Name: anaerobic protein purification and kinetic analysis via oxygen electrode for studying desb dioxygenase activity and inhibition
Uploaded: 2018-10-03T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition at JoVE.com

हम तकनीकी सहायता के लिए Wesleyan विश्वविद्यालय के डॉ केमिली केलर का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । प्रोफेसर लिंडसे Eltis और Jenna K Capyk ब्रिटिश कोलंबिया के विश्वविद्यालय से विशेष धंयवाद, साथ ही साथ ईसाई Whitman ऑस्टिन में टेक्सास विश्वविद्यालय से, उनकी सलाह के लिए anaerobic प्रोटीन शोधन विधियों के बारे में और एक O 2 का उपयोग -संवेदनशील इलेक्ट्रोड ।

1. सामांय सामग्री और तरीके
<ol><li>तालिका 1में बताए गए अनुसार सभी आवश्यक मीडिया तैयार करें । आटोक्लेव पर १२० ˚ C 15 min. बाँझ फिल्टर समाज समाधान के लिए, MgCl2 और ग्लूकोज के अलावा के बाद, यह एक ०.२ µm फिल्टर के मा...

सक्रिय, शुद्ध DesB प्रोटीन प्राप्त करने में महत्वपूर्ण कदम के गठन और कम Fe (द्वितीय) एंजाइम में सक्रिय साइट के बनाए रखने शामिल है । इस तरह के रूप में, प्रेरण, शुद्धि, एकाग्रता के सही प्रदर्शन, और लवण कदम सफलताप...

एंजाइमों कि लौह या अंय धातुओं का उपयोग ऑक्सीजन को सक्रिय करने के लिए अक्सर एक सेल के वातावरण को कम करने से उनके हटाने की वजह से शोधन प्रक्रिया के दौरान निष्क्रियता के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं । इसलिए, इन प्रोटीन सेल lysates के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए, बाहरी कम एजेंटों के अधीन हो, या शुद्ध anaerobically के लिए सुनिश्चित करें कि वे इष्टतम एंजाइमी गतिविधि है1,2,3,4। उन एंजाइमों कि ऑक्सीजन के प्रति संवेदनशील है के लिए (विशेष रूप से लौह युक्त एंजाइमों), सभी शुद्धि और लक्षण वर्णन कदम प्रदर्शन करते हुए anaerobic स्थितियों को बनाए रखने के लिए पूरी तरह से उन्हें विशेषताएं आवश्यक है. यह शोधकर्ताओं ने क्रि5,6,7,8 के माध्यम से प्रोटीन अभिव्यक्ति से लेकर अध्ययन के लिए anaerobic कक्षों के दायरे में पूरी प्रयोगशाला सेट अप विकसित करने के लिए नेतृत्व किया है .
इस के साथ साथ, हम anaerobic शुद्धि और एंजाइम DesB एक ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड प्रणाली का उपयोग कर के काइनेटिक लक्षण वर्णन के लिए तरीके की रिपोर्ट । DesB जीवाणु Sphingobium सपा से एक gallate dioxygenase है । तनाव SYK-6 जो LigAB से संबंधित है, वही जीव से एक protocatecuate dioxygenase है । दोनों एंजाइमों प्रकार द्वितीय protocatechuate dioxygenase (PCAD) superfamily जो बड़े पैमाने पर9तारीख को अध्ययन नहीं किया गया है रहे हैं, इस superfamily के एंजाइमों के कारण भाग में होने की संभावना निष्क्रियता के लिए अतिसंवेदनशील जब मानक एरोबिक का उपयोग शुद्ध प्रोटीन शुद्धिकरण के तरीके । के बाद से कुछ PCAD एंजाइमों सब्सट्रेट अभेद के प्रदर्शन जबकि अन्य सब्सट्रेट-विशिष्ट2,10, इस superfamily के आगे लक्षण वर्णन विशिष्ट निर्धारकों की पहचान करने के लिए आवश्यक है. के रूप में कई एंजाइम superfamilies11,12,13,14,15में मनाया गया है, छोटे अणुओं प्रत्यक्ष प्रतिस्पर्धी निषेध या के बंधन के माध्यम से गतिविधि में परिवर्तन कर सकते है अणु allosteric जेब जो वृद्धि या एंजाइमी गतिविधि16में कमी का कारण बनता है अलग करने के लिए । जबकि अकेले कैनेटीक्स एक मॉडुलन के बंधन स्थान अंतर नहीं कर सकते, एक गतिविधि परिवर्तन के परिमाण का निर्धारण प्रभाव को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. इस तरह के रूप में, मूल DesB गतिविधि और 4 की उपस्थिति में अपनी गतिविधि के काइनेटिक लक्षण वर्णन के लिए तरीके-nitrocatechol (4NC), एक यौगिक सामांयतः विशेषताएं और dioxygenase एंजाइमों को बाधित करने के लिए इस्तेमाल किया2,17, 18, दिखाया गया है ।
DesB नीचे gallate, एक lignin सुगंधित यौगिक को तोड़ने में सक्षम है, एक extradiol dioxygenase (ईदो) प्रतिक्रिया के माध्यम से जिसमें अंगूठी खोलने सब्सट्रेट10,19में से एक के रूप में ऑक्सीजन का उपयोग कर catalyzed है । यह एंजाइमी प्रतिक्रिया lignin के टूटने के संदर्भ में होती है, पौधों की कोशिका दीवार में एक खुशबूदार heteropolymer पाया जाता है । Lignin, सुगंधित यौगिकों कि आगे केंद्रीय चयापचयों3,20,21,22,23,24 में टूट सकता है की एक किस्म उपज हो सकता है ,25,26,27,28,29,30,31,३२,३३ . Extradiol dioxygenases (ईदो) उत्प्रेरित dihydroxylated खुशबूदार यौगिकों पर एक अंगूठी खोलने प्रतिक्रिया है, जहां दरार एक धातु-समंवित दिओल से सटे होता है; इसके विपरीत, intradiol dioxygenases दो हाइड्रॉक्सिल समूहों (चित्रा 1) के बीच अनुरूप खुशबूदार यौगिकों सट । EDOs, कई अंय metalloenzymes की तरह, Fe समंवय के लिए एक divalent धातु केंद्र (द्वितीय) एक दो histidine, एक-carboxylate त्रय9,३४,३५से बना है । इन metalloenzymes ऑक्सीकरण हो जाते हैं, या तो autoxidation या तंत्र आधारित निष्क्रियता के माध्यम से, जबकि एंजाइम निष्क्रिय2,३६,३७,३८प्रदान की गई है ।
इस पांडुलिपि में वर्णित प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं में, हम DesB, जीवाणु Sphingobium sp से PCAD superfamily के एक सदस्य का उपयोग । SYK-6, उत्प्रेरित (चित्रा 2a) की C4-C5 बॉन्ड भर में ऑक्सीजन के अलावा gallate । इस क्लीवेज की regiochemistry LigAB के अनुरूप है, जो एक protocatechuate-4, 5-dioxygenase (figure 2बी) है । इस प्रकार अब तक, इस gallate dioxygenase की जांच यौगिकों कि DesB10,19,३९को बाधित की कोई रिपोर्ट शामिल हैं । एरोबिक शुद्धि तरीकों के उपयोग के साथ, DesB चर गतिविधि का प्रदर्शन किया, जबकि anaerobic तरीकों के उपयोग के साथ हम लगातार reproducible गतिविधि के साथ प्रोटीन प्राप्त करने में सक्षम थे । काइनेटिक अध्ययन यहां वर्णित DesB के anaerobic शुद्धि, gallate के साथ DesB की प्रतिक्रिया के काइनेटिक लक्षण वर्णन के लिए तरीके दिखाने के लिए, और 4 द्वारा DesB के निषेध-nitrocatechol (4NC) ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranodise</td>
			<td>Gold Bio Technologies</td>
			<td>I2481C50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;tetramethyl-ethylenediamine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylose Resin High Flow</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E8022S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) competent Escherichia coli cells</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gallic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-nitrocatechol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N15553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrous ammonium sulfate</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>5064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dithionite</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>33381-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wheaton serum bottles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-406G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm Acrodisc PF Syringe Filter with Supor Membrane</td>
			<td>Pall Corportation</td>
			<td>4187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL Amicon Stirred Cell Concentrator</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFSC40001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>76 mm Millipore Ultracel 10 kDa cutoff reconsituted cellulose membrane filter</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PLGC07610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-dithiothreitol</td>
			<td>Gold Bio Technologies</td>
			<td>DTT50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-25 coarse desalting gal column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0033-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Crimp-Top Vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-391-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph Plus Electrode Control Unit</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>OXYG1 Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Eletrode Chamber</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>DW1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Disc</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE (0.0125 mmX25mm) 30m reel</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>S4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode cleaning Kit</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>S16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spacer paper</td>
			<td>Zig Zag</td>
			<td>available at any gas station</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>He-series Dri-Lab glove box</td>
			<td>Vacuum/Atmospheres Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HE-493 Dri-Train</td>
			<td>Vacuum/Atmospheres Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-401-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>k420400-1530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L, Model 701 N SYR, Cemented NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2 syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K420401-1505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulsiflex-C5 high-pressure homogenizer</td>
			<td>Avestin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-PER Complete Bacterial Protein Extraction Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12650-88-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>7177-48-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP-1421-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP153-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP684-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G46-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

anaerobic protein purification and kinetic analysis via oxygen electrode for studying desb dioxygenase activity and inhibition

ऑक्सीजन के प्रति संवेदनशील प्रोटीन, उन एंजाइमों जो एक सब्सट्रेट के रूप में ऑक्सीजन का उपयोग सहित, स्थिरता कम हो सकता है जब पारंपरिक एरोबिक शुद्धि तरीकों का उपयोग कर शुद्ध । इस पांडुलिपि में anaerobic शुद्धिकरण प्रक्रिया में शामिल तकनीकी विवरणों को दर्शाया गया है, जिसमें बफ़र्स और रिएजेंट्स की तैयारी, एक दस्ताने बॉक्स में स्तंभ क्रोमैटोग्राफी के लिए विधियाँ, और प्रोटीन के कैनेटीक्स से पहले के लिए तरीके हैं । इसके अलावा तैयार करने के लिए और एक ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड का उपयोग करने के लिए एक ऑक्सीजन का उपयोग एंजाइम का काइनेटिक लक्षण प्रदर्शन करने के लिए तरीके हैं । ये विधियां dioxygenase एंजाइम DesB, जीवाणु Sphingobium sp से एक gallate dioxygenase का उपयोग करके सचित्र हैं । तनाव SYK-6 ।

दिखाया गया है एसडीएस-पृष्ठ जेल विश्लेषण DesB-माल्टोज़ बाइंडिंग प्रोटीन (MBP) संलयन निर्माण (चित्रा 3) के शोधन से व्यक्तिगत अंशों का है । जेल से पता चलता है कि प्रोटीन शुद्ध है (मेगावाट = ...

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Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaerobic प्रोटीन शुद्धि और काइनेटिक विश्लेषण DesB Dioxygenase गतिविधि और संकोच का अध्ययन करने के लिए ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड के माध्यम से

यहां हम anaerobic प्रोटीन शुद्धि के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान, anaerobic प्रोटीन एकाग्रता, और बाद में काइनेटिक लक्षण वर्णन एक ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड प्रणाली का उपयोग कर । विधि एंजाइम DesB, एक dioxygenase एंजाइम जो अधिक स्थिर और सक्रिय जब शुद्ध और एक anaerobic वातावरण में संग्रहीत है का उपयोग कर सचित्र है ।

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

इस विधि को क्षेत्र अकार्बनिक जैव रसायन में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने के लिए डिज़ाइन किया गया है, के बारे में कैसे प्रोटीन में एंजाइम गतिविधि को बनाए रखने के लिए कि ऑक्सीजन के प्रति संवेदनशील धातुओं होते हैं । इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह आपको उन तरीकों की कल्पना करने में मदद करता है जिनमें आप अपनी कम स्थिति में प्रोटीन की धातु को बनाए रख सकते हैं। आम तौर पर, इस तकनीक के लिए नए व्यक्ति संघर्ष करेंगे क्योंकि सामग्री और अभिकर्णों को पूरी तरह से अवायवीय बनाए रखना मुश्किल है।प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के 24 घंटे बाद, अपकेंद्री द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें, और 1.5 लीटर विकास के प्रति एमीलोज कॉलम बफर के 20 मिलीलीटर में बैक्टीरियल सेल पेलेट को फिर से खर्च करें। कोशिका निलंबन के लिए lysozyme के एक मिलीग्राम जोड़ें, और बर्फ पर 20 मिनट के लिए कोशिकाओं हलचल । इनक्यूबेशन के अंत में, लगभग 15, 000 साई में तीन से पांच पास के साथ उच्च दबाव समरूपता के माध्यम से पुनर् निलंबित सेल समाधान lyse, और एक ५० मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए प्रोटीन हस्तांतरण ।एक मिनट के लिए नाइट्रोजन के साथ हेडस्पेस फ्लश, और अघुलनशील मलबे को हटाने के लिए सेल lysate अपकेंद्रित्र । सुपरनेट को कम से कम एक 50-मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें, और एक रबर पट के साथ lysate को कैप करें। एक 20 गेज सुई का उपयोग करना, धीरे से दो मिनट के लिए समाधान के माध्यम से नाइट्रोजन गैस बुलबुला ऑक्सीजन विस्थापित करने के लिए ।फिर, पैराफिन फिल्म के साथ पट लपेटें, तांबे के तार के साथ पैराफिल्म को सुरक्षित करें, और सुपरनैंट को कॉलम सामग्रियों के साथ दस्ताने बॉक्स में रखें। जब विलायक राल बिस्तर के ठीक ऊपर होता है, तो पहले से तैयार एमीलोज कॉलम में, कॉलम पर प्रोटीन सुपरनिटर के 50 मिलीलीटर लोड करें, लगभग पांच मिलीलीटर प्रति मिनट पर मामूली दबाव वाले नाइट्रोजन के तहत पांच मिलीलीटर अंशों में प्रवाह का संग्रह करें। जब सभी प्रवाह के माध्यम से eluted किया गया है, एमीलोज कॉलम बफर के एक और तीन कॉलम संस्करणों के साथ कॉलम धो ।एल्यूशन बफर के पांच सीवी जोड़ें, और फिर मैन्युअल रूप से मामूली दबाव नाइट्रोजन के तहत ग्लास टेस्ट ट्यूबों में तीन मिलीलीटर अंश इकट्ठा करें। फेरस अमोनियम सल्फेट और डिइयोथरेटोल के साथ ऑक्सीजन उपस्थिति के लिए समाधानों का परीक्षण करें। समाधान गहरे नीले या काले रंग की बारी अगर ऑक्सीजन मौजूद है, सही पर ट्यूब की तरह होगा ।ऑक्सीजन की उपस्थिति कम उत्प्रेरक गतिविधि के साथ शुद्ध प्रोटीन में परिणाम होगा। न्यूनतम ऑक्सीजन मौजूद के साथ समाधान लैवेंडर या हल्के नीले पारदर्शी रंग होंगे, बाईं ओर ट्यूब की तरह। इसके बाद, उभारा सेल चैंबर दबाव बनाने के लिए एक बाहरी नाइट्रोजन लाइन का उपयोग करें, और प्रोटीन को दो बार मध्यम सरगर्मी गति से 50 मिलीलीटर पर केंद्रित करें।फिर, प्रोटीन को 10 मिलीलीटर पर केंद्रित करें, और 0.45 माइक्रोमीटर-पोर सिरिंज फिल्टर के माध्यम से केंद्रित प्रोटीन को फ़िल्टर करें। अलीकोट 150 माइक्रोलीटर प्रोटीन को व्यक्तिगत 200-माइक्रोलीटर पॉलीमरेज चेन रिएक्शन ट्यूब में। फिर, तरल नाइट्रोजन और भंडारण में तत्काल फ्लैश-फ्रीजिंग के लिए दस्ताने बॉक्स से शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर छाया हुआ एलिकोट्स हटा दें।डेस्ब डेसाल्टिंग के लिए, पहले सेपडेक्स जी-25 मोटे डेसाल्टिंग जेल के तीन मिलीलीटर को नौ मिलीलीटर बोरोसिलिकेट कॉलम में जोड़ें, और कॉलम को दो कॉलम वॉल्यूम ऑफ डेगासेड डेसाल्ट बफर के साथ धोएं। जब डेस्ब गल गया है, एक गुरुत्वाकर्षण नियंत्रित प्रक्रिया के माध्यम से स्तंभ पर शुद्ध प्रोटीन लोड, और प्रवाह के माध्यम से त्यागने से पहले 12 शीशियों में से प्रत्येक में प्रोटीन की तीन बूंदें eluting, desalting बफर के लगभग पांच मिलीलीटर के साथ । ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड तैयार करने के लिए, एक लगभग १.५ इंच-स्पेसर पेपर के वर्ग में कटौती करने के लिए कैंची का उपयोग करें, और वर्ग के प्रत्येक चेहरे पर छोटे त्रिकोण में कटौती, कोनों में slits के साथ इलेक्ट्रोड के लपेटन में सहायता करने के लिए ।इलेक्ट्रोड के सिल्वर एनोड नाली पर 50% पोटेशियम क्लोराइड समाधान की पांच बूंदें जोड़ें, और बूंदों को कनेक्ट करें ताकि वे समाधान की एक निरंतर अंगूठी बनाएं। प्लेटिनम इलेक्ट्रोड के शीर्ष पर पोटेशियम क्लोराइड समाधान की दो बूंदें जोड़ें, और ध्यान से प्लैटिनम इलेक्ट्रोड के शीर्ष पर स्पेसर पेपर रखें, स्पेसर पेपर को चौरसाई करें ताकि कोई हवा के बुलबुले न हों। S4 30m PTFE झिल्ली के लगभग दो इंच लंबे टुकड़े को काटें, और इसे स्पेसर पेपर के शीर्ष पर रखें, झिल्ली के किनारों को हटा दें ताकि वे इलेक्ट्रोड की बाहरी अंगूठी के साथ गठबंधन कर सकें।ओ-रिंग एप्लिकेटर का उपयोग करके, इलेक्ट्रोड पर स्पेसर पेपर और झिल्ली को सुरक्षित करने के लिए इलेक्ट्रोड पर एक छोटी ओ-रिंग पुश करें, और इलेक्ट्रोड के परिपत्र नाली पर एक बड़ा ओ-रिंग रखें, इस बात का ख्याल रखते हुए कि नीचे कोई झिल्ली न हो। इलेक्ट्रोड के शीर्ष कक्ष को आधार पर स्लाइड करें, और दो टुकड़ों को एक साथ पेंच करें। इकट्ठे इलेक्ट्रोड को उसके बेस पर रखें, और इलेक्ट्रोड को मॉनिटरिंग सिस्टम से कनेक्ट करें।एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया की दर निर्धारित करने के लिए, इलेक्ट्रोड नियंत्रण इकाई के माध्यम से ऑक्सीजन की खपत को मापने के लिए कंप्यूटर एकीकरण के साथ ऑक्सीजन के प्रति संवेदनशील क्लार्क-प्रकार इलेक्ट्रोड का उपयोग करें। इलेक्ट्रोड कक्ष में सब्सट्रेट की उचित मात्रा में ट्रिस बफर का एक मिलीलीटर जोड़ें, और 10 सेकंड के लिए समाधान को हिलाएं। 10 सेकंड के बाद, धीरे-धीरे प्लंजर के साथ कक्ष को सील करें, और ऊपर से नीचे पेंच करें।कक्ष से विस्थापित अतिरिक्त तरल को सोखने के लिए एक साफ ऊतक का उपयोग करें, और इलेक्ट्रोड को संतुलन बनाने की अनुमति दें जहां यह कम से कम एक मिनट के लिए समाधान में ऑक्सीजन एकाग्रता का एक स्थिर माप पैदा कर सकता है। इसके बाद, एक गैस-टाइट, 10-माइक्रोलीटर सिरिंज का उपयोग प्लंजर के माध्यम से इलेक्ट्रोड चैंबर में एंजाइम के लगभग एक माइक्रोलीटर को जोड़ने के लिए, और दर डेटा एकत्र करें। जब किसी दिए गए सब्सट्रेट एकाग्रता के लिए सभी दर एकत्र की गई है, तो इलेक्ट्रोड चैंबर को खाली करने के लिए साइड-आर्म वैक्यूम फ्लास्क से जुड़ी प्लास्टिक ट्यूब का उपयोग करें, और बार-बार पानी के साथ चार से छह चक्रों के लिए कक्ष को कुल्ला करें।फिर, एक नई सब्सट्रेट एकाग्रता का उपयोग करके, इलेक्ट्रोड में समाधान स्थापित करें, जैसा कि सिर्फ प्रदर्शन किया गया था। डेस्ब-माल्टोज बाइंडिंग प्रोटीन फ्यूजन निर्माण शुद्धिकरण से व्यक्तिगत अंशों का एसडीएस-पेज जेल विश्लेषण एक शुद्ध प्रोटीन उत्पाद के अलगाव का पता चलता है, एक अलग डेसबी और माल्टोस बाध्यकारी प्रोटीन डोमेन उत्पादों की उपस्थिति के लिए जो एक दूसरे से क्लीव्ड करते हैं। एक बार सभी गतिज माप ले लिया गया है, उदाहरण के लिए, गैलेट के साथ DesB की गतिविधि, अलग गैलेट सांद्रता में ऑक्सीजन की खपत की दर को मापने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है ।इसके विपरीत, चार-नाइट्रोकाटेकोल के साथ डेस्ब के अवरोध की दर चार-नाइट्रोकाटेकोल की अलग-अलग सांद्रता की उपस्थिति में एक-मिलीमोलर गैलेट के साथ डेस्ब की ऑक्सीजन खपत दर में कमी को देख कर निर्धारित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, यह दर्शाता है कि चार-नाइट्रोकाटेकोल ऑक्सीजन की खपत को रोकता है और इस तरह डेस्ब प्रतिक्रिया। हालांकि यह विधि फेरस-निर्भर डाइऑक्सिजन एंजाइमों का अध्ययन करने के लिए अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है, इसे अन्य प्रणालियों जैसे अन्य धातुलोएंज़ीम पर लागू किया जा सकता है। यह न भूलें कि दस्ताने बॉक्स के भीतर काम करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है, इसलिए इस तकनीक को निष्पादित करते समय जल्दबाजी न करें।

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