Name: anaerobic protein purification and kinetic analysis via oxygen electrode for studying desb dioxygenase activity and inhibition
Uploaded: 2018-10-03T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition at JoVE.com

ברצוננו להודות. דר ' קלר קאמי מתה האוניברסיטה לקבלת תמיכה טכנית. תודה פרופסור לינדזי ד Eltis ו ג'נה Capyk ק מ אוניברסיטת בריטיש קולומביה, וכן כריסטיאן וויטמן של אוניברסיטת טקסס באוסטין, מיוחדת על עצתם לגבי שיטות טיהור חלבונים אנאירובית ושימוש של האוריאולס2 -אלקטרודה רגיש.

1. כללי חומרים ושיטות
<ol><li>להכין בכל אמצעי התקשורת הדרושים כמתואר בטבלה 1. אוטוקלב-120 הלעפה תרוטרפמט במשך 15 דקות סטרילי לסנן את הפתרון SOC, לאחר התוספת של MgCl2 , גלוקוז, על ידי העברתו דרך מסנן 0.2 µm. להתאים את ה-pH של הטוחן פתרון מרק Lysogeny (מדיה ליברות) לפני autoclaving. תוספת הפתרון מדיה LB-Amp...

השלבים הקריטיים בהשגת חלבון DesB פעיל, מטוהרים לערב היווצרות ושמירה של האתר הפעיל Fe(II) מופחתת של האנזים. ככזה, לתקן ביצועים של אינדוקציה, היטהרות, ריכוז, desalting צעדים חיוניים להשגת בהצלחה אנזים פעיל. גרימת ביטוי חלבון בנוכחות 1 מ"מ ברזלי אמוניום סולפט מבטיחה כי Fe(II) הוא שולב בצורה נכונה האתר הפעי...

אנזימים לנצל ברזל או מתכות אחרות להפעלת חמצן רגישים לעיתים קרובות איון במהלך תהליך טיהור בגלל הוצאתם מן הסביבה תוך צמצום של תא. לכן, חלבונים אלה חייב לשמש תא lysates, יהיה נתון חיצוני צמצום סוכנים או להיטהר anaerobically כדי להבטיח כי יש להם פעילות אנזימטי אופטימלית1,2,3,4. עבור אלו אנזימים הנמצאים חמצן-רגיש (במיוחד ברזל המכיל אנזימים), ביצוע כל הפעולות לטיהור ואפיון תוך שמירה על תנאים אנאירוביים יש צורך לאפיין אותם באופן מלא. זה הוביל החוקרים לפתח המעבדה כולה set-ups בתחומיו של צ'יימברס אנאירובית ללימודים החל ביטוי חלבון באמצעות קריסטלוגרפיה5,6,7,8 .
במסמך זה, אנו מדווחים על שיטות טיהור אנאירובית ואפיון קינטי של האנזים DesB באמצעות מערכת אלקטרודה חמצן. DesB הוא dioxygenase מספר של החיידק Sphingobium sp. זן SYK-6 הקשורה ל- LigAB, dioxygenase protocatecuate מן האורגניזם באותו. שני אנזימים שייך סוג II protocatechuate dioxygenase (PCAD) superfamily אשר לא בהרחבה נחקרה עד תאריך9, ככל הנראה באופן חלקי בגלל אנזימים של זה superfamily להיות רגישים איון כאשר מטוהר באמצעות תקן אירובי שיטות טיהור חלבונים. מאז חלק אנזימים PCAD להציג את המצע הפקרות ואילו אחרים הם ספציפיים המצע2,10, נוספות אפיון superfamily הזה יש צורך לזהות גורמים ירידה לפרטים. כפי נצפתה מספר אנזימים superfamilies11,12,13,14,15, מולקולות קטנות יכול לשנות את הפעילות באמצעות עיכוב תחרותי ישירה או עקידת מולקולות להפרדה הכיסים allosteric אשר גורמת לעלייה או לירידה בפעילות אנזימטי16. בעוד קינטיקה לבד לא יכול להבדיל בין המיקום מחייב של אפנן, הקובע שסדר הגודל של שינוי פעילות חשוב להבנת ההשפעות. בתור שכזה, שיטות אפיון קינטי של פעילות DesB מקורי, פעילותה בנוכחות 4-nitrocatechol (4NC), תרכובת נפוץ כדי לאפיין ומעכבות dioxygenase אנזימים2,17, 18, מוצגים.
DesB הוא מסוגל לשבור את מספר, ליגנין-derived ארומטי במתחם, דרך לתגובה dioxygenase (אדו) extradiol בטבעת אשר הוא פתיחת מזורז באמצעות חמצן כאחת סובסטרטים10,19. כזאתי אנזימטי מתרחשת בתוך ההקשר של פירוק של ליגנין, heteropolymer ארומטי נמצאו דופן התא בצמחים. יכול להיות depolymerized ליגנין, מניב מגוון של תרכובות ארומטיות אשר ניתן עוד יותר לפרק לתוך מטבוליטים המרכזי3,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Extradiol dioxygenases (אדו) לעודד טבעת פתיחת התגובה על תרכובות ארומטיות dihydroxylated, שבו המחשוף מתרחשת בסמוך diol בתיאום מתכת; לעומת זאת, intradiol dioxygenases קליב תרכובות ארומטיות מקביל בין שתי הקבוצות הידרוקסיל (איור 1). EDOs, כמו metalloenzymes רבים אחרים, יש מרכז מתכת כלט Fe(II) תיאום מורכב של היסטידין שתיים, אחת-carboxylate שילוש9,34,35. אלה metalloenzymes להיות מחומצן, דרך autoxidation או מבוסס על מנגנון איון, ואילו האנזים מעובד אינו פעיל2,36,37,38.
בפרוצדורות ניסיוני תיאר כתב יד זה, אנו מנצלים DesB, חבר superfamily PCAD מן sp. Sphingobium החיידק SYK-6, כדי לעודד התוספת של חמצן על-פני הקשר C4-C5 של מספר (איור 2 א). Regiochemistry של פצילות הזה הוא מקביל LigAB, שהוא protocatechuate-4, 5-dioxygenase (איור 2B). עד כה, חקירות של dioxygenase מספר זה כוללות אין דיווחים על תרכובות המעכבות DesB10,19,39. עם השימוש של שיטות לטיהור אירובי, DesB הציג פעילות משתנה, בעוד עם השימוש בשיטות אנאירובית הצלחנו לקבל באופן עקבי את החלבון עם פעילות לשחזור. המחקרים קינטי המתוארים כאן מלמדים שיטות טיהור אנאירובית של DesB, אפיון קינטי של התגובה של DesB עם מספר, עיכוב של DesB על ידי 4-nitrocatechol (4NC).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranodise</td>
			<td>Gold Bio Technologies</td>
			<td>I2481C50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;tetramethyl-ethylenediamine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylose Resin High Flow</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E8022S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) competent Escherichia coli cells</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gallic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-nitrocatechol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N15553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrous ammonium sulfate</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>5064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dithionite</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>33381-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wheaton serum bottles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-406G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm Acrodisc PF Syringe Filter with Supor Membrane</td>
			<td>Pall Corportation</td>
			<td>4187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL Amicon Stirred Cell Concentrator</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFSC40001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>76 mm Millipore Ultracel 10 kDa cutoff reconsituted cellulose membrane filter</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PLGC07610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-dithiothreitol</td>
			<td>Gold Bio Technologies</td>
			<td>DTT50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-25 coarse desalting gal column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0033-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Crimp-Top Vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-391-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph Plus Electrode Control Unit</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>OXYG1 Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Eletrode Chamber</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>DW1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Disc</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE (0.0125 mmX25mm) 30m reel</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>S4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode cleaning Kit</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>S16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spacer paper</td>
			<td>Zig Zag</td>
			<td>available at any gas station</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>He-series Dri-Lab glove box</td>
			<td>Vacuum/Atmospheres Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HE-493 Dri-Train</td>
			<td>Vacuum/Atmospheres Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-401-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>k420400-1530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L, Model 701 N SYR, Cemented NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2 syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K420401-1505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulsiflex-C5 high-pressure homogenizer</td>
			<td>Avestin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-PER Complete Bacterial Protein Extraction Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12650-88-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>7177-48-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP-1421-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP153-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP684-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G46-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

anaerobic protein purification and kinetic analysis via oxygen electrode for studying desb dioxygenase activity and inhibition

חלבונים חמצן רגישים, כולל לאנזימים אשר מנצלים חמצן כמו מצע, יכול הפחיתו יציבות כאשר מטוהר בשיטות מסורתיות טיהור אירובי. כתב יד זה ממחיש את הפרטים הטכניים מעורב בתהליך טיהור אנאירובית, כולל הכנת מאגרי, ריאגנטים, השיטות עבור עמודה כרומטוגרפיה תא הכפפות, וכן את desalting של החלבון לפני קינטיקה. גם המתוארים הם השיטות להכנה של באמצעות אלקטרודה חמצן כדי לבצע אפיון קינטי של אנזים ניצול חמצן. שיטות אלו מומחשים באמצעות האנזים dioxygenase DesB, dioxygenase מספר של החיידק Sphingobium sp. זן SYK-6.

המוצג הוא ניתוח ג'ל מרחביות-דף של שברים בודדים מטיהור של הבונה פיוז'ן (איור 3) חלבון (MBP) מחייב DesB-מלטוז. הג'ל מגלה כי החלבון הוא טהור (MW = 91.22 kDa), למעט הנוכחות של DesB (MW = 49.22 kDa) ובתחום MBP חלבון (42 kDa) ביקע אחד מהשני. שברים E2 ו- E3 נבחרו ריכוז (שלב 4.2).
<p class="jove_content" fo:keep-to...

Watch this Scientific Journal Video about Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition at JoVE.com

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

חלבון אנאירובית טיהור וניתוח קינטי באמצעות אלקטרודה חמצן ללמוד DesB Dioxygenase פעילות וניגוד

כאן אנו מציגים עבור טיהור חלבון אנאירובית, ריכוז חלבון אנאירובית, ואפיון עוקבות קינטי משתמש במערכת אלקטרודה חמצן פרוטוקול. השיטה מומחש באמצעות האנזים DesB, אנזים dioxygenase אשר פעיל כאשר מטוהרים ומאוחסנים בסביבה אנאירובית ויציבה יותר.

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

שיטה זו נועדה לענות על שאלות מפתח בתחום הביוכימיה האנורגנית, על איך לשמור על פעילות אנזימים בחלבונים המכילים מתכות רגישות לחמצן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה עוזר לך לדמיין דרכים שבהן אתה יכול לשמור על המתכת של חלבון במצב מופחת שלה. בדרך כלל, אנשים חדשים בטכניקה זו יתקשו כי קשה לשמור על חומרים בריאגנטים להיות אנאירובי לחלוטין.24 שעות לאחר גרימת ביטוי חלבון, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה, ו resuspend גלולת התא החיידקי ב 20 מיליליטר של מאגר עמודת amylose לכל 1.5 ליטר של צמיחה. מוסיפים מיליגרם אחד של lysozyme להשעיית התא, ומערבבים את התאים במשך 20 דקות על קרח. בסוף הדגירה, lyse פתרון התא resuspended באמצעות הומוגניזציה בלחץ גבוה עם שלושה עד חמישה עובר בערך 15, 000 psi, ולהעביר את החלבון לצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר.לשטוף את מרחב הראש עם חנקן במשך דקה אחת, צנטריפוגה התא ליסאט כדי להסיר את הפסולת מסיסים. מעבירים את העל-טבעי לצינור אחד של 50 מיליליטר לפחות, ומכסים את ה"ליזאט" במ מחיצת גומי. באמצעות מחט 20-מד, לאט בועה גז חנקן דרך הפתרון במשך שתי דקות כדי לעקור את החמצן.לאחר מכן, לעטוף את מחיצה עם סרט פרפין, לאבטח את Parafilm עם חוט נחושת, ולמקם את supernatant לתוך תא הכפפות עם חומרי העמוד. כאשר הממס נמצא ממש מעל מיטת הרף, בעמוד אמילוס שהוכן בעבר, לטעון 50 מיליליטר של חלבון על גבי העמוד, איסוף זרימה דרך שברים חמישה מיליליטר תחת חנקן בלחץ בינוני בערך חמישה מיליליטר לדקה. כאשר כל הזרימה-דרך כבר eluted, לשטוף את העמודה עם עוד שלושה כרכים עמודות של מאגר עמודה amylose.הוסף חמישה קורות חיים של מאגר אלוטיון, ולאחר מכן לאסוף באופן ידני שברים שלושה מיליליטר במבחנות זכוכית תחת חנקן בלחץ בינוני. בדוק את הפתרונות לנוכחות חמצן עם אמוניום גופרתי ברזלי ודיתיותריתול. הפתרון יהפוך לכחול כהה או שחור אם קיים חמצן, כמו הצינור מימין.נוכחות של חמצן תגרום חלבון מטוהר עם פעילות קטליטית נמוכה. פתרונות עם כמות חמצן מינימלית יהיו צבע שקוף לבנדר או כחול בהיר, כמו הצינור בצד שמאל. לאחר מכן, השתמש בקו חנקן חיצוני כדי ללחוץ על תא התאים המעורר, ולרכז את החלבון ל-50 מיליליטר במהירות ערבוב מתונה פעמיים.לאחר מכן, לרכז את החלבון ל 10 מיליליטר, ולסנן את החלבון מרוכז באמצעות מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר-נקבובית. Aliquot 150 microliters של חלבון לתוך צינורות תגובת שרשרת פולימראז 200 מיקרוליטר בודדים. לאחר מכן, להסיר את aliquots כתרים מתיבת הכפפות להקפאת הבזק מיידית בחנקן נוזלי ואחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס.להתפלת DesB, הוסיפו תחילה שלושה מיליליטר של ג'ל התפלה גס Sephadex G-25 לעמוד בורוזיליקט של תשעה מיליליטר, ושטפו את העמודה בשני כרכים של מאגר התפלה מנוכה. כאשר DesB יש להפשיר, לטעון את החלבון המטוהר על העמוד באמצעות תהליך מבוקר כבידה, ולהשליך את הזרימה דרך לפני eluting שלוש טיפות חלבון לתוך כל אחד 12 בקבוקונים, עם כחמישה מיליליטר של חיץ התפלה. כדי להכין את אלקטרודות החמצן, השתמש במספריים כדי לחתוך אחד בערך 1.5 אינץ 'ריבוע של נייר רווח, לחתוך משולשים קטנים על כל פנים של הריבוע, עם חריצים בפינות כדי לסייע בעטיפה של האלקטרודה.הוסף חמש טיפות של תספורת כלוריד אשלגן 50% על חריץ אנודה כסף של האלקטרודה, ולחבר את הטיפות כך שהם יוצרים טבעת רציפה של פתרון. מוסיפים שתי טיפות של תספורת האשלגן כלורי לחלק העליון של אלקטרודה פלטינה, בזהירות למקם את נייר החלל על גבי אלקטרודה פלטינה, מחליק את נייר החלל כך שאין בועות אוויר. חותכים חתיכה באורך של כ-2 אינץ' של קרום S4 30m PTFE, וממקמים אותו על גבי נייר החלל, מסירים את קצות הממברנה כך שהם מיושרים עם הטבעת החיצונית של האלקטרודה.באמצעות מוליך O-ring, לדחוף O-טבעת קטנה מעל האלקטרודה כדי לאבטח את נייר החלל ואת הממברנה על האלקטרודה, ולהציב O-ring גדול יותר על החריץ המעגלי של האלקטרודה, דואג כי אין קרום מתחת. החלק את התא העליון של האלקטרודה אל הבסיס, ולבורג את שני החלקים יחד. מניחים את האלקטרודה שהורכבה על בסיסה, ולחבר את האלקטרודה למערכת הניטור.כדי לקבוע את קצב התגובה האנזימטית, השתמש באלקטרודה מסוג קלארק הרגישה לחמצן, עם אינטגרציה ממוחשבת כדי למדוד את צריכת החמצן באמצעות יחידת בקרת האלקטרודה. מוסיפים מיליליטר אחד של חיץ טריס בנפח המתאים של המצע לתא האלקטרודה, ומערבבים את הפתרון במשך 10 שניות. לאחר 10 שניות, לאט לאט לאט לאט את התא עם הבוכנה, ולבורג את החלק העליון למטה.השתמשו ברקמה נקייה כדי לספוג את הנוזל העודף שנעקרו מהתא, ולאפשר לאלקטרודה לצייד היכן שהיא יכולה לייצר מדידה יציבה של ריכוז החמצן בתסרון למשך דקה אחת לפחות. לאחר מכן, השתמש במזרק 10 מיקרוליטר הדוק לגז כדי להוסיף כמיקרוליטר אחד של אנזים לתא האלקטרודה דרך הבוכנה, ולאסוף את נתוני הקצב. כאשר נאסף כל הקצב לריכוז מצע נתון, השתמש בצינור פלסטיק המחובר לבקבוק ואקום זרוע צדדית כדי לרוקן את תא האלקטרודה, ושטף שוב ושוב את התא במשך ארבעה עד שישה מחזורים במים.לאחר מכן, להגדיר את הפתרון באלקטרודה כפי שהוכח רק, באמצעות ריכוז מצע חדש. ניתוח ג'ל SDS-PAGE של שברים בודדים וטיהור מבנה חלבון מחייב DesB-maltose חושף את הבידוד של מוצר חלבון טהור, מלבד נוכחותם של מוצרי דומיין חלבון מחייב DesB ומלטוז שנבלבו זה מזה. לאחר כל המדידות הקינטיות נלקחו, הפעילות של DesB עם gallate, למשל, ניתן להשיג על ידי מדידת קצב צריכת החמצן בריכוזי גאלט משתנים.לעומת זאת, שיעור העיכוב של DesB עם ארבעה nitrocatechol ניתן לקבוע על ידי התבוננות בירידה בקצב צריכת החמצן של DesB עם gallate מילימולר אחד בנוכחות ריכוזים משתנים של ארבעה nitrocatechol, המציין, למשל, כי ארבעה nitrocatechol מעכב את צריכת החמצן ובכך את תגובת DesB. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לחקר אנזימי dioxygenase תלוי ברזל, זה יכול להיות מיושם על מערכות אחרות, כגון metalloenzymes אחרים. אל תשכח כי עבודה בתוך תא כפפות יכול להיות מאתגר, אז לדאוג לא למהר בעת ביצוע טכניקה זו.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

שיטה לזיהוי מולקולה קטנה מעכבים של האינטראקציה בין החלבונים בין HCN1 ו TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

הביטוי, טיהור, פעילות אנטי מיקרוביאלית של S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 ב 1: בשלב אחד טיהור זיקה לניתוח מקבילים של חלבון, מתחמי חלבון-מטבוליט

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

טיהור, בנייתו מחדש של TRPV1 לניתוח Spectroscopic

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

טיהור יעיל ופיתוח Assay LC-MS/MS-מבוסס על 10-11 טרנסלוקציה-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

דגימה רעלני של זגוגית השן פחמתי פחמן יציב וניתוח איזוטופ החמצן

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

לומד חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט באמצעות Protoplasts

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

מדידת ופרשנות חמצן קצב הצריכה כולה לטוס הראש מקטעים

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

ניתוח פרוטיאומיה מבנית של קיטוב מקרופאג האנושי תחת סביבה חמצן נמוך

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

לומד RNA Interactors של חלבון ה-RNA-מופעל במהלך מחזור התא בתרבית

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...