Name: anaerobic protein purification and kinetic analysis via oxygen electrode for studying desb dioxygenase activity and inhibition
Uploaded: 2018-10-03T14:45:00
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Vorremmo ringraziare la dottoressa Camille Keller di Wesleyan University per il supporto tecnico. Grazie professore Lindsay D. Eltis e Jenna K. Capyk dalla University of British Columbia, come pure Christian Whitman dall'Università del Texas ad Austin, speciale per i loro consigli per quanto riguarda i metodi di purificazione della proteina anaerobica e l'utilizzo di un O2 -elettrodo sensibile.

1. generale materiali e metodi
<ol><li>Preparare tutti i mezzi necessari come descritto nella tabella 1. Sterilizzare in autoclave a 120 ° c per 15 min. Sterile filtrare la soluzione SOC, dopo l'aggiunta di MgCl2 e glucosio, facendolo passare attraverso un filtro da 0,2 µm. Regolare il pH della soluzione di brodo Lisogenesi (LB media) del Mugnaio prima della sterilizzazione in autoclave. Integrare la soluzione media LB-Amp dopo sterilizzazione in autoclave con soluzioni sterili di 0,2 mM L...

I passaggi critici nell'ottenere attiva, purificata proteina Giuroma90 coinvolgono la formazione e il mantenimento del sito attivo Fe (II) ridotto nell'enzima. Come tale, correggere le prestazioni dell'induzione, purificazione, concentrazione e dissalazione passaggi sono essenziali per ottenere con successo enzima attivo. Che induce l'espressione della proteina in presenza di solfato ferroso dell'ammonio di 1 mM assicura che Fe (II) correttamente è incorporato nel sito attivo del Giuroma90. Questo metodo è ispirato da ...

Enzimi che utilizzano ferro o altri metalli per attivare ossigeno sono spesso suscettibili di inattivazione durante il processo di purificazione a causa della loro rimozione dall'ambiente riducente di una cella. Di conseguenza, queste proteine devono essere utilizzate come lisati cellulari, essere sottoposte agli agenti riducenti esterni o essere purificate anaerobicamente per garantire che essi hanno attività enzimatica ottimale1,2,3,4. Per quegli enzimi che sono sensibili all'ossigeno (in particolare ferro-contenenti enzimi), esecuzione di tutte le fasi di purificazione e caratterizzazione mantenendo condizioni anaerobiche sono necessario caratterizzare completamente loro. Questo ha portato i ricercatori a sviluppare configurazioni intero laboratorio entro i confini di anaerobiche alloggiamenti per gli studi che vanno dall'espressione della proteina attraverso cristallografia5,6,7,8 .
Qui, segnaliamo i metodi per la purificazione anaerobica e caratterizzazione cinetica dell'enzima Giuroma90 utilizzando un sistema di elettrodi di ossigeno. Giuroma90 è un dioxygenase di gallato del batterio Sphingobium ceppo SP. SYK-6 che è legato al LigAB, un dioxygenase di protocatecuate dallo stesso organismo. Entrambi gli enzimi appartengono alla superfamiglia di diossigenasi (PCAD) tipo II protocatecuato che non è stata studiata estesamente a data9, probabilmente in parte a causa di enzimi di questa superfamiglia essendo suscettibile di inattivazione quando purificato utilizzando standard aerobica metodi di purificazione della proteina. Poiché alcuni degli enzimi PCAD visualizzare promiscuità di substrato, mentre altri sono substrato specifico2,10, ulteriore caratterizzazione di questa superfamiglia è necessario individuare fattori determinanti di specificità. Come è stato osservato in diversi enzimi superfamilies11,12,13,14,15, piccole molecole possono alterare attività tramite inibizione competitiva diretta o l'associazione di molecole per separare le tasche allosterici che causa un aumento o diminuzione di attività enzimatica16. Mentre cinetica da solo non può distinguere il percorso di associazione di un modulatore, determinare la grandezza di un cambiamento di attività è importante per comprendere gli effetti. Come tali, metodi per la caratterizzazione cinetica di attività nativa di Giuroma90 e la sua attività in presenza di 4-nitrocatechol (4NC), un composto comunemente utilizzato per caratterizzare e inibire diossigenasi enzimi2,17, 18, sono mostrati.
Giuroma90 è in grado di abbattere gallato, un composto, tramite una reazione di diossigenasi (EDO) extradiol in quale anello di apertura è catalizzata usando ossigeno come uno dei substrati10,19lignina-derivato aromatico. Questa reazione enzimatica si verifica all'interno del contesto della ripartizione della lignina, un aromatico heteropolymer trovato nella parete cellulare delle piante. Lignina può essere depolimerizzato, producendo una varietà di composti aromatici che può essere suddiviso in metaboliti centrale3,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Extradiol diossigenasi (EDO) catalizzano un reazione su composti aromatici dihydroxylated, cui scissione si verifica adiacente un diolo metallo-coordinato; di apertura dell'anello al contrario, intradiol diossigenasi fendono analoghi composti aromatici tra i due gruppi di idrossile (Figura 1). Evandri, come molti altri metalloenzymes, dispone di un centro di metalli bivalente per coordinamento Fe (II) composto da una due-istidina, uno-carbossilato triade9,34,35. Questi metalloenzimi ossidarsi, tramite autossidazione o basati sul meccanismo di inattivazione, considerando che l'enzima è reso inattivo2,36,37,38.
Nelle procedure sperimentali descritte in questo manoscritto, utilizziamo Giuroma90, un membro della superfamiglia PCAD da SYK-6, il batterio Sphingobium SP., per catalizzare l'aggiunta di ossigeno attraverso il legame C4-C5 di gallato (Figura 2A). La regiochimica di questa scissione è analoga a LigAB, che è un protocatecuato-4,5-diossigenasi (Figura 2B). Finora, le indagini di questo diossigenasi gallate non includono nessun rapporti di composti che inibiscono la Giuroma9010,19,39. Con l'uso di metodi di depurazione aerobica, Giuroma90 ha esibito l'attività variabile, mentre con l'uso di metodi anaerobici siamo riusciti a ottenere costantemente proteina con attività riproducibile. Gli studi cinetici descritti qui mostrano i metodi per la purificazione anaerobica di Giuroma90, caratterizzazione cinetica della reazione di Giuroma90 con gallato e l'inibizione di Giuroma90 di 4-nitrocatechol (4NC).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranodise</td>
			<td>Gold Bio Technologies</td>
			<td>I2481C50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;tetramethyl-ethylenediamine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylose Resin High Flow</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E8022S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) competent Escherichia coli cells</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gallic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-nitrocatechol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N15553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrous ammonium sulfate</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>5064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dithionite</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>33381-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wheaton serum bottles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-406G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm Acrodisc PF Syringe Filter with Supor Membrane</td>
			<td>Pall Corportation</td>
			<td>4187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL Amicon Stirred Cell Concentrator</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFSC40001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>76 mm Millipore Ultracel 10 kDa cutoff reconsituted cellulose membrane filter</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PLGC07610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-dithiothreitol</td>
			<td>Gold Bio Technologies</td>
			<td>DTT50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-25 coarse desalting gal column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0033-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Crimp-Top Vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-391-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph Plus Electrode Control Unit</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>OXYG1 Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Eletrode Chamber</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>DW1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Disc</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE (0.0125 mmX25mm) 30m reel</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>S4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode cleaning Kit</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>S16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spacer paper</td>
			<td>Zig Zag</td>
			<td>available at any gas station</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>He-series Dri-Lab glove box</td>
			<td>Vacuum/Atmospheres Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HE-493 Dri-Train</td>
			<td>Vacuum/Atmospheres Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-401-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>k420400-1530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L, Model 701 N SYR, Cemented NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2 syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K420401-1505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulsiflex-C5 high-pressure homogenizer</td>
			<td>Avestin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-PER Complete Bacterial Protein Extraction Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12650-88-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>7177-48-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP-1421-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP153-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP684-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G46-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

anaerobic protein purification and kinetic analysis via oxygen electrode for studying desb dioxygenase activity and inhibition

Proteine sensibili all'ossigeno, compresi quegli enzimi che utilizzano ossigeno come substrato, possono hanno ridotto la stabilità quando purificato utilizzando metodi di depurazione aerobica tradizionale. Questo manoscritto illustra i dettagli tecnici coinvolti nel processo di depurazione anaerobica, compresa la preparazione dei tamponi e reagenti, i metodi per cromatografia su colonna in un vano portaoggetti e la desalificazione della proteina prima della cinetica. Sono anche descritti i metodi per la preparazione e l'utilizzo di un elettrodo di ossigeno per eseguire la caratterizzazione cinetica di un enzima che utilizzano ossigeno. Questi metodi sono illustrati usando l'enzima diossigenasi Giuroma90, un dioxygenase di gallato del batterio Sphingobium ceppo SP. SYK-6.

Viene mostrato l'analisi del gel di SDS-PAGE delle singole frazioni da purificazione del costrutto Giuroma90-maltosio binding protein (MBP) fusione (Figura 3). Il gel rivela che la proteina è pura (MW = 91.22 kDa), tranne la presenza di Giuroma90 (MW = 49.22 kDa) e dominio della proteina MBP (kDa 42) spaccati da altro. Le frazioni E2 ed E3 sono stati selezionati per la concentrazione (punto 4.2).
R...

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Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Purificazione della proteina anaerobica e analisi cinetica tramite elettrodo di ossigeno per lo studio di inibizione e attività di Dioxygenase di Giuroma90

Qui presentiamo un protocollo per la purificazione della proteina anaerobica, la concentrazione di proteina anaerobica e successiva caratterizzazione cinetica utilizzando un sistema di elettrodi di ossigeno. Il metodo è illustrato utilizzando l'enzima Giuroma90, un enzima diossigenasi che è più stabile e attivo quando purificato e conservati in un ambiente anaerobico.

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Questo metodo è progettato per rispondere a domande chiave nel campo della biochimica inorganica, su come mantenere l'attività enzimatica nelle proteine che contengono metalli sensibili all'ossigeno. Il vantaggio principale di questa tecnica è che ti aiuta a visualizzare modi in cui puoi mantenere il metallo di una proteina nel suo stato ridotto. Generalmente, gli individui nuovi a questa tecnica faranno fatica perché è difficile mantenere materiali e reagenti completamente anaerobici.24 ore dopo aver introdotto l'espressione proteica, raccogliere le cellule per centrifugazione e rimescolare il pellet di cellule batteriche in 20 millilitri di tampone di colonna di amilosio per 1,5 litri di crescita. Aggiungere un milligrammo di glisozima alla sospensione cellulare e mescolare le cellule per 20 minuti sul ghiaccio. Al termine dell'incubazione, lisciviare la soluzione cellulare rimescolata tramite omogeneizzazione ad alta pressione con da tre a cinque passaggi a circa 15.000 psi e trasferire la proteina in un tubo di centrifuga da 50 millilitri.Sciacquare lo spazio della testa con azoto per un minuto e centrifugare il lysate cellulare per rimuovere i detriti insolubili. Trasferire il supernatante in almeno un tubo da 50 millilitri e limitare il lysate con un setto di gomma. Utilizzando un ago calibro 20, far bollare lentamente il gas azoto attraverso la soluzione per due minuti per spostare l'ossigeno.Quindi, avvolgere il setto con pellicola di paraffina, fissare il Parafilm con filo di rame e posizionare il supernatante nella scatola dei guanti con i materiali della colonna. Quando il solvente si trova appena sopra il letto di resina, in una colonna di amilosio precedentemente preparata, caricare 50 millilitri di proteine supernatanti sulla colonna, raccogliendo il flusso in frazioni di cinque millilitri sotto azoto moderatamente pressurizzato a circa cinque millilitri al minuto. Una volta eluito tutto il flusso, lavare la colonna con altri tre volumi di colonna di buffer di colonna amilosio.Aggiungere cinque CV di tampone di eluizione, quindi raccogliere manualmente frazioni di tre millilitri in provette di vetro sotto azoto moderatamente pressurizzato. Testare le soluzioni per la presenza di ossigeno con solfato di ammonio ferroso e ditiothreitol. La soluzione diventerà blu scuro o nero se è presente ossigeno, come il tubo a destra.La presenza di ossigeno si tradurrà in proteine purificate a bassa attività catalitica. Le soluzioni con ossigeno minimo presente saranno la lavanda o il colore traslucido azzurro, come il tubo a sinistra. Successivamente, utilizzare una linea di azoto esterna per pressurizzare la camera cellulare mescolata e concentrare la proteina a 50 millilitri a una velocità di agitazione moderata due volte.Quindi, concentrare la proteina a 10 millilitri e filtrare la proteina concentrata attraverso un filtro siringa da 0,45 micrometri-pori. Aliquot 150 microlitri di proteine in singoli tubi di reazione a catena della polimerasi da 200 microlitri. Quindi, rimuovere le aliquote capped dalla scatola dei guanti per il congelamento immediato del flash in azoto liquido e lo stoccaggio a meno 80 gradi Celsius.Per desalinizzazione DesB, aggiungere prima tre millilitri di sephadex G-25 Coarse desalting gel a una colonna borosilicata da nove millilitri e lavare la colonna con due volumi di colonna di tampone di desalt degassato. Quando il DesB si è scongelato, caricare la proteina purificata sulla colonna attraverso un processo controllato dalla gravità e scartare il flusso prima di eluire tre gocce di proteine in ciascuna delle 12 fiale, con circa cinque millilitri di tampone dissallamento. Per preparare l'elettrodo di ossigeno, utilizzare le forbici per tagliare un quadrato di carta distanziale di circa 1,5 pollici e tagliare piccoli triangoli su ogni faccia del quadrato, con fessure negli angoli per aiutare nell'avvolgimento dell'elettrodo.Aggiungere cinque gocce di una soluzione di cloruro di potassio al 50% sulla scanalatura anodica argentata dell'elettrodo e collegare le gocce in modo che formino un anello continuo di soluzione. Aggiungere due gocce della soluzione di cloruro di potassio nella parte superiore dell'elettrodo di platino e posizionare con cura la carta distanziale sopra l'elettrodo di platino, levigando la carta distanziale in modo che non ci siano bolle d'aria. Tagliare un pezzo di membrana PTFE S4 da 30 m lungo circa due pollici e posizionarlo sopra la carta distanziale, rimuovendo i bordi della membrana in modo che siano allineati con l'anello esterno dell'elettrodo.Utilizzando un applicatore ad O-ring, spingere un piccolo O-ring sopra l'elettrodo per fissare la carta distanziale e la membrana sull'elettrodo e posizionare un O-ring più grande sulla scanalatura circolare dell'elettrodo, facendo attenzione che non ci sia membrana sotto. Far scorrere la camera superiore dell'elettrodo sulla base e avvitare i due pezzi insieme. Posizionare l'elettrodo assemblato sulla sua base e collegare l'elettrodo al sistema di monitoraggio.Per determinare la velocità di reazione enzimatica, utilizzare un elettrodo di tipo Clark sensibile all'ossigeno, con integrazione computerica per misurare il consumo di ossigeno tramite l'unità di controllo degli elettrodi. Aggiungere un millilitro di tampone Tris nel volume appropriato del substrato alla camera dell'elettrodo e mescolare la soluzione per 10 secondi. Dopo 10 secondi, sigillare lentamente la camera con lo stantuffo e avvitare la parte superiore verso il basso.Utilizzare un tessuto pulito per assorbire il liquido in eccesso spostato dalla camera e consentire all'elettrodo di equilibrare dove può produrre una misurazione stabile della concentrazione di ossigeno nella soluzione per almeno un minuto. Successivamente, utilizzare una siringa a tenuta di gas da 10 microliter per aggiungere circa un microlitro di enzima alla camera dell'elettrodo attraverso lo stantuffo e raccogliere i dati sulla velocità. Una volta raccolta tutta la velocità per una determinata concentrazione di substrato, utilizzare un tubo di plastica collegato a un pallone sottovuoto a braccio laterale per svuotare la camera dell'elettrodo e sciacquare ripetutamente la camera per quattro o sei cicli con acqua.Quindi, impostare la soluzione nell'elettrodo come appena dimostrato, utilizzando una nuova concentrazione di substrato. L'analisi del gel SDS-PAGE delle singole frazioni dalla purificazione del costrutto di fusione proteica legante DesB-maltosio rivela l'isolamento di un prodotto proteico puro, a parte la presenza di prodotti di dominio di proteine leganti DesB e maltosio che si scisso l'uno dall'altro. Una volta effettuate tutte le misurazioni cinetiche, l'attività di DesB con gallato, ad esempio, può essere ottenuta misurando il tasso di consumo di ossigeno in concentrazioni gallate variabili.Al contrario, il tasso di inibizione di DesB con quattro nitrocatecole può essere determinato osservando la riduzione del tasso di consumo di ossigeno di DesB con gallato millimolare in presenza di concentrazioni variabili di quattro nitrocatecole, indicando, ad esempio, che il quattro nitrocatecole inibisce il consumo di ossigeno e quindi la reazione desb. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sullo studio degli enzimi diossigenasi ferroso-dipendenti, può essere applicato ad altri sistemi, come altri metalloenzimi. Non dimenticare che lavorare all'interno di una scatola portaoggetti può essere impegnativo, quindi fai attenzione a non affrettarti durante l'esecuzione di questa tecnica.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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