Name: anaerobic protein purification and kinetic analysis via oxygen electrode for studying desb dioxygenase activity and inhibition
Uploaded: 2018-10-03T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition at JoVE.com

ونود أن نشكر الدكتور كاميل كيلر من جامعة ويسليان للدعم التقني. خاص بفضل البروفسور ليندساي دال Eltis وجينا ك. كابيك من جامعة كولومبيا البريطانية، فضلا عن المسيحية ويتمان من جامعة تكساس في أوستن، لمشورتهم فيما يتعلق بأساليب تنقية البروتين اللاهوائية واستخدام يا2 --القطب الحساسة.

1-أحكام عامة المواد والأساليب
<ol><li>إعداد كافة الوسائط المطلوبة كما هو موضح في الجدول 1. اﻷوتوكﻻف في ˚C 120 عن 15 دقيقة ستيريل حسبه حل شركة نفط الجنوب، بعد إضافة مجكل2 والسكر، يمر عن طريق فلتر 0.2 ميكرون. ضبط الأس الهيدروجيني ميلر "مرق ليسوجيني" (وسائل الإعلام رطل) الحل قبل التعقيم....

تشمل الخطوات الحاسمة في الحصول على بروتين دسب النشطة، وتنقية في تشكيل والحفاظ على الموقع النشط Fe(II) انخفاض في الإنزيم. على هذا النحو، تصحيح أداء التعريفي، وتنقية، والتركيز، والملحي خطوات ضرورية لنجاح الحصول على نشاط إنزيم. حمل التعبير البروتين حضور كبريتات الأمونيوم الحديدية 1 مم يضمن إد?...

الإنزيمات التي تستخدم الحديد أو المعادن الأخرى لتنشيط الأكسجين غالباً ما تكون عرضه للمنظمة خلال عملية التنقية بسبب إبعادهم من البيئة الحد من خلية. ولذلك، هذه البروتينات يجب استخدامه كخلية ليساتيس، والتعرض لعوامل خارجية الحد، أو يمكن تنقية لاهوائيا ضمان أن تكون لديهم النشاط الأنزيمي الأمثل1،2،،من34. لتلك الإنزيمات التي ضروري الأكسجين حساسة (الإنزيمات المحتوية على الحديد على وجه التحديد)، تنفيذ جميع الخطوات تنقية وتوصيف مع الحفاظ على الظروف اللاهوائية الكامل لتوصيفها. وقد أدى هذا الباحثين تطوير الهياكل مختبر كامل في حدود الدوائر اللاهوائية لدراسات تتراوح بين التعبير البروتين من خلال البلورات5،،من67،8 .
هنا، نحن التقرير أساليب لتنقية اللاهوائية والحركية توصيف الإنزيم دسب باستخدام نظام قطب الأوكسجين. دسب هو ديوكسيجيناسي يبيغاللوكاتيشين من بكتيريا سفينجوبيوم sp. سلالة SYK-6 التي تتصل ليجاب، ديوكسيجيناسي بروتوكاتيكواتي من الكائن نفسه. كلا الإنزيمات تنتمي إلى النوع الثاني بروتوكاتيتشواتي ديوكسيجيناسي (بكاد) فوق عائلة التي لم تدرس على نطاق واسع بتاريخ9، يحتمل جزئيا بسبب الإنزيمات من فوق عائلة هذا يجري عرضه للمنظمة عند تنقيته باستخدام معيار الهوائية طرق تنقية البروتين. منذ عرض بعض الإنزيمات بكاد المجون الركازة البعض الآخر الركيزة الخاصة2،10، كذلك وصف فوق عائلة هذا ضروري لتحديد المحددات خصوصية. كما لوحظ في عدة الإنزيم سوبيرفاميليس11،،من1213،،من1415، الجزيئات الصغيرة يمكن أن يغير النشاط عن طريق تثبيط المنافسة المباشرة أو ربط جزيئات منفصلة جيوب اللوستيريك مما يؤدي إلى زيادة أو نقصان في النشاط الأنزيمي16. وفي حين لا يمكن التفريق حركية وحدة موقع المغير، تحديد حجم تغير نشاط مهم لفهم الآثار ملزمة. كهذه، أساليب لتحديد الخصائص الحركية الأصلية ديسب النشاط ونشاطها بحضور 4-نيتروكاتيتشول (4NC)، مجمع شيوعاً لتوصيف وتمنع ديوكسيجيناسي الإنزيمات2،17، 18، وترد.
دسب غير قادرة على كسر يبيغاللوكاتيشين، مجمع، عن طريق فعل ديوكسيجيناسي (إيدو) اكستراديول في الطوق الذي فتح هو حفز استخدام الأوكسجين كواحدة من ال10،ركائز19عطرية المستمدة من اللجنين. يحدث هذا التفاعل الأنزيمي في سياق انهيار اللجنين، هيتيروبوليمير عطرية الموجودة في جدار الخلية من النباتات. يمكن أن يكون ديبوليميريزيد اللجنين، مما أسفر عن مجموعة متنوعة من المركبات العطرية يمكن كذلك تقسيمها إلى نواتج الأيض وسط3،،من2021،22،23،24 ،25،،من2627،،من2829،30،31،32،33 . اكستراديول ديوكسيجيناسيس (إيدو) تحفيز عصابة فتح رد فعل على المركبات العطرية ديهيدروكسيلاتيد، حيث يحدث انشقاق المتاخمة ديول نسق المعادن؛ وفي المقابل، تنشق ديوكسيجيناسيس إينتراديول المركبات العطرية المماثلة بين مجموعتي هيدروكسيل (الشكل 1). وقد عدس، مثل العديد من ميتالوينزيميس الأخرى، مركز ديفالينت لمعادن لتنسيق Fe(II) تتألف من اثنين--الحامض الأميني، واحد-كاربوكسيلات ثالوث9،،من3435. تصبح تتأكسد هذه ميتالوينزيميس، من خلال autoxidation أو تستند إليه المنظمة، في حين يتم تقديم الإنزيم غير نشط2،36،،من3738.
في الإجراءات التجريبية المبينة في هذه المخطوطة، فنحن نستخدم دسب، عضو فوق بكاد عائلة من بكتيريا سفينجوبيوم sp. SYK-6، تحفيز إضافة الأكسجين عبر رباط C4-C5 يبيغاللوكاتيشين (الشكل 2A). ريجيوتشيميستري هذا الانقسام يناظر ليجاب، وبروتوكاتيتشواتي-4، 5-ديوكسيجيناسي (الشكل 2). وحتى الآن، تشمل التحقيقات في هذه ديوكسيجيناسي يبيغاللوكاتيشين أي تقارير عن المركبات التي تمنع دسب10،،من1939. باستخدام أساليب تنقية الهوائية، عرضت دسب النشاط المتغير، بينما مع استخدام الأساليب اللاهوائية كنا قادرين على استمرار الحصول على البروتين مع النشاط استنساخه. وتبين الدراسات الحركية الموصوفة هنا أساليب تنقية اللاهوائية دسب، توصيف الحركية لرد فعل دسب مع يبيغاللوكاتيشين، وتثبيط دسب قبل 4-نيتروكاتيتشول (4NC).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranodise</td>
			<td>Gold Bio Technologies</td>
			<td>I2481C50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;tetramethyl-ethylenediamine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylose Resin High Flow</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E8022S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) competent Escherichia coli cells</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gallic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-nitrocatechol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N15553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrous ammonium sulfate</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>5064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dithionite</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>33381-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wheaton serum bottles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-406G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm Acrodisc PF Syringe Filter with Supor Membrane</td>
			<td>Pall Corportation</td>
			<td>4187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL Amicon Stirred Cell Concentrator</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFSC40001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>76 mm Millipore Ultracel 10 kDa cutoff reconsituted cellulose membrane filter</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PLGC07610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-dithiothreitol</td>
			<td>Gold Bio Technologies</td>
			<td>DTT50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-25 coarse desalting gal column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0033-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Crimp-Top Vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-391-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph Plus Electrode Control Unit</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>OXYG1 Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Eletrode Chamber</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>DW1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Disc</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE (0.0125 mmX25mm) 30m reel</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>S4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode cleaning Kit</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>S16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spacer paper</td>
			<td>Zig Zag</td>
			<td>available at any gas station</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>He-series Dri-Lab glove box</td>
			<td>Vacuum/Atmospheres Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HE-493 Dri-Train</td>
			<td>Vacuum/Atmospheres Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-401-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>k420400-1530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L, Model 701 N SYR, Cemented NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2 syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K420401-1505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulsiflex-C5 high-pressure homogenizer</td>
			<td>Avestin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-PER Complete Bacterial Protein Extraction Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12650-88-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>7177-48-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP-1421-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP153-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP684-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G46-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

anaerobic protein purification and kinetic analysis via oxygen electrode for studying desb dioxygenase activity and inhibition

يمكن قللت البروتينات حساسة للأكسجين، بما في ذلك تلك الإنزيمات التي تستخدم الأوكسجين كركيزة، الاستقرار عند تنقيته باستخدام أساليب تنقية الهوائية التقليدية. وتوضح هذه المخطوطة التفاصيل التقنية المعنية بعملية تنقية اللاهوائية، بما في ذلك إعداد المخازن المؤقتة والمواد الكاشفة، والأساليب للفصل اللوني للعمود في مربع القفازات، والملحي البروتين قبل حركية. كما وصفت هي أساليب إعداد واستخدام قطب أكسجين القيام بتوصيف الحركية لأنزيم الاستفادة من الأكسجين. يتم توضيح هذه الأساليب باستخدام الإنزيم ديوكسيجيناسي دسب، ديوكسيجيناسي يبيغاللوكاتيشين من بكتيريا سفينجوبيوم sp. سلالة SYK-6.

سيظهر هو تحليل جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة للكسور الفردية من تنقية مالتوس دسب ملزمة بناء الانصهار البروتين (MBP) (الشكل 3). الهلام يكشف عن أن البروتين النقي (MW = كاتشين 91.22)، باستثناء وجود ديسب (ميغاواط = كاتشين 49.22) و MBP البروتين المجال (كاتشين 42) المشقوق من ?...

Watch this Scientific Journal Video about Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition at JoVE.com

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

تنقية البروتين اللاهوائية وتحليل الحركية عبر مسرى الأوكسجين لدراسة النشاط ديوكسيجيناسي دسب وتثبيط

نقدم هنا بروتوكولا لتنقية البروتين اللاهوائية وتركيز البروتين اللاهوائية، وتوصيف الحركية اللاحقة باستخدام نظام قطب الأوكسجين. ويتضح الأسلوب استخدام الإنزيم دسب، إنزيم ديوكسيجيناسي الذي أكثر استقرارا ونشطة عند تنقيته وتخزينها في بيئة لا هوائية.

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

تم تصميم هذه الطريقة للإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الكيمياء الحيوية غير العضوية، حول كيفية الحفاظ على نشاط الإنزيم في البروتينات التي تحتوي على المعادن الحساسة الأكسجين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يساعدك على تصور الطرق التي يمكنك من خلالها الحفاظ على معدن البروتين في حالته المخفضة. عموما، سوف الأفراد الجدد لهذه التقنية النضال لأنه من الصعب الحفاظ على المواد والكواشف لتكون اللاهوائية تماما.24 ساعة بعد تحريض تعبير البروتين, جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي, وإعادة تعليق بيليه الخلية البكتيرية في 20 ملليلتر من عمود amylose العازلة لكل 1.5 لتر من النمو. إضافة ملليغرام واحد من lysozyme إلى تعليق الخلية، ويحرك الخلايا لمدة 20 دقيقة على الجليد. في نهاية الحضانة ، وlyse محلول الخلية resuspended عن طريق التجانس عالية الضغط مع ثلاثة إلى خمسة تمريرات في حوالي 15000 psi ، ونقل البروتين إلى أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر.تدفق مساحة الرأس مع النيتروجين لمدة دقيقة واحدة، والطرد المركزي الخلية lysate لإزالة الحطام غير قابلة للذوبان. نقل supernatant إلى واحد على الأقل 50 ملليلتر أنبوب، وغطاء lysate مع الحاجز المطاطي. باستخدام إبرة 20 قياس، فقاعة ببطء غاز النيتروجين من خلال الحل لمدة دقيقتين لإزاحة الأكسجين.ثم، التفاف الحاجز مع فيلم البارافين، وتأمين Parafilm مع الأسلاك النحاسية، ووضع supernatant في مربع القفازات مع مواد العمود. عندما المذيب هو فقط فوق السرير الراتنج، في عمود amylose أعدت سابقا، تحميل 50 ملليلتر من البروتين سوبرنات على العمود، وجمع تدفق من خلال في كسور خمسة ملليلتر تحت النيتروجين الضغط المعتدل في ما يقرب من خمسة ملليلتر في الدقيقة الواحدة. عندما تم اغصاء كل تدفق من خلال ، وغسل العمود مع وحدات التخزين عمود ثلاثة أخرى من العازلة عمود amylose.إضافة خمسة السيرة الذاتية من عازلة elution، ومن ثم جمع يدويا كسور ثلاثة ملليلتر في أنابيب اختبار الزجاج تحت النيتروجين المضغوط المعتدل. اختبار الحلول لوجود الأكسجين مع كبريتات الأمونيوم الحديدية وdithiothreitol. الحل سوف تتحول الأزرق الداكن أو الأسود إذا كان الأكسجين موجودا، مثل أنبوب على اليمين.وجود الأكسجين سوف يؤدي إلى البروتين النقي مع نشاط الحفاز منخفضة. حلول مع الحد الأدنى من الأوكسجين الحالي سيكون الخزامى أو اللون الأزرق الفاتح شفافة، مثل أنبوب على اليسار. بعد ذلك، استخدم خط النيتروجين الخارجي للضغط على غرفة الخلية المُثارة، وتركيز البروتين على 50 ملليلتر بسرعة مثيرة معتدلة مرتين.ثم، تركيز البروتين إلى 10 ملليلتر، وتصفية البروتين المركز من خلال مرشح حقنة ميكرومتر المسام 0.45. Aliquot 150 ميكرولترات من البروتين إلى فردي 200 ميكرولتر البوليميراز سلسلة أنابيب التفاعل. ثم، إزالة aliquots توج من مربع القفازات لتجميد فلاش الفوري في النيتروجين السائل والتخزين في ناقص 80 درجة مئوية.لDsB desalting، أولا إضافة ثلاثة ملليلتر من سيفاديكس G-25 جل desalting الخشنة إلى عمود borosilicate تسعة ملليلتر، وغسل العمود مع اثنين من وحدات التخزين العمود من عازلة desalt degassed. عندما يذوب DesB ، قم بتحميل البروتين المنقى على العمود عبر عملية تتحكم فيها الجاذبية ، وتجاهل التدفق من خلال قبل سحب ثلاث قطرات من البروتين في كل من 12 قارورة ، مع ما يقرب من خمسة ملليلترات من عازلة إزالة ماء. لإعداد قطب الأكسجين ، استخدم المقص لقطع واحد حوالي 1.5 بوصة مربعة من ورق المسافة ، وقطع مثلثات صغيرة على كل وجه من وجه الساحة ، مع الشقوق في الزوايا للمساعدة في التفاف القطب.إضافة خمس قطرات من محلول كلوريد البوتاسيوم 50٪ على الأخدود الأنود الفضي من القطب، وربط قطرات بحيث تشكل حلقة مستمرة من الحل. إضافة قطرتين من محلول كلوريد البوتاسيوم إلى الجزء العلوي من القطب البلاتين، ووضع بعناية ورقة المسافة على رأس القطب البلاتين، وتنعيم الورق حتى لا تكون هناك فقاعات الهواء. قطع ما يقرب من قطعة بوصة اثنين طويلة من S4 30M PTFE غشاء، ووضعها على رأس ورقة المسافة، وإزالة حواف الغشاء بحيث يتم محاذاتها مع الحلقة الخارجية من القطب.باستخدام قضيب O-ring، ادفع حلقة O صغيرة فوق القطب لتأمين ورقة المسافة والغشاء على القطب، ووضع حلقة O أكبر على الأخدود الدائري للأقطاب الكهربائية، مع الحرص على عدم وجود غشاء تحته. حرك الغرفة العلوية من القطب على القاعدة ، والمسمار قطعتين معا. ضع القطب المجمع على قاعدته، وتوصيل القطب لنظام المراقبة.لتحديد معدل التفاعل الأنزيمي، استخدم قطبًا كهربائيًا حساسًا للأكسجين من نوع Clark، مع تكامل الكمبيوتر لقياس استهلاك الأكسجين عبر وحدة التحكم في القطب الكهربائي. إضافة ملليلتر واحد من المخزن المؤقت تريس في حجم المناسبة من الركيزة إلى غرفة القطب، واثارة الحل لمدة 10 ثانية. بعد 10 ثانية، ببطء ختم الغرفة مع المكبس، والمسمار من أعلى إلى أسفل.استخدام الأنسجة النظيفة لامتصاص السائل الزائد الذي يتم إزاحته من الغرفة، والسماح للالكترود لتكدير حيث يمكن أن تنتج قياس مستقر لتركيز الأكسجين في الحل لمدة دقيقة واحدة على الأقل. بعد ذلك ، استخدم حقنة 10 ميكرولتر ضيقة بالغاز لإضافة ما يقرب من ميكرولتر من الإنزيم إلى غرفة القطب الكهربائي من خلال المكبس ، وجمع بيانات المعدل. عندما تم جمع كل من معدل لتركيز الركيزة معينة، واستخدام أنبوب من البلاستيك متصلة قارورة فراغ الذراع الجانبية لإفراغ غرفة القطب، وشطف مرارا وتكرارا الغرفة لمدة أربع إلى ست دورات بالماء.ثم، إعداد الحل في القطب كما أظهرت للتو، وذلك باستخدام تركيز الركيزة الجديدة. تحليل هلام SDS-PAGE من الكسور الفردية من DesB-maltose ربط بروتين الانصهار بناء بناء يكشف عن عزلة من منتج البروتين النقي، جانبا لوجود DesB وmalose المنتجات مجال البروتين ملزمة التي تشقوق من بعضها البعض. مرة واحدة وقد اتخذت جميع القياسات الحركية، يمكن الحصول على نشاط DesB مع جالاتي، على سبيل المثال، عن طريق قياس معدل استهلاك الأكسجين في تركيزات غالات مختلفة.وعلى العكس من ذلك، يمكن تحديد معدل تثبيط ديسب مع أربعة نيتروكاتكول من خلال مراقبة انخفاض في معدل استهلاك الأكسجين من ديسب مع غالات واحد ملليمولار في وجود تركيزات متفاوتة من أربعة نيتروكاتكول، مما يشير، على سبيل المثال، إلى أن أربعة نيترو كنتيكاتكول يمنع استهلاك الأكسجين وبالتالي رد فعل ديسب. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لدراسة إنزيمات الديوكسيجيناز المعتمدة على الحديد ، يمكن تطبيقه على أنظمة أخرى ، مثل metalloenzymes الأخرى. لا ننسى أن العمل داخل مربع القفازات يمكن أن يكون تحديا، لذلك الحرص على عدم التسرع أثناء تنفيذ هذه التقنية.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

طريقة لتحديد الصغيرة جزيء مثبطات التفاعل البروتين البروتين بين HCN1 وTRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

التعبير، تنقية، ومضادات الميكروبات النشاط من S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 في 1: انجذاب تطهير لتحليل مواز للبروتين-بروتين والبروتين-المستقلب المجمعات من خطوة واحدة

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

تنقية وإعادة تشكيل TRPV1 لتحليل سبيكتروسكوبيك

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

تنقية فعالة والتنمية LC MS/MS-المستندة إلى تحليل لأحد عشر-عشرة إزفاء-2 5-ميثيلسيتوسيني ديوكسيجيناسي

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

أخذ العينات والمعالجة المسبقة لميناء الأسنان كربونات الكربون مستقرة وتحليل نظائر الأكسجين

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

دراسة البروتين استيراد المعايشة باستخدام بروتوبلاستس

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

قياس وتفسير معدلات استهلاك الأوكسجين كلياً يطير رئيس قطاعات

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

تحليل البروتين الاستقطاب بلعم البشرية تحت بيئة منخفضة الأكسجين

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

دراسة التمثيلات الحمض النووي الريبي للبروتين كيناز المنشط الجيش الملكي النيبالي خلال دورة الخلية الثديية

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...