzymer (trypsin, deoxyribonuclease [DNase]) og ikke-ioniske (Triton X-100) og ioniske vaskemidler ( natrium deoxycholate [SDC] og natrium dodecyl sulfate [SDS]). Imidlertid etter publiserte protokollene, vi slitt med en vellykket disseksjon og komplett perfusjon og decellularization samtidig opprettholde en ECM-struktur. Spekulerte vi at de brukte vaskemidler under decellularization føre til lysis av celler, og dermed slippe fordøyelsesenzymer inn orgel. Utgitt enzymer vil en irreversibel skade ECM stillaset og gjøre det ineffektivt for decellularization og recellularization. En design for metoden som effektivt decellularizes bukspyttkjertelen mens hemme virkningen av fordøyelsesenzymer kan løse problemet. Vi valgte strategi Peloso et al., av decellularization i bukspyttkjertelen på en kald temperatur, selv om de ikke rapporterte om hvorfor kald temperatur er brukt9. Samtidig utviklet vi en disseksjon strategi med endringer fra Taylor et al. ved å velge aorta som en perfusjonsmåling vik over cøliaki stammen (CT) og overlegen hvem arterie (SMA)11.
I en nylig publisert artikkel12viser vi en metode for effektiv isolasjon og decellularization av svin bukspyttkjertelen samtidig bevare noen ECM-komponenter. I dette papiret, vi viser en detaljert beskrivelse av hvordan å analysere en hel svin bukspyttkjertelen som inneholder splenic, duodenalsår og tilkobling lobes, og presentere en gradvis protokoll for vellykket decellularization.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
		<tbody>
		<tr >
			<td >4mm DLP arteriotomy cannula</td>
			<td >Medtronic</td>
			<td >31104</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2ml Unlabelled pipette</td>
			<td >vWR</td>
			<td >612-3720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Degasser</td>
			<td >Biotech AB</td>
			<td >0001-6484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase-I</td>
			<td >Worthington</td>
			<td >LS0020007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s PBS with CaCl2 and MgCl2</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td >AlfaAesar</td>
			<td >A15161.OB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heparin</td>
			<td >Leo</td>
			<td >387107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Luer Male with 1/8&#34; ID Barb</td>
			<td >Oina</td>
			<td >LM-2PP-QC</td>
			<td>For 3X5mm silicon tube</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Peristaltic pump</td>
			<td >Oina</td>
			<td >SP-1X4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PMSF</td>
			<td >Roche</td>
			<td >10837091001</td>
			<td>Unstable in aqueous solution. Should be added fresh before perfusion.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium chloride</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium hydrogen phosphate</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SDC</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silicon tube 3X5mm</td>
			<td >VWR</td>
			<td >2280706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Azide</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >71290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium chloride</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >13423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium hydrogen phosphate</td>
			<td >Merck</td>
			<td >71640-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Suture</td>
			<td >V&#246;mel</td>
			<td >14817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syrringe 50mL</td>
			<td >Becton Dickinson</td>
			<td >300137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton-X-100</td>
			<td >AlfaAesar</td>
			<td >A16046.OF</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and decellularization of a whole porcine pancreas

Tissue engineering for hele bukspyttkjertelen kan forbedre gjeldende behandlinger for diabetes mellitus. Det ultimate målet er å vev ingeniør bukspyttkjertelen fra en allogene eller xenogeneic med menneskelige celler. En demonstrasjon av metoder for effektiv disseksjon, decellularization og recellularization av svin bukspyttkjertelen kan dra feltet. Som menneskelige pancreases, svin pancreases har en spesiell anatomiske avtale med tre lobes (splenic, duodenalsår, og tilkobling) rundet av tolvfingertarmen og tynntarmen. Den duodenalsår flik av bukspyttkjertelen kobler til tolvfingertarmen ved flere små blodkar. Tissue engineering i bukspyttkjertelen er komplisert på grunn av dens exocrine og endokrine natur. I dette papiret viser vi en detaljert protokoll å dissekere hele svin bukspyttkjertelen og decellularize det med vaskemidler stund bevarer sin struktur og noen ekstracellulær matrix-komponenter. For å oppnå fullstendig perfusjon, velges aorta vik og portalen blodåre som utløp. Andre blodkar (hepatic arterien, splenic blodåre, splenic arterien, hvem arterien og venen treet) og galle duct er samskrevet. For å hindre dannelse av blodpropp, grisen er heparinized, og umiddelbart etter disseksjon, tømmes orgel med kaldt heparin. For å hemme virkningen av exocrine enzymer, er bukspyttkjertelen decellularization satt til 4 ° C. Decellularization er utført av perfusjon Triton X-100, natrium deoxycholate og deoxyribonuclease, med en intermitterende og siste omfattende vask. Med en vellykket decellularization, bukspyttkjertelen vises hvite, og en histologiske evaluering med hematoxylin og eosin viser et fravær av kjerner med bevarte ekstracellulær matrix struktur. Dermed kan den foreslåtte metoden brukes å analysere og decellularize hele svin bukspyttkjertelen.

Representant svin bukspyttkjertelen disseksjon bilder, som kan hjelpe i å finne og dissekere dårligere hvem arterien og vene treet, portalen blodåre, hepatic arterien, gallekanalen og aorta forgreninger til CT og SMA, er vist i figur 2A, 2bog 2 C (gule piler), henholdsvis. Figur 3A viser brutto morfologi av en normal bukspyttkjertelen, som vises med lys rosa og inneholder splenic, tilkobling og duodenalsår lobes. Etter decellularization, den rosa fargen går tapt og decellularized bukspyttkjertelen ser blek hvit i fargen. Brutto morfologi bildet viser splenic, vises tilkobling og duodenalsår lobes av en decellularized bukspyttkjertelen i figur 3B. Figur 3 c viser tilstedeværelse av mange blå kjerner i en normal bukspyttkjertelen etter farging med han. I en decellularized bukspyttkjertelen, han flekker viste tap av kjerner, ingen blå kjerner er sett (figur 3D).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58302/58302fig2v2.jpg"> Figur 2: bilder av et svin bukspyttkjertelen disseksjon. (A) plassering av dårligere hvem arterien og venen treet (gul pil). (B) Ligation av portalen blodåre, hepatic arterien og galle duct (gul pil). (C) Aorta forgrening cøliaki bagasjerommet og overlegen hvem arterien (gul pil). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58302/58302fig2v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58302/58302fig3.jpg"> Figur 3: brutto morfologi og han flekker av normal og decellularized pancreases. (A) brutto morfologi av en normal bukspyttkjertelen. (B) brutto morfologi av en decellularized bukspyttkjertelen. (C) han flekker viser tilstedeværelse av blå kjerner i en normal bukspyttkjertelen. (D) han flekker viser fraværet av blå kjerner i en decellularized bukspyttkjertelen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58302/58302fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas at JoVE.com

Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas

Tissue engineering for hele bukspyttkjertelen er en utfordring på grunn av dens exocrine og endokrine funksjoner. Vi viser en metode for Disseksjon av en intakt svin bukspyttkjertelen og prosessen med vellykkede decellularization av perfusjon av vaskemidler Triton X-100, natrium deoxycholate og deoxyribonuclease.

Isolasjon og Decellularization av en helt svin bukspyttkjertelen

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an ...

Denne metoden kan brukes til disseksjon av svin bukspyttkjertel som inneholder tilkobling, duodenal, og miltapper og eventuell decellularisering via perfusjon av vaskemidler ved kalde temperaturer. Selv om denne metoden for decellularisering gir innsikt i svinepanatinen, kan den også brukes på bukspyttkjertelen fra andre store dyr. Den største fordelen med denne teknikken er at den letter intakt gjenfinning av et komplisert organ, for eksempel bukspyttkjertelen, for videre vevsteknikk.Generelt, enkeltpersoner nye til denne metoden, vil de slite fordi disseksjon av intakt bukspyttkjertel mens identifisere og ligating alle de omkringliggende blodårene krever mye praksis å mestre. Før du begynner prosedyren, bruk ett tre-til-fem-millimeter silikonrør for å koble vaskemiddelbeholderen til den peristaltiske pumpen og et annet tre-til-fem-millimeter silikonrør for å koble den peristaltiske pumpen til organkammeret via avgasseren. Koble en hann Luer til den frie enden av det andre røret, og bruk et tredje tre og fem millimeter silikonrør for å koble organkammeret til vaskemiddelsamlingsbeholderen via den peristaltiske pumpen.Til slutt kobler du en to millimeter umerket pipette til de frie endene av rørene i vaskemiddelbeholderen og vaskemiddeloppsamlingsbeholderen. Deretter plasserer du decellulariseringsoppsettet på fire grader Celsius. For å høste bukspyttkjertelen, legg en heparinisert, 45-kilos, kvinnelig gris på et disseksjonsbord i liggende stilling, og bruk en skalpell for å lage et 40-centimeter midtlinjesnitt fra xiphoidprosessen til kjønnsbenet for å avsløre bukorganene.Etter å ha identifisert milt, duodenal og tilkoblingsfliker, finn de store duodenale papillaene, og bruk to individuelle suturer til å muntlig ligate tolvfingertarmen fra stedet. Ligate den dårligere spiserøret med ekstra suturer, og kutt mellom ligaturene med saks for å lette fjerning av magen. Skill bindevevet fra tykktarmen for å nå tynntarmen, og skill bindevevet i tykktarmen som festes til milten i bukspyttkjertelen.Tynntarmen er festet til bukspyttkjertelen ved bindevev ved miltenappen, men omgir også bukspyttkjertelen. Du må nøye følge tarmbanen for å detangle og skille bindevevet mellom tarmen og bukspyttkjertelen. Etter ligating arteriene, fjern tykktarmen fra tynntarmen.Identifiser den dårligere mesenteriske venen, det dårligere mesenteriske arterietreet, og ligate karene med en sutur caudal til bukspyttkjertelen og kutt med saks. Ligate miltarterien og venen sammen i hilum, nær milten, og kutt distally med saks for å fjerne milten. Følg tolvfingertarmen til duodenal og tilkobling lobes er ryddet, og ligate tolvfingertarmen på slutten med to separate suturer.Den delen av tolvfingertarmen som er i nær kontakt med forbindelsen og duodenalappene fjernes med bukspyttkjertelen, da ligation av alle de små blodkarene mellom de to organene er for vanskelig. Etter dissekering portalvenen, ligate fartøyet med en sutur for å forhindre blodlekkasje fra leveren, og dissekere og ligate gallekanalen og leverarterien med to suturer. Deretter kutte portal vene, leverarterie, og gallegang med saks.Finn aorta under nyrevenen, og disseker aorta i kranial retning fra muskelen og bindevevet til fartøyet når bukspyttkjertelen. Nå, forsiktig snu bukspyttkjertelen over, og dissekere aorta, holde overlegen mesenterisk arterie og cøliaki stammen intakt. Skjær aortakraniet til cøliakistammen, og sløv dissekere det gjenværende omkringliggende vevet for å tillate høsting av bukspyttkjertelen.Deretter bruker du en 50-milliliter sprøyte koblet til en fire millimeter arteriotomi kanyle for å skylle orgelet gjennom aorta med løsning to til hele orgelet er perfundert eller til hele orgelet blir kaldt. Plasser løsningen to perfused bukspyttkjertel på et metallbrett på is, med aorta vendt opp, og bruk saks for å kutte suturene fra tolvfingertarmen. Bruk en 25-milliliter pipette til å skylle tolvfingertarmen med 50 til 150 milliliter ultrapure vann, og gjenopplev vevet med friske suturer.Ligate den ene enden av aorta og alle grenene, unntatt den overlegne mesenteriske arterien og cøliakistammen, for å forhindre lekkasje, og sett inn en fire millimeter arteriotomi kanyle i den andre enden av aorta. Deretter plasserer du bukspyttkjertelen i organkammeret, og kobler kanylen i bukspyttkjertelen til en mannlig Luer. Deretter perfuse bukspyttkjertelen med løsning tre i en time ved 20 milliliter per minutt, og fryse den dobbeltperfused bukspyttkjertelen ved minus 20 grader Celsius i løsning fire til starten av decellularization.På dagen for å starte decellularisering tiner bukspyttkjertelen ved fire grader Celsius, og plasserer den tinte bukspyttkjertelen i decellulariseringsorgankammeret. Koble vaskemiddelinntaket til aorta i bukspyttkjertelen, og vask bukspyttkjertelen med løsning tre ved 20 milliliter per minutt over natten ved fire grader Celsius. Neste morgen, dekantere noen løsning som gjenstår i orgelkammeret, og perfuse bukspyttkjertelen i 30 minutter ved 20 milliliter per minutt i løsning fem ved fire grader Celsius.På slutten av løsningen fem perfusjon, perfuse bukspyttkjertelen i åtte timer på 20 milliliter per minutt i løsning seks og fire grader Celsius, etterfulgt av en 96-timers vask i frisk løsning fem på 20 milliliter per minutt og fire grader Celsius. Erstatt vasken med 500 milliliter DPBS supplert med kalsium og magnesium i 30 minutter ved 37 grader Celsius, etterfulgt av perfusjon med 250 milliliter løsning syv i fire timer ved 20 milliliter per minutt og 37 grader Celsius. Vask deretter orgelet i ytterligere 120 timer med frisk oppløsning fem på 20 milliliter per minutt og fire grader Celsius, og lagre orgelet i løsning åtte.Her kan den grove morfologien til en normal bukspyttkjertel, som vises lys rosa og inneholder milt, tilkobling og duodenalapper, observeres. Etter decellularisering går den rosa fargen tapt, og den bearbeidede bukspyttkjertelen vises blek hvit i fargen. I en normal bukspyttkjertel er mange blå kjerner tydelige ved H- og E-farging, mens kjernene i en decellularisert bukspyttkjertel ikke lenger kan visualiseres, noe som bekrefter tapet.Den isolerte intakte svinepankreasen, etter denne prosedyren, vil det tillate en fullstendig perfusjon og vellykket decellularisering samtidig som strukturen bevares og også tillater noen ekstracellulære matriseproteiner å oppnås. Decellularisert bukspyttkjertel kan brukes til å utvikle helorgan recellulariseringsstrategier i bioreaktorsystemer med relevante celletyper. Etter recellularisering med mottaker stamceller, vev konstruert bukspyttkjertel kan brukes til kliniske anvendelser og narkotikatesting.Ikke glem at det å jobbe med Triton X-100 og SDC kan være ekstremt farlig, og at forholdsregler, som bruk av hansker og klargjøring av løsningene under røykhette, alltid bør tas mens du utfører denne prosedyren.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

Prosedyre for Decellularization av svinekjøtt Heart av Retrograde Coronary Perfusjon

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

En Decellularization metodikk for produksjon av en Natural acellulære Intestinal Matrix

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

Nonhuman Primate Lung Decellularization og Recellularization Ved hjelp av en Specialized Stor-orgel bioreaktor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

Prosedyre for Decellularization av Rotte Livers i en oscillerende trykk Perfusjons Device

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

Quantification of Strain in a Porcine Model of Skin Expansion Using Multi-View Stereo and Isogeometric Kinematics

Kvantifisering av Strain i en svinekjøtt Model of Skin Expansion Bruke Multi-View Stereo og Isogeometric Kinematikk

Tissue expansion is a popular technique in plastic and reconstructive surgery that grows skin in vivo for correction of large defects such as burns and ...

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

Høyoppløselig 3D-bildebehandling av menneskelig bukspyttkjertelen Nevro-isolerte nettverket

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological ...

Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

Sammenlignbare Decellularization av Fetal og voksen hjerte vev Explants som 3D-lignende plattformer for i Vitro studier

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

To metoder for Decellularization av anlegget vev for Tissue Engineering programmer

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Decellularization og Recellularization metoder for menneskelig Saphenous årer

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and ...