Name: anaerobic protein purification and kinetic analysis via oxygen electrode for studying desb dioxygenase activity and inhibition
Uploaded: 2018-10-03T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition at JoVE.com

Vi vil gjerne takke Dr. Camille Keller Wesleyan University kundestøtte. Spesiell takk til Professor Lindsay D. Eltis og Jenna K. Capyk fra University of British Columbia, samt Christian Whitman fra University of Texas i Austin, for deres råd om anaerob protein rensing metoder og bruk av en O2 -sensitive elektroden.

1. generelle materiale og metoder
<ol><li>Forberede alle nødvendige medier som beskrevet i tabell 1. Autoclave på 120 grader i 15 min. Sterile filtrere det SOC løsningen, etter MgCl2 og glukose, ved å sende det gjennom en 0,2 µm. Justere pH i Miller's Lysogeny kjøttkraft (LB media) løsning før autoklavering. Tillegg LB-Amp media løsning etter autoklavering sterilt løsninger på 0.2 mM L-cystein, deretter 0,1 mM jernholdige ammonium sulfate å forbedre protein uttrykk og oppløselig...

De avgjørende skritt i å få aktiv, renset DesB protein innebære forming og opprettholde det reduserte Fe(II) aktive området i enzymet. Rett slik ytelse av induksjon, renselse, konsentrasjon, og avsalting tiltak er avgjørende for å kunne oppnå aktiv enzym. Inducing protein uttrykk i nærvær av 1 mM jernholdige ammonium sulfate sikrer at Fe(II) er riktig innlemmet i det aktive området av DesB. Denne metoden er inspirert av studier som de med amidohydrolase metalloenzymes, som ofte krever tillegg av metall til vek...

Enzymer som bruker jern eller andre metaller aktivere oksygen er ofte utsatt for inaktivering i løpet av en renselsesprosess på grunn av fjerning fra redusere miljøet i en celle. Derfor disse proteinene må brukes som celle lysates, utsettes for eksterne reduksjonsmidler eller rense anaerob for å sikre at de har optimal enzymatisk aktivitet1,2,3,4. For disse enzymene som er oksygen-sensitive (spesielt jern inneholder enzymer), utføre alle rensing og karakterisering trinnene samtidig anaerobe forholdene nødvendig for fullt karakterisere dem. Dette har ledet forskerne å utvikle hele laboratorium set-ups innenfor rammen av anaerob kamre for studier fra protein uttrykk gjennom krystallografi5,6,7,8 .
Her rapporterer vi metoder for det anaerob rensing og kinetisk karakteristikk av enzymet DesB bruker en oksygen elektrode system. DesB er en gallate dioxygenase fra bakterien Sphingobium sp. belastning SYK-6 som er knyttet til LigAB, en protocatecuate dioxygenase fra den samme organismen. Begge enzymer tilhører type II protocatechuate dioxygenase (PCAD) gruppe som ikke har blitt grundig undersøkt til dato9, sannsynlig delvis på grunn av enzymer i denne overfamilie blir utsatt for inaktivering når renset ved hjelp av standard aerobic protein rensing metoder. Siden noen av de PCAD enzymene vise substrat promiskuitet mens andre er substrat-spesifikke2,10, ytterligere er karakteristikk av denne overfamilie nødvendig å identifisere spesifisitet determinanter. Som har blitt observert i flere enzymet overfamilier11,12,13,14,15, kan små molekyler endre aktivitet via direkte konkurrerende hemming eller binding av molekyler å skille allosteric lommer som forårsaker en økning eller nedgang i enzymatisk aktivitet16. Mens kinetics alene ikke kan skille innbindingssted for en modulator, bestemme omfanget av en aktivitet endrer er viktig for å forstå virkningene. Som sådan, metoder for kinetic karakterisering av innfødte DesB aktivitet og sin aktivitet i nærvær av 4-nitrocatechol (4NC), et stoff som vanligvis brukes til å karakterisere og hemmer dioxygenase enzymer2,17, 18, vises.
DesB er i stand til å bryte ned gallate, en lignin-avledet aromatiske sammensatte, via en extradiol dioxygenase (EDO) reaksjon i som ringen er åpning katalysert bruker oksygen som en av underlag10,19. Denne enzymatiske reaksjonen skjer innenfor rammen av nedbryting av lignin, en aromatisk heteropolymer funnet i cellen vegg av planter. Lignin kan være depolymerized, gir et utvalg av aromatiske forbindelser som kan videre deles inn i sentrale metabolitter3,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Extradiol dioxygenases (EDO) katalysere en ring åpne reaksjon på dihydroxylated aromatiske forbindelser, der cleavage oppstår ved siden av et metall koordinerte diol; derimot cleave intradiol dioxygenases analoge aromatiske forbindelser mellom de to hydroksyl gruppene (figur 1). EDOs, som mange andre metalloenzymes, har en divalent metall senter for koordinerende Fe(II) består av en to-histidin, ett-carboxylate triaden9,34,35. Disse metalloenzymes blir oksidert, via autoxidation eller mekanisme-baserte inaktivering, mens enzymet gjengis inaktive2,36,37,38.
I eksperimentelle prosedyrene som er beskrevet i dette manuskriptet, benytter vi DesB, medlem av PCAD gruppe fra bakterien Sphingobium sp. forhold-6, å katalysere tillegg av oksygen over C4-C5 bånd gallate (figur 2A). Regiochemistry denne cleavage er analoge til LigAB, som er en protocatechuate-4,5-dioxygenase (figur 2B). Så langt, inkluderer undersøkelser av denne gallate dioxygenase noen rapporter om forbindelser som hemmer DesB10,19,39. Med bruk av aerobic rensing metoder utstilt DesB variabel aktivitet, mens med bruk av anaerob metoder kunne vi konsekvent få protein reproduserbar aktivitet. Kinetisk erfaringene beskrevet her viser metodene for anaerob rensing av DesB, kinetisk karakterisering av reaksjonen av DesB med gallate, og hemming av DesB av 4-nitrocatechol (4NC).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranodise</td>
			<td>Gold Bio Technologies</td>
			<td>I2481C50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;tetramethyl-ethylenediamine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylose Resin High Flow</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E8022S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) competent Escherichia coli cells</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gallic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-nitrocatechol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N15553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrous ammonium sulfate</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>5064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dithionite</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>33381-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wheaton serum bottles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-406G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm Acrodisc PF Syringe Filter with Supor Membrane</td>
			<td>Pall Corportation</td>
			<td>4187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL Amicon Stirred Cell Concentrator</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFSC40001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>76 mm Millipore Ultracel 10 kDa cutoff reconsituted cellulose membrane filter</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PLGC07610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-dithiothreitol</td>
			<td>Gold Bio Technologies</td>
			<td>DTT50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-25 coarse desalting gal column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0033-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Crimp-Top Vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-391-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph Plus Electrode Control Unit</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>OXYG1 Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Eletrode Chamber</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>DW1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Disc</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE (0.0125 mmX25mm) 30m reel</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>S4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode cleaning Kit</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>S16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spacer paper</td>
			<td>Zig Zag</td>
			<td>available at any gas station</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>He-series Dri-Lab glove box</td>
			<td>Vacuum/Atmospheres Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HE-493 Dri-Train</td>
			<td>Vacuum/Atmospheres Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-401-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>k420400-1530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L, Model 701 N SYR, Cemented NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2 syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K420401-1505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulsiflex-C5 high-pressure homogenizer</td>
			<td>Avestin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-PER Complete Bacterial Protein Extraction Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12650-88-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>7177-48-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP-1421-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP153-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP684-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G46-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

anaerobic protein purification and kinetic analysis via oxygen electrode for studying desb dioxygenase activity and inhibition

Oksygen-sensitive proteiner, inkludert de enzymene som utnytte oksygen som et substrat kan ha redusert stabilitet når renset med tradisjonelle aerobic rensing metoder. Dette manuskriptet illustrerer de tekniske detaljene som er involvert i det anaerob renselsesprosess, inkludert utarbeidelse av buffere og reagenser, metoder for kolonnen Ture i en hanskerommet og avsalte av protein før kinetics. Også beskrevet er metoder for utarbeidelse og bruke en oksygen elektrode for å utføre kinetic karakteristikk av et enzym som oksygen-bruk. Disse metodene er illustrert med dioxygenase enzymet DesB, en gallate dioxygenase fra bakterien Sphingobium sp. belastning SYK-6.

Vist er SDS side gel analyse av individuelle fraksjoner rensing av DesB-maltose bindende protein (MBP) fusion Konstruer (Figur 3). Gel avslører at protein er ren (MW = 91.22 kDa), bortsett fra tilstedeværelsen av DesB (MW = 49.22 kDa) og MBP protein domene (42 kDa) kløyvde fra hverandre. Brøker E2 og E3 ble valgt for konsentrasjon (trinn 4.2).
Reproduserbar resultater fra DesB kinetic analyser, ...

Watch this Scientific Journal Video about Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition at JoVE.com

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaerob Protein rensing og kinetisk analyse via oksygen elektrode for å studere DesB Dioxygenase aktivitet og hemming

Her presenterer vi en protokoll for anaerob protein rensing, anaerob protein konsentrasjon og påfølgende kinetic karakterisering ved hjelp av en oksygen elektrode system. Metoden er illustrert med enzymet DesB, en dioxygenase enzym som er mer stabilt og aktiv når renset og lagres i en anaerob miljø.

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Denne metoden er utformet for å svare på viktige spørsmål innen uorganisk biokjemi, om hvordan man opprettholder enzymaktivitet i proteiner som inneholder oksygenfølsomme metaller. Den største fordelen med denne teknikken er at det hjelper deg med å visualisere måter der du kan opprettholde et proteinmetall i redusert tilstand. Generelt vil personer som er nye i denne teknikken slite fordi det er vanskelig å opprettholde materialer og reagenser for å være helt anaerob.24 timer etter å ha indusert proteinuttrykk, samle cellene ved sentrifugering, og gjenbruke bakteriell cellepellet i 20 milliliter amylose kolonnebuffer per 1,5 liter vekst. Tilsett ett mg lysozym til cellesuspensjonen, og rør cellene i 20 minutter på is. På slutten av inkubasjonen, lyse den resuspended celleløsning via høytrykks homogenisering med tre til fem passerer på ca 15,000 psi, og overføre proteinet til en 50-milliliter sentrifuge rør.Skyll headspace med nitrogen i ett minutt, og sentrifuger cellen lysate for å fjerne uoppløselig rusk. Overfør det overnaturlige til minst ett 50-milliliter rør, og hette lysate med en gummi septum. Bruk en 20-gauge nål, sakte boble nitrogengass gjennom løsningen i to minutter for å fortrenge oksygenet.Deretter pakker du septumet med parafinfilm, sikrer Parafilmen med kobbertråd, og plasserer supernatanten i hanskerommet med kolonnematerialene. Når løsningsmidlet ligger like over harpikssengen, laster du 50 milliliter protein overnatur på kolonnen i en tidligere forberedt amylosekolonne, 50 milliliter protein overnatur på kolonnen, og samler gjennomstrømningen i fem milliliter fraksjoner under moderat trykksatt nitrogen ved omtrent fem milliliter per minutt. Når all gjennomstrømningen er unnsluppet, vasker du kolonnen med ytterligere tre kolonnevolumer med amylose-kolonnebuffer.Tilsett fem CV med elutionbuffer, og samle deretter tre milliliterfraksjoner manuelt i glasstestrør under moderat trykksatt nitrogen. Test løsningene for oksygentilstedeværelse med jernholdig ammoniumsulfat og tretiothreitol. Løsningen blir mørk blå eller svart hvis oksygen er til stede, som røret til høyre.Tilstedeværelsen av oksygen vil resultere i renset protein med lav katalytisk aktivitet. Løsninger med minimal oksygen til stede vil være lavendel eller lyseblå gjennomsiktig farge, som røret til venstre. Deretter bruker du en ekstern nitrogenlinje til å trykksatt det omrørte cellekammeret, og konsentrere proteinet til 50 milliliter med moderat omrøringshastighet to ganger.Deretter konsentrerer proteinet til 10 milliliter, og filtrer det konsentrerte proteinet gjennom et sprøytefilter på 0,45 mikrometer og porer. Aliquot 150 mikroliter protein i individuelle 200-mikroliter polymerase kjedereaksjonsrør. Deretter fjerner du de avgrensede aliquots fra hanskerommet for umiddelbar flash-frysing i flytende nitrogen og lagring ved minus 80 grader Celsius.For DesB-desalting legger du først til tre milliliter sephadex G-25 Grov desaltingsgel til en ni milliliter borosilikatkolonne, og vask kolonnen med to kolonnevolumer av avgasset desaltbuffer. Når DesB har tint, laster du det rensede proteinet på kolonnen via en gravitasjonskontrollert prosess, og kast gjennomstrømningen før du eluting tre dråper protein i hver av 12 hetteglass, med ca fem milliliter av avsalting buffer. For å forberede oksygenelektroden, bruk saks til å kutte en ca. 1,5-tommers firkantet avstandspapir, og kutt små trekanter på hvert ansikt av firkanten, med åpninger i hjørnene for å hjelpe til med innpakning av elektroden.Tilsett fem dråper av en 50% kaliumkloridløsning på elektrodens sølvanodespor, og koble dråpene slik at de danner en kontinuerlig løsningsring. Tilsett to dråper kaliumkloridløsning til toppen av platinaelektroden, og plasser forsiktig avstandspapiret på toppen av platinaelektroden, og glatt ut avstandspapiret slik at det ikke er luftbobler. Klipp en ca to-tommers lang stykke S4 30m PTFE membran, og plasser den på toppen av avstandspapiret, fjerne kantene på membranen slik at de er justert med den ytre ringen av elektroden.Bruk en O-ringapplikator til å skyve en liten O-ring over elektroden for å feste avstandspapiret og membranen på elektroden, og plasser en større O-ring på det sirkulære sporet på elektroden, og ta vare på at det ikke er noen membran under. Skyv elektrodens øverste kammer på sokkelen, og skru de to delene sammen. Plasser den monterte elektroden på sokkelen, og koble elektroden til overvåkingssystemet.For å fastslå frekvensen av enzymatisk reaksjon, bruk en oksygenfølsom Clark-type elektrode, med dataintegrasjon for å måle oksygenforbruket via elektrodekontrollenheten. Tilsett en milliliter Tris buffer i riktig volum av substrat til elektrodekammeret, og rør løsningen i 10 sekunder. Etter 10 sekunder forsegler du langsomt kammeret med stempelet, og skrur toppen ned.Bruk et rent vev til å suge opp overflødig væske som er forskjøvet fra kammeret, og la elektroden likevekt hvor den kan produsere en stabil måling av oksygenkonsentrasjonen i løsningen i minst ett minutt. Deretter bruker du en gasstett, 10 mikroliters sprøyte for å tilsette omtrent en mikroliter enzym til elektrodekammeret gjennom stempelet, og samler hastighetsdataene. Når all hastigheten for en gitt substratkonsentrasjon er samlet inn, bruk et plastrør koblet til en sidearmvakuumkolbe til å tømme elektrodekammeret, og skyll gjentatte ganger kammeret i fire til seks sykluser med vann.Deretter setter du opp løsningen i elektroden som nettopp demonstrert, ved hjelp av en ny substratkonsentrasjon. SDS-PAGE gelanalyse av individuelle fraksjoner fra DesB-maltosebindende proteinfusjonsrensing avslører isoleringen av et rent proteinprodukt, til side for tilstedeværelsen av DesB og maltosebindende proteindomeneprodukter som spaltet fra hverandre. Når alle kinetiske målinger er tatt, kan aktiviteten til DesB med gallat, for eksempel, oppnås ved å måle oksygenforbruket i varierende gallatekonsentrasjoner.Omvendt kan hemmingshastigheten av DesB med fire-nitrocatechol bestemmes ved å observere reduksjonen i oksygenforbruket til DesB med en millimolar gallat i nærvær av varierende konsentrasjoner av fire-nitrocatechol, noe som indikerer for eksempel at fire-nitrocatechol hemmer forbruket av oksygen og dermed DesB-reaksjonen. Selv om denne metoden kan gi innsikt i å studere jernavhengige dioksygenaseenzymer, kan den brukes på andre systemer, for eksempel andre metalloenzymer. Ikke glem at det kan være utfordrende å jobbe i en hanskeboks, så vær forsiktig så du ikke skynder deg mens du utfører denne teknikken.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Metode for å identifisere lavmolekylære inhibitorer av protein-protein samhandling mellom HCN1 og TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Ekspresjon, rensing og antimikrobiell aktivitet av S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: trinns affinitet rensing for parallell analyse av Protein-Protein og Protein-metabolitten komplekser

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rensing og rekonstituering av TRPV1 for Spectroscopic analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

Effektiv rensing og LC-MS/MS-baserte analysen utvikling for ti-elleve translokasjon-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Prøvetaking og forbehandling av tannemaljen karbonat stabil karbon-og oksygen isotop analyse

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

Studere Protein Import i Chloroplasts bruker Protoplasts

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Måling og tolke oksygen forbruk priser helt Fly hodet segmenter

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Proteomic analyse av menneskelig Macrophage polarisering Under et lavt oksygeninnhold miljø

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Studere RNA interaktører av Protein Kinase RNA-aktivert under pattedyr cellen syklus

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...