Name: anaerobic protein purification and kinetic analysis via oxygen electrode for studying desb dioxygenase activity and inhibition
Uploaded: 2018-10-03T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition at JoVE.com

Vi vil gerne takke Dr. Camille Keller Wesleyan University for teknisk support. Særlig tak til Professor Lindsay D. Eltis samt Jenna K. Capyk fra University of British Columbia og Christian Whitman fra University of Texas i Austin, for deres rådgivning vedrørende anaerob protein oprensning metoder og brug af en O2 -følsomme elektrode.

1. generelle materialer og metoder
<ol><li>Forberede alle nødvendige medier som beskrevet i tabel 1. Autoklave på 120 ˚C til 15 min. sterilt filtrere SOC løsning, efter tilsætning af MgCl2 og glukose, ved, at det gennem en 0,2 µm filter. PH-værdien af møllerens Lysogeny bouillon (LB media) løsning inden autoklavering. Supplere LB-Amp media løsning efter autoklavering med sterile opløsninger af 0,2 mM L-Cystein, derefter 0.1 mM jernholdige ammonium sulfat til at forbedre protein ud...

De kritiske trin i at opnå aktiv, renset DesB protein involverer dannelse og opretholde den reducerede henstå aktive site i enzymet. Som sådan, rette ydeevne af induktion, rensning, koncentration og udvanding trin er afgørende for succes at opnå aktive enzym. Inducerende protein udtryk i nærværelse af 1 mM jernholdige ammonium sulfat sikrer at henstå indgår korrekt i det aktive sted på DesB. Denne metode er inspireret af undersøgelser som dem med amidohydrolase metalloenzymer, som ofte kræver tilføjelse af m...

Enzymer, der udnytter jern eller andre metaller til at aktivere ilt er ofte modtagelige for inaktivering under rensningsprocessen på grund af deres fjernelse fra den reducerende miljø af en celle. Derfor, disse proteiner skal bruges som cellelysater, underkastes ekstern reduktionsmiddel, eller renses anaerobt for at sikre, at de har optimale enzymatisk aktivitet1,2,3,4. For de enzymer, der er er ilt-følsomme (specielt jern-holdige enzymer), udføre alle oprensning og karakterisering trin samtidig opretholde anaerobe forhold nødvendige for fuldt ud at beskrive dem. Dette har ført forskerne at udvikle hele laboratoriet set-ups inden for rammerne af anaerobe kamre for undersøgelser spænder fra protein udtryk gennem krystallografi5,6,7,8 .
Heri, rapporterer vi metoder for anaerob rensning og kinetic karakterisering af enzymet DesB ved hjælp af en ilt elektrode system. DesB er en gallate dioxygenase fra bakterien Sphingobium sp. stamme SYK-6, der er relateret til LigAB, en protocatecuate dioxygenase fra den samme organisme. Begge enzymer tilhører den type II protocatechuate dioxygenase (PCAD) superfamilien, som ikke er blevet grundigt undersøgt til dato9, sandsynligvis til dels på grund af enzymer i denne superfamilien bliver modtagelige for inaktivering når renset ved hjælp af standard aerob protein oprensning metoder. Da nogle af enzymerne, der PCAD vise substrat promiskuitet, mens andre er substrat-specifikke2,10, yderligere er karakterisering af denne superfamilien nødvendige for at identificere specificitet determinanter. Som det er blevet bemærket i flere enzym udgøres11,12,13,14,15, kan små molekyler ændre aktivitet via direkte konkurrencedygtige hæmning eller binding af molekyler til at adskille allosteriske lommer, som forårsager en stigning eller et fald i enzymaktivitet16. Mens kinetik alene ikke kan differentiere bindende placeringen af en modulator, bestemme omfanget af en ændring af aktivitet er vigtigt for at forstå effekterne. Som sådan, metoder til kinetic karakterisering af indfødte DesB aktivitet og dens aktivitet i nærværelse af 4-nitrocatechol (4NC), et stof, der er almindeligt anvendt til at karakterisere og hæmme dioxygenase enzymer2,17, 18, er vist.
DesB er i stand til at nedbryde gallate, en lignin-afledte aromatiske sammensatte, via en extradiol dioxygenase (EDO) reaktion i hvilken ring åbning er katalyseret bruger ilt som en af substrater10,19. Denne enzymatiske reaktion opstår i forbindelse med fordelingen af lignin, en aromatisk heteropolymer fundet i cellens væg af planter. Lignin kan være depolymeriseret, giver en bred vifte af aromatiske forbindelser, kan yderligere opdeles i centrale metabolitter3,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Extradiol dioxygenases (EDO) katalyserer en ring åbne reaktion på dihydroxylated aromatiske forbindelser, hvor kavalergang forekommer grænser op til en metal-koordineret diol; derimod spaltes intradiol dioxygenases analoge aromatiske forbindelser mellem de to hydroxylgrupper (figur 1). Larss, ligesom mange andre metalloenzymer, har en divalent metal center for koordinerende henstå består af en to-histidin, one-carboxylat triad9,34,35. Disse metalloenzymer blive oxideret, gennem enten autoxidation eller mekanisme-baserede inaktivering, der henviser til, at enzymet gengives inaktive2,36,37,38.
I de eksperimentelle procedurer, der beskrives i dette manuskript, udnytter vi DesB, medlem af PCAD superfamilien fra bakterien Sphingobium sp. SYK-6, til at katalysere tilsætning af ilt på tværs af C4-C5-bond af gallate (figur 2A). Regiochemistry af denne spaltning er analog med LigAB, som er en protocatechuate-4,5-dioxygenase (figur 2B). Hidtil, omfatter undersøgelser af denne gallate dioxygenase ingen rapporter om stoffer, der hæmmer DesB10,19,39. Med brug af aerobe rensning metoder udstillet DesB variable aktivitet, mens med anvendelse af anaerob metoder kunne vi konsekvent få protein med reproducerbare aktivitet. De kinetiske undersøgelser beskrevet her viser metoder for anaerob rensning af DesB, kinetic karakterisering af reaktionen fra DesB med gallate, og hæmning af DesB af 4-nitrocatechol (4NC).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranodise</td>
			<td>Gold Bio Technologies</td>
			<td>I2481C50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;tetramethyl-ethylenediamine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylose Resin High Flow</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E8022S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) competent Escherichia coli cells</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gallic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-nitrocatechol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N15553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrous ammonium sulfate</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>5064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dithionite</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>33381-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wheaton serum bottles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-406G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm Acrodisc PF Syringe Filter with Supor Membrane</td>
			<td>Pall Corportation</td>
			<td>4187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL Amicon Stirred Cell Concentrator</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFSC40001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>76 mm Millipore Ultracel 10 kDa cutoff reconsituted cellulose membrane filter</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PLGC07610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-dithiothreitol</td>
			<td>Gold Bio Technologies</td>
			<td>DTT50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-25 coarse desalting gal column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0033-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Crimp-Top Vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-391-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph Plus Electrode Control Unit</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>OXYG1 Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Eletrode Chamber</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>DW1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Disc</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE (0.0125 mmX25mm) 30m reel</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>S4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode cleaning Kit</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>S16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spacer paper</td>
			<td>Zig Zag</td>
			<td>available at any gas station</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>He-series Dri-Lab glove box</td>
			<td>Vacuum/Atmospheres Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HE-493 Dri-Train</td>
			<td>Vacuum/Atmospheres Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-401-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>k420400-1530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L, Model 701 N SYR, Cemented NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2 syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K420401-1505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulsiflex-C5 high-pressure homogenizer</td>
			<td>Avestin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-PER Complete Bacterial Protein Extraction Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12650-88-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>7177-48-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP-1421-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP153-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP684-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G46-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

anaerobic protein purification and kinetic analysis via oxygen electrode for studying desb dioxygenase activity and inhibition

Ilt-følsomme proteiner, herunder de enzymer, der anvender ilt som et substrat, kan have reduceret stabilitet, når renset ved hjælp af traditionelle aerobe rensning metoder. Dette manuskript illustrerer de tekniske detaljer i anaerob rensningsproces, herunder udarbejdelse af buffere og reagenser, metoder til kolonne kromatografi i en handskerummet, og afsaltning af protein før kinetik. Også beskrevet er metoder til at forberede og ved hjælp af en ilt elektrode til at udføre kinetic karakterisering af en ilt-udnytte enzym. Disse metoder er illustreret ved hjælp af dioxygenase enzymet DesB, gallate dioxygenase fra bakterien Sphingobium sp. stamme SYK-6.

Vist er SDS-PAGE gel analyse af enkelte fraktioner fra rensning af DesB-maltose bindende protein (MBPS) fusion konstruktion (figur 3). Gelen afslører, at proteinet er ren (MW = 91.22 kDa), bortset fra tilstedeværelsen af DesB (MW = 49.22 kDa) og MBP protein domæne (42 kDa) kløvet fra hinanden. Brøker E2 og E3 blev udvalgt til koncentration (trin 4.2).
Reproducerbare resultater fra DesB kinetic ...

Watch this Scientific Journal Video about Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition at JoVE.com

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaerob Protein oprensning og kinetisk analyse via ilt elektrode til at studere DesB Dioxygenase aktivitet og hæmning

Her præsenterer vi en protokol for anaerob protein oprensning, anaerob proteinkoncentration og efterfølgende kinetic karakterisering ved hjælp af en ilt elektrode system. Metoden er illustreret ved hjælp af enzymet DesB, en dioxygenase enzym, som er mere stabilt og aktiv, når renset og gemt i en anaerobt miljø.

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Denne metode er designet til at besvare centrale spørgsmål i marken uorganisk biokemi, om hvordan man kan opretholde enzymaktivitet i proteiner, der indeholder ilt-følsomme metaller. Den største fordel ved denne teknik er, at det hjælper dig med at visualisere måder, hvorpå du kan opretholde et proteins metal i sin reducerede tilstand. Generelt, personer nye til denne teknik vil kæmpe, fordi det er vanskeligt at vedligeholde materialer og reagenser til at være helt anaerobe.24 timer efter at have induceret proteinudtryk, indsamle cellerne ved centrifugering, og resuspend den bakterielle celle pellet i 20 milliliter amylose kolonne buffer pr 1,5 liter vækst. Tilsæt et milligram lysozym til cellesuspensionen, og rør cellerne i 20 minutter på is. Ved inkubationens afslutning skal den resuspenderede celleopløsning lyses via højtrykshomogenisering med tre til fem gennemløb ved ca. 15.000 psi, og proteinet overføres til et 50-milliliter centrifugerør.Skyl hovedrummet med nitrogen i et minut, og centrifuge cellen lysere for at fjerne det uopløselige snavs. Overfør supernatanten til mindst et 50-milliliterrør, og hætten lysatet med en gummivægge. Ved hjælp af en 20-gauge nål, langsomt boble nitrogen gas gennem opløsningen i to minutter til at fortrænge ilt.Pak derefter septum med paraffinfilm, fastgør Parafilm med kobbertråd, og læg supernatanten i handskerummet med kolonnematerialerne. Når opløsningsmidlet er lige over harpikssengen, skal der i en tidligere forberedt amylosesøjle indlæses 50 milliliter proteinsupernatant på kolonnen, hvor flowet opsamler i fem milliliterfraktioner under moderat tryk på nitrogen ved ca. fem milliliter i minuttet. Når alle flow-through er blevet eluted, vaske kolonnen med yderligere tre kolonne mængder af amylose kolonne buffer.Tilføj fem CV af elution buffer, og derefter manuelt indsamle tre-milliliter fraktioner i glas reagensglas under moderat tryk nitrogen. Test opløsningerne for ilttilstedeværelse med jernholdig ammoniumsulfat og dithiothreitol. Opløsningen bliver mørkeblå eller sort, hvis der er ilt til stede, ligesom røret til højre.Tilstedeværelsen af ilt vil resultere i renset protein med lav katalytisk aktivitet. Løsninger med minimal ilt til stede vil være lavendel eller lyseblå gennemskinnelige farve, ligesom røret til venstre. Dernæst skal du bruge en ekstern nitrogen linje til at presse den rørte celle kammer, og koncentrere proteinet til 50 milliliter ved en moderat omrøring hastighed to gange.Derefter koncentreres proteinet til 10 milliliter, og filtrer det koncentrerede protein gennem et 0,45 mikrometer-pore sprøjtefilter. Aliquot 150 mikroliter protein i individuelle 200-mikroliter polymerase kædereaktionsrør. Fjern derefter de udjævnede aliquots fra handskerummet for øjeblikkelig flash-frysning i flydende nitrogen og opbevaring ved minus 80 grader Celsius.For DesB afsaltning, først tilføje tre milliliter sephadex G-25 Grov afsaltning gel til en ni-milliliter borosilicate kolonne, og vask kolonnen med to kolonne mængder af afgasset afsalt buffer. Når DesB er optøet, indlæses det rensede protein på kolonnen via en tyngdekraftskontrolleret proces, og flowet kasseres, før der skæres tre dråber protein i hver af de 12 hætteglas med ca. fem milliliter afsaltningsbuffer. For at forberede ilt elektrode, bruge en saks til at skære en ca 1,5-tommer-kvadrat af afstandspapir, og skære små trekanter på hver side af pladsen, med slidser i hjørnerne til støtte i indpakningen af elektroden.Tilsæt fem dråber af en 50% kaliumchlorid opløsning på sølv anode rillen af elektroden, og tilslut dråberne, så de danner en kontinuerlig ring af opløsning. Tilsæt to dråber kaliumchloridopløsning til toppen af platinelektroden, og placer forsigtigt afstandspapiret oven på platinelektroden, så der ikke udjævner afstandspapiret, så der ikke er luftbobler. Skær en ca. to-tommer-lang stykke S4 30m PTFE membran, og læg den oven på afstandspapiret, fjerne kanterne af membranen, så de er på linje med den ydre ring af elektroden.Ved hjælp af en O-ring applikator skubbes en lille O-ring over elektroden for at fastgøre afstandspapiret og membranen på elektroden, og anbring en større O-ring på elektrodens cirkulære rille, idet der sikres, at der ikke er nogen membran nedenunder. Skub elektrodens øverste kammer på basen, og skru de to stykker sammen. Anstænd den samlede elektrode på soklen, og tilslut elektroden til overvågningssystemet.For at bestemme hastigheden af enzymatisk reaktion, bruge en ilt-følsomme Clark-type elektrode, med computer integration til at måle iltforbruget via elektrode styreenheden. Der tilsættes en milliliter Tris-buffer i det relevante volumen af underlaget til elektrodekammeret, og opløsningen omrøres i 10 sekunder. Efter 10 sekunder skal kammeret langsomt forsegles med stemplet, og toppen skal skrues ned.Brug et rent væv til at opsuge den overskydende væske, der forskydes fra kammeret, og lad elektroden komme i ligevægt, hvor den kan give en stabil måling af iltkoncentrationen i opløsningen i mindst et minut. Brug derefter en gastæt 10-mikrolitersprøjte til at tilføje ca. et mikrosliter af enzym til elektrodekammeret gennem stemplet og indsamle hastighedsdataene. Når hele hastigheden for en given koncentration af substratet er opsamlet, skal der anvendes et plastrør, der er forbundet med en sidearmsvakuumkolbe, til at tømme elektrodekammeret og gentagne gange skylle kammeret i fire til seks cyklusser med vand.Derefter opsæt opløsningen i elektroden som netop påvist, ved hjælp af en ny substratkoncentration. SDS-PAGE gel analyse af individuelle fraktioner fra DesB-maltose bindende protein fusion konstruere rensning afslører isolering af et rent proteinprodukt, bortset fra tilstedeværelsen af DesB og maltose bindende protein domæne produkter, der kløvet fra hinanden. Når alle kinetiske målinger er foretaget, kan desB's aktivitet med gallate f.eks.Omvendt kan hæmningshastigheden af DesB med fire-nitrocatechol bestemmes ved at observere reduktionen i iltforbruget af DesB med en millimolar gallate i nærværelse af varierende koncentrationer af fire-nitrocatechol, hvilket for eksempel indikerer, at fire-nitrocatechol hæmmer forbruget af ilt og dermed DesB-reaktionen. Selv om denne metode kan give indsigt i at studere jernholdige-afhængige dioxygenase enzymer, det kan anvendes til andre systemer, såsom andre metalloenzymer. Glem ikke, at arbejde i en handskeboks kan være udfordrende, så pas på ikke at haste, mens du udfører denne teknik.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Fremgangsmåde til at identificere småmolekylære inhibitorer af protein-protein-vekselvirkning mellem HCN1 og TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Ekspression, oprensning og antimikrobiell aktivitet af S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: et-trins affinitet rensning for den parallelle analyse af Protein-Protein og Protein-metabolit komplekser

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rensning og rekonstituering af TRPV1 for spektroskopisk analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

Effektiv rensning og LC-MS/MS-baseret analyse udvikling for ti-elleve omplantning-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Prøveudtagning og forbehandling af tand emalje carbonat for stabil Carbon og Oxygen isotop analyser

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

At studere Protein Import til grønkorn ved hjælp af Protoplasts

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Måling og fortolke ilt forbrug satser helt flyve hoved segmenter

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Proteom-analyse af menneskers makrofag polarisering Under en lav ilt miljø

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

At studere RNA Interactors af Protein Kinase RNA-aktiveret under pattedyr cellecyklus

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...