Name: anaerobic protein purification and kinetic analysis via oxygen electrode for studying desb dioxygenase activity and inhibition
Uploaded: 2018-10-03T14:45:00
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我们要感谢卫斯理大学的卡米尔. 凯勒博士的技术支持。特别感谢 Eltis 教授和珍娜 k. Capyk 从不列颠哥伦比亚大学, 以及德克萨斯大学奥斯汀分校的基督教惠特曼, 他们就厌氧蛋白质纯化方法和使用 O 2 的建议敏感电极。

1. 一般材料和方法
<ol><li>按照表 1中的说明准备所有必需的介质。高压釜在120˚C 15 分钟无菌过滤器的 SOC 解决方案, 在添加氯化镁2和葡萄糖后, 通过通过0.2 µm 过滤器。在热处理之前, 调整米勒的溶源性汤 (LB 介质) 溶液的 pH 值。补充 LB-安培介质溶液后, 热处理与无菌溶液的0.2 毫米 l-半胱氨酸, 然后0.1 毫米亚铁铵, 以提高蛋白质的表达和溶解度。</li>
	<li>为聚丙烯酰胺凝胶电泳 ...

获得活性的、纯化的 DesB 蛋白的关键步骤包括在酶中还原铁 (II.) 活性部位的形成和维持。因此, 正确的诱导、纯化、浓缩和脱盐步骤的性能是成功获得活性酶的必要条件。诱导蛋白在1毫米铁铵存在下的表达确保铁 (II) 正确地纳入 DesB 的活性部位。这种方法是灵感的研究, 如那些与 amidohydrolase metalloenzymes, 这往往需要添加金属的增长媒体, 以允许适当的折叠和充分占用的金属结合点6</sup...

利用铁或其他金属活化氧的酶在纯化过程中往往容易失活, 因为它们从细胞的还原环境中去除。因此, 这些蛋白质必须作为细胞裂解物, 受到外部还原剂, 或纯化厌氧, 以确保他们有最佳的酶活性1,2,3,4。对于那些对氧敏感的酶 (特别是含铁的酶), 执行所有的纯化和表征步骤, 同时保持厌氧条件是充分描述它们的必要条件。这使得研究人员在厌氧室范围内开发了整个实验室, 用于研究从蛋白质表达通过结晶学5,6,7,8.
本文报告了用氧电极系统对酶 DesB 进行厌氧纯化和动力学表征的方法。DesB 是酶细菌Sphingobium菌株 SYK-6 与 LigAB, protocatecuate 酶从同一有机体。这两种酶都属于 II. 型 protocatechuate 酶 (PCAD) 超家族, 至今尚未被广泛研究到9, 可能部分原因是由于这种超家族的酶在纯化使用标准好氧时易失活。蛋白质纯化方法。由于一些 PCAD 酶显示基质混杂, 而另一些是基板特定的2,10, 这一超家族的进一步描述是必要的, 以确定特异性决定因素。正如已经观察到的几个酶 superfamilies11,12,13,14,15, 小分子可以改变活动通过直接竞争抑制或约束分子分离构的口袋, 导致酶活性的增加或减少16。虽然动力学本身不能区分调制器的绑定位置, 但确定活动变化的大小对于理解这些影响是很重要的。因此, 在 4-nitrocatechol (4NC) 的存在下, 本机 DesB 活动的动力学特性及其活性的方法, 通常用来表征和抑制酶酶2,17的化合物,18, 显示。
DesB 可以通过 extradiol 酶 (江户) 反应, 通过氧作为基板10、19的一种催化剂, 来分解木质素衍生的芳香化合物。这种酶反应发生在木质素分解的背景下, 这是植物细胞壁上发现的一种芳香 heteropolymer。木质素可以降解, 产生多种芳香化合物, 可进一步分解成中心代谢产物3,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,29,30,31,32,33.Extradiol dioxygenases (江户) 催化在 dihydroxylated 芳香化合物上的环形开口反应, 其中裂解发生在金属协调二醇附近;相比之下, intradiol dioxygenases 在两个羟基之间进行类似的芳香化合物 (图 1)。EDOs, 像许多其他 metalloenzymes, 有一个价金属中心协调 Fe (II) 由两组氨酸, 一羧酸三联9,34,35。这些 metalloenzymes 变得氧化, 通过氧化或基于机制的失活, 而酶呈现非活动2,36,37,38。
在本手稿所描述的实验过程中, 我们利用 DesB (PCAD) 中的一名来自Sphingobium sp SYK-6 的细菌, 来催化在无食子 C4-C5 键中添加氧气 (图 2A)。这个的 regiochemistry 类似于 LigAB , 这是一个 protocatechuate - 4 , 5 - dioxygenase (图 2B) 。到目前为止, 对这个未食子酶的调查包括没有关于抑制 DesB10、19、39的化合物的报告。利用有氧纯化方法, DesB 表现出多变的活性, 而随着厌氧方法的使用, 我们能够始终如一地获得具有可再生活性的蛋白质。本文介绍的动力学研究显示了 DesB 的厌氧纯化方法、DesB 与未食子酸反应的动力学特性, 以及 4-nitrocatechol (4NC) 对 DesB 的抑制作用。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranodise</td>
			<td>Gold Bio Technologies</td>
			<td>I2481C50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;tetramethyl-ethylenediamine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylose Resin High Flow</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E8022S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) competent Escherichia coli cells</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gallic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-nitrocatechol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N15553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrous ammonium sulfate</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>5064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dithionite</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>33381-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wheaton serum bottles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-406G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm Acrodisc PF Syringe Filter with Supor Membrane</td>
			<td>Pall Corportation</td>
			<td>4187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL Amicon Stirred Cell Concentrator</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFSC40001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>76 mm Millipore Ultracel 10 kDa cutoff reconsituted cellulose membrane filter</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PLGC07610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-dithiothreitol</td>
			<td>Gold Bio Technologies</td>
			<td>DTT50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-25 coarse desalting gal column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0033-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Crimp-Top Vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-391-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph Plus Electrode Control Unit</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>OXYG1 Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Eletrode Chamber</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>DW1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Disc</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE (0.0125 mmX25mm) 30m reel</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>S4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode cleaning Kit</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>S16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spacer paper</td>
			<td>Zig Zag</td>
			<td>available at any gas station</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>He-series Dri-Lab glove box</td>
			<td>Vacuum/Atmospheres Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HE-493 Dri-Train</td>
			<td>Vacuum/Atmospheres Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-401-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>k420400-1530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L, Model 701 N SYR, Cemented NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2 syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K420401-1505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulsiflex-C5 high-pressure homogenizer</td>
			<td>Avestin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-PER Complete Bacterial Protein Extraction Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12650-88-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>7177-48-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP-1421-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP153-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP684-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G46-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

anaerobic protein purification and kinetic analysis via oxygen electrode for studying desb dioxygenase activity and inhibition

氧敏感蛋白, 包括那些利用氧作为基质的酶, 可以通过传统的有氧纯化方法, 降低稳定性。本手稿说明了厌氧净化过程中所涉及的技术细节, 包括缓冲剂和试剂的制备、手套盒中柱层析的方法, 以及动力学前蛋白质的脱盐。还介绍了制备和使用氧电极对氧利用酶进行动力学表征的方法。这些方法是使用酶酶 DesB, 一个无食子酶从细菌Sphingobium sp SYK-6。

显示的是 DesB-麦芽糖结合蛋白 (MBP) 融合结构纯化的单个组分的 SDS 页凝胶分析 (图 3)。凝胶显示蛋白质是纯净的 (兆瓦 = 91.22 kDa), 除了 DesB 的存在 (兆瓦 = 49.22 kDa) 和 MBP 蛋白质领域 (42 kDa) 互相互相劈开。选择分数 E2 和 E3 浓度 (步骤 4.2)。
DesB 动力学分析的重现性结果取决于正确的装配、校准和实验技术。?...

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Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

氧电极对 DesB 酶活性和抑制作用的厌氧蛋白纯化及动力学分析

在这里, 我们提出了一个协议的厌氧蛋白纯化, 厌氧蛋白浓度, 并随后的动力学表征使用氧电极系统。该方法用酶 DesB, 一种在厌氧环境中纯化和贮存时更稳定、更活跃的酶酶来说明。

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

该方法旨在回答无机生物化学领域中有关如何保持含有氧敏感金属的蛋白质中的酶活性的关键问题。这种技术的主要优点是，它可以帮助你可视化的方式，你可以保持蛋白质的金属在其减少状态。一般来说，这种技术的新个体将挣扎，因为很难保持材料和试剂是完全厌氧的。诱导蛋白质表达24小时后，通过离心收集细胞，每1.5升生长20毫升的阿米洛塞柱缓冲液中重新填充细菌细胞颗粒。在细胞悬浮液中加入一毫克的酶，在冰上搅拌细胞20分钟。在孵育结束时，通过高压均质化将重新暂停的细胞溶液以大约15，000 psi的三到五次通过，将蛋白质转移到50毫升的离心管中。用氮气冲洗头部空间一分钟，并离心细胞溶化，以去除不溶性碎屑。将上一液转移到至少一个 50 毫升的管中，用橡胶隔膜盖住酸盐。使用 20 量针，缓慢地将氮气冒泡通过溶液两分钟，以取代氧气。然后，用石蜡膜包裹隔膜，用铜线固定 Parafilm，然后用柱材料将上看板放入手套箱中。当溶剂就在树脂床上方时，在先前准备的 amylose 柱中，将 50 毫升的蛋白质上清液加载到柱上，以大约 5 毫升/分钟的速度在中等加压氮下以 5 毫升的馏分收集流经。当所有流流已洗净后，用另外三列卷的 amylose 列缓冲区清洗列。加入五 CV 的洗脱缓冲液，然后在中等加压氮气下在玻璃试管中手动收集三毫升馏分。使用硫酸铁铵和二硫醇测试氧存在溶液。如果存在氧气，溶液将变成深蓝色或黑色，就像右侧的管子一样。氧气的存在会导致纯化蛋白的低催化活性。含氧量最小的溶液为薰衣草或浅蓝色半透明颜色，如左侧的管子。接下来，使用外部氮线对搅拌细胞室加压，以中等搅拌速度将蛋白质浓缩到50毫升两次。然后，将蛋白质浓缩到10毫升，并通过0.45微米孔注射器过滤器过滤浓缩蛋白质。将150微升蛋白质放入单个200微升聚合酶链反应管。然后，从手套箱中取下封盖的等分，立即在液氮中闪冻，并在零下 80 摄氏度处储存。对于 DesB 脱盐，首先将 Sephadex G-25 粗脱盐凝胶的三毫升添加到 9 毫升的硅酸盐柱中，然后用两列脱盐缓冲液洗涤柱。当DesB解冻后，通过重力控制过程将纯化的蛋白质加载到柱子上，然后丢弃流经，然后将三滴蛋白质放入12瓶中，并含有大约5毫升脱盐缓冲液。要准备氧电极，请使用剪刀切割一张约 1.5 英寸方的张子纸，并在正方形的每个面上切割小三角形，并在角上用缝隙帮助包装电极。将五滴 50% 氯化钾溶液添加到电极的银阳极槽上，并将滴连接，使它们形成连续的溶液环。将两滴氯化钾溶液加入铂电极顶部，小心地将张膜放在铂电极顶部，使张气纸平滑，使无气泡。切割一块大约两英寸长的 S4 30m PTFE 膜，并放在张子纸上，去除膜的边缘，以便它们与电极的外圈对齐。使用 O 形环施用器，将小 O 形环推过电极，将空间纸和膜固定到电极上，然后将较大的 O 形环放在电极的圆形凹槽上，注意下方没有膜。将电极的顶部腔室滑到底座上，将两块拧在一起。将组装的电极放在其底座上，然后将电极连接到监控系统。要确定酶反应速率，请使用对氧敏感的克拉克型电极，通过计算机集成以测量通过电极控制单元的耗氧量。将适当体积的三叶光缓冲液加入电极腔，搅拌溶液10秒钟。10 秒后，用柱塞慢慢密封腔室，然后上下拧紧。使用干净的组织吸收从腔室中置换的多余的液体，并允许电极平衡，在那里它可以产生溶液中氧气浓度的稳定测量至少一分钟。接下来，使用气密的10微升注射器，通过柱塞向电极室添加大约一微升的酶，并收集速率数据。收集给定基板浓度的所有速率后，使用连接到侧臂真空瓶的塑料管清空电极室，并用水反复冲洗腔室四到六次循环。然后，使用新的基板浓度，在电极中设置溶液， 正如刚刚演示的。SDS-PAGE凝胶分析来自DesB-麦芽糖结合蛋白融合结构纯化的单个分数揭示了纯蛋白质产品的分离，除了 DesB 和麦芽糖结合蛋白域产品相互切割的存在。一旦所有动力学测量都完成，例如，可以通过测量不同胆汁浓度的耗氧率来获得具有胆汁的DesB活性。相反，在存在不同浓度的四硝基二醇的情况下，通过观察四硝基二醇的一毫摩尔的德百的氧消耗率降低，可以确定四硝基二醇的抑制率，例如，表明四硝基二醇抑制氧气的消耗，从而抑制了 DesB 的反应。虽然这种方法可以为研究铁依赖性二氧酶提供见解，但它可以应用于其他系统，如其他金属糖酶。不要忘记在手套箱内工作可能具有挑战性，因此在执行此技术时注意不要着急。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

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Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

科研

生物化学

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

S100A12的表达，纯化和抗菌活性

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

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原生质体在叶绿体中导入蛋白质的研究

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

全飞头段耗氧率的测定与解释

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Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

低氧环境下人巨噬细胞极化的蛋白质组学分析

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

哺乳动物细胞周期内蛋白质激酶 rna 激活的 rna 相互作用研究

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...