Name: anaerobic protein purification and kinetic analysis via oxygen electrode for studying desb dioxygenase activity and inhibition
Uploaded: 2018-10-03T14:45:00
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テクニカル サポートのウェスリアン大学の博士カミーユ ・ ケラーに感謝したいと思います。嫌気性蛋白質精製方法および O2 の使用に関する彼らのアドバイス教授リンゼイ + Eltis、ジェナ ・ k ・ Capyk ブリティッシュ ・ コロンビアの大学から、テキサス大学オースティン校からキリスト教ホイットマンのおかげで特別な-電極。

1. 一般材料と方法
<ol><li>表 1に示すようにすべての必要なメディアを準備します。15 分無菌 120 ° C のオートクレーブは、0.2 μ m フィルターを通過して MgCl2とグルコースの添加後 SOC ソリューションをフィルターします。オートクレーブに入れる前にミラーのホストゲノム スープ (LB 媒体) 溶液の pH を調整します。0.2 mM、0.1 mM 鉄アンモニウムの硫酸塩タンパク質発現と溶?...

アクティブな精製された DesB タンパク質を得ることに重要なステップは、形成と酵素の減らされた鉄 (ii) アクティブ サイトの維持を含みます。よう、誘導、浄化、集中、パフォーマンスを修正し、脱塩の手順は活性酵素を正常に取得に欠かせない。1 mM 鉄アンモニウムの硫酸塩の存在下でタンパク質の発現を誘導する鉄 (ii) は DesB の活性部位に正しく組み込まれてことを保証します。このメ?...

鉄や他の金属には活性酸素を利用する酵素は、それらの除去のため細胞の還元環境から浄化プロセス中に不活化を受けやすい。したがって、これらの蛋白質はセル lysates として使用する必要があります、外部の還元剤にさらされるまたは最適な酵素活性1,2,3,4があるように嫌気浄化されます。これらの酵素は酸素感受性 (具体的には鉄を含む酵素)、嫌気的条件を維持しながらすべての精製と諸性質の手順を実行するそれらを完全に特徴づける必要です。これは、嫌気性チャンバー結晶5,6,7,8 を介してタンパク質発現に至る研究の範囲内で全体の研究室のセットアップを開発する研究者をつながっています。.
ここで、嫌気性の精製と酵素酸素電極を用いた DesB の速度論的解析法を報告する.DesB は、没食子酸ジオキシゲナーゼ細菌Sphingobium sp. ひずみ SYK-6 LigAB、同じ有機体から protocatecuate ジオキシゲナーゼに関連しているからです。日9、好気性の標準を使用して精製した場合不活化を受けやすいこのスーパーファミリーの酵素の一部可能性がありますに広範囲に研究されていないタイプ II プロトカテク酸-ジオキシゲナーゼ (PCAD) スーパーファミリーに属する両方の酵素蛋白質の浄化方法。PCAD 酵素のいくつかはありますが基質特異的2,10, 基板混乱を表示からさらにこのスーパーファミリーの特性評価は特異性の決定要因を識別するために必要です。小さな分子が直接競争の阻害を介して活動またはのバインディングを変更できますいくつか酵素ガ11,12,13,14,15で確認されています別のアロステリック ポケットが増加または減少酵素活性16する分子。速度だけでは、変調器の結合場所を区別できない、効果を理解するために重要なは活動変化の大きさを決定します。このような DesB のネイティブ アクティビティおよびその活動 4-nitrocatechol (4NC) を特徴付けるジオキシゲナーゼ酵素2,17,を抑制する一般的に使用される化合物の存在下での速度論的解析法18日が表示されます。
DesB は、リグニン由来芳香族化合物、基板10,19の一つとして酸素を使用して開口部を触媒するリングで extradiol ジオキシゲナーゼ (江戸) 反応による没食子酸を分解することができます。この酵素反応は芳香族 heteropolymer は、植物の細胞壁のリグニン分解のコンテキスト内で発生します。リグニンを depolymerized することができます、さまざまな芳香族化合物を降伏するさらに分けることが中央代謝物3,20,21,22,2324, ,25,26,27,28,29,30,31,32,33.Extradiol dioxygenases (江戸) を触媒、胸の谷間が金属配ジオール; に隣接して発生する dihydroxylated 芳香族化合物の反応を開環対照的に、intradiol dioxygenases は、2 つのヒドロキシル グループ (図 1) と芳香族化合物類似を切断します。他の多くの酵素のような EDOs 2 ヒスチジン 1-カルボン酸トライアド9,34,35から成る調整鉄 (ii) の二価金属センターがあります。これらの酵素は、酵素が非アクティブな2,36,37,38を表示されるに対し自動酸化、不活性化のメカニズムに基づくと酸化になります。
本稿では、実験手順では、DesB、没食子酸 (図 2 a) の C4 C5 結合に酸素の付加を触媒する細菌Sphingobium sp. SYK-6 から PCAD スーパーファミリーのメンバーを利用します。この胸の谷間の regiochemistry は、プロトカテク酸--4, 5-ジオキシゲナーゼ (図 2 b) は、LigAB に似ています。これまでのところ、この没食子酸ジオキシゲナーゼの調査は、DesB10,19,39を阻害する化合物のレポートを含めません。有酸素浄化方法の使用は、DesB では、変数の活動を嫌気的方法の使用に一貫して再現可能なアクティビティとタンパク質を取得することができました、出展しました。ここで説明した動力学的研究 DesB、没食子酸と DesB の反応と 4-nitrocatechol (4NC) による DesB の阻害の速度論的解析の嫌気性の浄化メソッドに示します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranodise</td>
			<td>Gold Bio Technologies</td>
			<td>I2481C50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;tetramethyl-ethylenediamine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylose Resin High Flow</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E8022S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) competent Escherichia coli cells</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gallic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-nitrocatechol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N15553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrous ammonium sulfate</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>5064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dithionite</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>33381-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wheaton serum bottles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-406G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm Acrodisc PF Syringe Filter with Supor Membrane</td>
			<td>Pall Corportation</td>
			<td>4187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL Amicon Stirred Cell Concentrator</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFSC40001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>76 mm Millipore Ultracel 10 kDa cutoff reconsituted cellulose membrane filter</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PLGC07610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-dithiothreitol</td>
			<td>Gold Bio Technologies</td>
			<td>DTT50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-25 coarse desalting gal column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0033-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Crimp-Top Vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-391-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph Plus Electrode Control Unit</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>OXYG1 Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Eletrode Chamber</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>DW1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Disc</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE (0.0125 mmX25mm) 30m reel</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>S4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode cleaning Kit</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>S16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spacer paper</td>
			<td>Zig Zag</td>
			<td>available at any gas station</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>He-series Dri-Lab glove box</td>
			<td>Vacuum/Atmospheres Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HE-493 Dri-Train</td>
			<td>Vacuum/Atmospheres Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-401-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>k420400-1530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L, Model 701 N SYR, Cemented NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2 syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K420401-1505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulsiflex-C5 high-pressure homogenizer</td>
			<td>Avestin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-PER Complete Bacterial Protein Extraction Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12650-88-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>7177-48-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP-1421-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP153-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP684-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G46-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

anaerobic protein purification and kinetic analysis via oxygen electrode for studying desb dioxygenase activity and inhibition

これらの酵素は、基質として酸素を利用するを含む酸素感受性タンパク質は伝統的な有酸素浄化メソッドを使用して精製した際の安定性が減少します。この原稿は、グローブ ボックスと反応速度論の前に蛋白質の脱塩でバッファーおよび試薬のカラム ・ クロマトグラフィ法の準備を含む嫌気性精製プロセスに関与する技術的な詳細を示しています。準備および酸素電極を使用して酸素を利用した酵素の速度論的解析を実行するためのメソッドは、述べる。これらのメソッドは、ジオキシゲナーゼ酵素細菌Sphingobium sp. ひずみ SYK 6 から没食子酸ジオキシゲナーゼ DesB を使用して説明します。

DesB マルトース結合タンパク質 (MBP) 融合コンストラクト (図 3) の精製から個々 の分数の SDS ページのゲルの分析は、示されています。ゲルを明らかにタンパク質が純粋である (MW = 91.22 kDa)、DesB の存在を除いて (MW = 49.22 kDa) と MBP タンパク質ドメイン (42 kDa) をお互いから切断します。分数 E2 および E3 は、濃度 (ステップ 4.2) に選ばれました。
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Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

嫌気性蛋白質の浄化および DesB ジオキシゲナーゼ活性と抑制の勉強用酸素電極による速度論的解析

ここで嫌気性蛋白質の浄化、嫌気性蛋白質濃度、酸素電極システムを使用して後続の速度論的解析のためのプロトコルを提案する.DesB より安定し、精製し、嫌気性環境で保存されているときにアクティブであるジオキシゲナーゼ酵素酵素を用いた方法を示します。

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

この方法は、無機生化学分野の重要な質問に答えるように設計されています, 酸素感受性金属を含むタンパク質の酵素活性を維持する方法について.この手法の主な利点は、タンパク質の金属を還元状態に維持する方法を視覚化できることです。一般的に、この技術に新しい個人は、完全に嫌気性であるため、材料や試薬を維持することが困難であるため、苦労します。タンパク質発現を誘導してから24時間後、遠心分離により細胞を回収し、増殖1.5リットル当たり20ミリリットルのアミロースカラムバッファーで細菌細胞ペレットを再懸濁する。細胞懸濁液にリソザイムを1ミリグラム加え、氷の上で20分間かき混ぜる。インキュベーションの終わりに、約15,000 psiで3〜5回のパスで高圧均質化を介して再懸濁細胞溶液を溶解し、タンパク質を50ミリリットルの遠心分離管に移します。ヘッドスペースを窒素で1分間洗い流し、細胞溶解物を遠心分離して不溶性の破片を取り除きます。上清を少なくとも1本の50ミリリットルチューブに移し、ラバー中隔でリゼートをキャップする。20ゲージの針を使用して、溶液を通してゆっくりと窒素ガスを2分間泡立て、酸素を変位させます。その後、中隔をパラフィンフィルムで包み、パラフィルムを銅線で固定し、上澄み物をカラム材料でグローブボックスに入れます。溶媒が樹脂床のすぐ上にある場合、以前に調製したアミロースカラムに、50ミリリットルのタンパク質上清をカラムに負荷し、適度に加圧された窒素の下で5ミリリットルの分量でフロースルーを1分あたり約5ミリリットルで回収する。すべてのフロースルーが溶出したら、アミロースカラムバッファの別の3カラムボリュームでカラムを洗います。溶出バッファーの 5 つの CV を追加し、手動で適度に加圧窒素の下ガラス試験管に 3 ミリリットル分分を収集します。.硫酸第一鉄アンモニウムとジチオトレイトールを用いて酸素存在の溶液をテストします。溶液は、右側のチューブのように、酸素が存在する場合は濃い青色または黒に変わります。酸素の存在は、低触媒活性を有する精製タンパク質をもたらす。酸素が少ない溶液は、ラベンダーまたは水色の半透明色、左側のチューブのように。次に、外部窒素ラインを用いて撹拌細胞チャンバーを加圧し、適度な攪拌速度でタンパク質を50ミリリットルに濃縮する。その後、タンパク質を10ミリリットルに濃縮し、0.45マイクロメートルの細孔注射器フィルターを介して濃縮タンパク質を濾過する。アリコート150マイクロリットルのタンパク質を個々の200マイクロリットルのポリメラーゼ連鎖反応チューブに。その後、グローブボックスからキャップされたアリコートを取り出し、液体窒素で即時のフラッシュ凍結を行い、マイナス80°Cで貯蔵します。DesB脱塩の場合は、まずセファデックスG-25粗塩脱塩ゲルの3ミリリットルを9ミリリットルのホウケイ酸カラムに加え、2列の脱塩脱塩緩衝液でカラムを洗浄します。DesBが解凍したら、精製したタンパク質を重力制御プロセスを介してカラムにロードし、フロースルーを破棄してから、3滴のタンパク質を12個のバイアルのそれぞれに溶出させ、約5ミリリットルの脱塩バッファーを使用します。酸素電極を準備するには、はさみを使用して約1.5インチの正方形のスペーサーペーパーをカットし、正方形の各面に小さな三角形をカットし、角にスリットを入れ、電極のラッピングを支援します。50%塩化カリウム溶液を電極の銀アノード溝に5滴加え、溶液の連続リングを形成するように滴を接続します。塩化カリウム溶液を白金電極の上部に2滴加え、白金電極の上にスペーサーペーパーを慎重に置き、空き紙を滑らかにし、気泡がないようにスペーサーペーパーを滑らかにします。約2インチの長さのS4 30m PTFE膜を切り、スペーサーペーパーの上に置き、膜の端を取り除き、電極の外輪に合わせるようにします。Oリングアプリケータを使用して、小さなOリングを電極の上に押し込んでスペーサーの紙と膜を電極に固定し、電極の円形溝に大きなOリングを置き、下に膜が存在しないのに注意します。電極の上部チャンバーをベースにスライドさせ、2つの部分を一緒にねじ込みます。組み立てた電極をベースに置き、電極を監視システムに接続します。酵素反応の速度を決定するには、酸素感受性クラーク型電極を使用し、コンピュータインテグレーションを使用して、電極制御ユニットを介して酸素消費量を測定します。電極室に適切な基板の量にトリスバッファーの1ミリリットルを追加し、10秒間溶液をかき混ぜます。10秒後、チャンバーをプランジャーでゆっくりと密封し、上部を下にねじ込みます。クリーンな組織を使用してチャンバーから変位した余分な液体を吸収し、電極が溶液中の酸素濃度を少なくとも1分間安定して測定できる平衡化を可能にする。次に、気密性のある10マイクロリットルのシリンジを使用して、プランジャーを通して約1マイクロリットルの酵素を電極チャンバーに加え、レートデータを収集します。所定の基板濃度の全レートが収集された場合は、サイドアーム真空フラスコに接続されたプラスチックチューブを使用して電極室を空にし、チャンバーを4~6サイクル水で繰り返しリンスします。次いで、新しい基板濃度を用いて、ちょうど実証したように電極に溶液をセットアップする。DesB-maltose結合タンパク質融合構築物の精製からの個々の画分のSDS-PAGEゲル分析は、DesBおよびマルトース結合タンパク質ドメイン産物が互いに切断される産物の存在を除いて、純粋なタンパク質産物の単離を明らかにする。すべての運動測定が行われたら、ガレートを用いたDesBの活性は、例えば、様々なガレート濃度における酸素消費速度を測定することによって得ることができる。逆に、4-ニトロカテコールによるDesBの阻害率は、4-ニトロカテコールの様々な濃度の存在下で1ミリモルガレートでDesBの酸素消費率の低下を観察することによって決定することができ、例えば、4-ニトロカテコールは酸素の消費を阻害し、それによってDesB反応を阻害することを示す。この方法は、鉄依存性ジオキシゲナーゼ酵素の研究に関する洞察を提供することができますが、他の金属酵素などの他のシステムにも適用できます。グローブボックス内での作業は難しい場合があるので、このテクニックを実行しながら急がないように注意してください。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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