Name: anaerobic protein purification and kinetic analysis via oxygen electrode for studying desb dioxygenase activity and inhibition
Uploaded: 2018-10-03T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить доктора Camille Keller Уэслианского университета для получения технической поддержки. Особая благодарность профессор Линдси D. Eltis и Дженна K. Capyk из Университета Британской Колумбии, а также Кристиан Whitman из университета Техаса в Остине, за их рекомендации относительно методов очистки белков анаэробных и использование O2 -чувствительных электрода.

1. Общие материалы и методы
<ol><li>Подготовьте все необходимые средства массовой информации, как описано в таблице 1. Обработайте автоклавированием при температуре 120 градусов на 15 мин стерильными фильтр SOC решение, после добавления MgCl2 и глюкозы, путем передачи его через фи...

Важнейшие шаги в получении активный, очищенный белок DesB включать формирование и поддержание снижения Fe(II) активного узла в фермента. Таким образом, исправление производительность индукции, очистки, концентрация, и опреснительные шаги необходимы для успешного получения активных ферме?...

Ферменты, которые используют железа или других металлов для активации кислорода часто восприимчивы к инактивации во время процесса очистки из-за их удаление из среды снижение ячейки. Таким образом эти белки должны использоваться в качестве lysates клетки, подвергаться внешней восстановителями или очищаться анаэробно обеспечить, что они имеют оптимальный ферментативную активность1,2,3,4. Для этих ферментов, которые являются кислорода чувствительных (специально железосодержащих ферментов), выполнения всех шагов очистки и характеристик при сохранении анаэробных условий необходимо полностью охарактеризовать их. Это привело исследователей развивать весь лабораторных установок в пределах анаэробные камеры для исследований, начиная от выражения протеина по кристаллографии5,6,,7,8 .
Здесь мы сообщаем методы анаэробной очистки и кинетические характеристики фермента DesB, с помощью системы электрода кислорода. DesB является галлат dioxygenase от бактерии Sphingobium sp. штамм SYK-6, что связано с LigAB, protocatecuate dioxygenase из же организма. Оба ферментов принадлежат к надсемейства dioxygenase (PCAD) protocatechuate II типа, который не были широко изучены Дата9, вероятно, отчасти благодаря ферменты этого надсемейства, быть восприимчивым к инактивации когда очищается с помощью стандарта аэробных методы очистки белков. Поскольку некоторые из ферментов PCAD отображения субстрата распущенность, в то время как другие являются конкретного субстрата2,10, далее характеристика этого надсемейства необходимо выявить факторы, определяющие специфику. Как было отмечено в нескольких фермента superfamilies11,12,13,14,15, малые молекулы могут изменить деятельность через прямой конкурентного ингибирования или связывание молекул, чтобы отделить аллостерический карманы, которые вызывает увеличение или снижение ферментативной активности16. Хотя кинетики в одиночку не может отличить расположение привязки модулятор, определение величины изменения деятельности имеет важное значение для понимания воздействия. Как такие, методы для кинетические характеристики родной DesB деятельности и его активности в присутствии 4-nitrocatechol (4NC), соединение, обычно используется для характеристики и подавляют dioxygenase ферментов2,17, 18, отображаются.
DesB способен сломать галлат, производные лигнина ароматические соединения, через extradiol реакция dioxygenase (Эдо), в котором кольцо открытия является катализатором, используя кислород как один из10,субстратов19. Ферментативная реакция происходит в контексте распада лигнина, ароматических heteropolymer найдены в клеточной стенки растений. Лигнин может быть depolymerized, уступая различных ароматических соединений, которые могут быть разбиты на Центральный метаболиты3,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,,2930,,3132,33 . Extradiol dioxygenases (Эдо) катализировать кольцо открытие реакция на dihydroxylated ароматических соединений, где расщепления происходит рядом с метал координировала диол; в отличие от intradiol dioxygenases расщеплять аналогичных ароматических соединений между двумя группами гидроксила (рис. 1). EDOs, как и многие другие metalloenzymes имеют двухвалентной металла центр для координации Fe(II), состоящий из двух гистидин, один карбоксилатных Триада9,34,35. Эти metalloenzymes стать окисляется, через autoxidation или на основе механизм инактивации, тогда как фермента отображается неактивным2,36,,3738.
В экспериментальной процедуры, описанные в этой рукописи мы используем DesB, членом PCAD отходящий от бактерии Sphingobium sp. SYK-6, чтобы катализировать Добавление кислорода через C4-C5 Бонд галлат (рис. 2A). Regiochemistry этого расщепления является аналогом LigAB, который является protocatechuate-4,5-dioxygenase (рис. 2B). До настоящего времени расследования этой галлат dioxygenase включают в себя никаких сообщений о соединений, которые подавляют DesB10,19,39. С использованием методов аэробной очистки DesB выставлены переменную активность, в то время как с использованием анаэробных методов мы смогли последовательно получить белка с воспроизводимых активностью. Кинетические исследования, описанные здесь показывают методы для анаэробной очистки DesB, кинетические характеристики реакции DesB с галлат, и ингибирование DesB, 4-nitrocatechol (4NC).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranodise</td>
			<td>Gold Bio Technologies</td>
			<td>I2481C50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;tetramethyl-ethylenediamine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylose Resin High Flow</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E8022S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) competent Escherichia coli cells</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gallic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-nitrocatechol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N15553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrous ammonium sulfate</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>5064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dithionite</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>33381-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wheaton serum bottles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-406G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm Acrodisc PF Syringe Filter with Supor Membrane</td>
			<td>Pall Corportation</td>
			<td>4187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL Amicon Stirred Cell Concentrator</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFSC40001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>76 mm Millipore Ultracel 10 kDa cutoff reconsituted cellulose membrane filter</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PLGC07610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-dithiothreitol</td>
			<td>Gold Bio Technologies</td>
			<td>DTT50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-25 coarse desalting gal column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0033-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Crimp-Top Vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-391-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph Plus Electrode Control Unit</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>OXYG1 Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Eletrode Chamber</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>DW1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Disc</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE (0.0125 mmX25mm) 30m reel</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>S4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode cleaning Kit</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td>S16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spacer paper</td>
			<td>Zig Zag</td>
			<td>available at any gas station</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>He-series Dri-Lab glove box</td>
			<td>Vacuum/Atmospheres Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HE-493 Dri-Train</td>
			<td>Vacuum/Atmospheres Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-401-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>k420400-1530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L, Model 701 N SYR, Cemented NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2 syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K420401-1505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulsiflex-C5 high-pressure homogenizer</td>
			<td>Avestin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-PER Complete Bacterial Protein Extraction Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12650-88-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>7177-48-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP-1421-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP153-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP684-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G46-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

anaerobic protein purification and kinetic analysis via oxygen electrode for studying desb dioxygenase activity and inhibition

Кислород чувствительной белков, включая те ферменты, которые используют кислород как субстрат, можно сократить стабильности, когда очищается с помощью методов традиционной аэробной очистки. Эта рукопись иллюстрирует технических деталей, участвующих в процессе анаэробной очистки, включая подготовку буферов и реагенты, методы для колоночной хроматографии в бардачок и обессоливания белка до кинетики. Также описаны методы для подготовки и использования кислорода электрода для выполнения кинетическая характеристика фермента использования кислорода. Эти методы иллюстрируются с помощью фермента dioxygenase DesB, dioxygenase галлат от бактерии Sphingobium sp. штамм SYK-6.

Приведен анализ геля SDS-PAGE отдельных фракций от очистки DesB мальтозные связывания белка (MBP) слияние конструкции (рис. 3). Гель показывает, что белок является чистым (МВт = 91,22 кДа), за исключением наличия DesB (MW = 49.22 кДа) и MBP белка домен (42 кДа) расщепляется друг...

Watch this Scientific Journal Video about Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition at JoVE.com

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Очищение протеина анаэробных и кинетический анализ через электрод кислорода для изучения DesB Dioxygenase деятельность и ингибирование

Здесь мы представляем собой протокол для очистки белков анаэробных, анаэробные белка концентрацию и последующих кинетические характеристики, с помощью системы электрода кислорода. Этот метод иллюстрируется с помощью фермента DesB, dioxygenase фермента, который является более стабильным и активным, когда очищается и хранятся в анаэробной среде.

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Этот метод предназначен для ответа на ключевые вопросы в области неорганической биохимии, о том, как поддерживать активность ферментов в белках, содержащих чувствительные к кислороду металлы. Основным преимуществом этой техники является то, что она помогает визуализировать способы, в которых вы можете поддерживать металл белка в его уменьшенном состоянии. Как правило, лица, новые для этой техники будет бороться, потому что трудно поддерживать материалы и реагенты, чтобы быть полностью анаэробным.Через 24 часа после индуцирования экспрессии белка, собирать клетки центрифугации, и повторно бактериальных клеток гранулы в 20 миллилитров буфера амилозы колонки на 1,5 литра роста. Добавьте один миллиграмм лизозима в подвесную клетку и перемешайте клетки в течение 20 минут на льду. В конце инкубации, лизировать повторного раствора клеток через высокое давление гомогенизации с трех до пяти проходов примерно на 15000 пси, и передать белок в 50-миллилитровый центрифуги трубки.Промыть головное пространство азотом в течение одной минуты, и центрифуга клетки лисировать, чтобы удалить нерастворимый мусор. Перенесите супернатант как минимум на одну 50-миллилитровую трубку и завялите лизат резиновой перегородкой. Используя 20-го калибра иглы, медленно пузырь азота газа через раствор в течение двух минут, чтобы вытеснить кислорода.Затем оберните перегородку парафиновой пленкой, закрелите Парафильм медной проволокой и поместите супернатант в перчаточный ящик с материалами колонки. Когда растворитель находится чуть выше кровати смолы, в ранее подготовленной колонке амилоса, загрузите 50 миллилитров белкового супернатанта на колонку, собирая поток через пятими миллилитровые фракции под умеренно под давлением азота примерно в пять миллилитров в минуту. Когда весь поток-через был eluted, мыть столбец с еще тремя объемами столбца буфера амилой столбца.Добавьте пять резюме буфера элюции, а затем вручную соберите трехми миллилитровые фракции в стеклянных пробирках под азотом умеренного давления. Проверьте растворы присутствия кислорода с сульфатом аммония и дитиотрейтолом. Раствор станет темно-синим или черным, если кислород присутствует, как трубка справа.Наличие кислорода приведет к очищению белка с низкой каталитической активностью. Решения с минимальным кислородом настоящее время будет лаванды или светло-голубой полупрозрачный цвет, как трубка слева. Затем используйте внешнюю линию азота для давления перемешиваемой клеточной камеры и концентрируйте белок до 50 миллилитров при умеренной скорости перемешивания в два раза.Затем сконцентрировать белок до 10 миллилитров и отфильтровать концентрированный белок через фильтр шприца 0,45 микрометра. Aliquot 150 микролитров белка в отдельных 200-микролитера полимеразы цепной реакции труб. Затем удалите ограниченные алициты из бардачка для немедленного флэш-замораживания в жидком азоте и хранения при температуре минус 80 градусов по Цельсию.Для desB опреснительного, сначала добавьте три миллилитров Sephadex G-25 Грубый десалирование геля в девятими миллилитровый боросиликат колонки, и мыть колонку с двумя объемами столбца дегазации дегазации буфера. Когда DesB разморозится, загрузите очищенный белок на колонку через процесс, контролируемый гравитацией, и отбросьте поток через три капли белка в каждый из 12 флаконов, с приблизительно пятью миллилитров буфера опреснивания. Чтобы подготовить кислородный электрод, используйте ножницы, чтобы сократить один примерно 1,5-дюймовый квадрат бумаги спейсера, и вырезать небольшие треугольники на каждой стороне площади, с прорезями в углах, чтобы помочь в упаковке электрода.Добавьте пять капель раствора хлорида калия на серебряную анодную канавку электрода и соедините капли таким образом, чтобы они образуют непрерывное кольцо раствора. Добавьте две капли раствора хлорида калия в верхнюю часть платинового электрода и аккуратно поместите бумагу-пространство поверх платинового электрода, разглаживает бумагу-пространство, чтобы не было пузырьков воздуха. Вырезать примерно два дюйма длиной кусок мембраны S4 30m PTFE, и поместите его на верхней части бумаги спейсера, удаляя края мембраны, чтобы они выровнены с внешним кольцом электрода.Используя Аппликатор O-кольца, нажмите небольшой O-кольцо над электродом, чтобы обеспечить бумагу и мембрану на электроде, и поместите больший O-кольцо на круговой паз электрода, заботясь о том, чтобы под ним не было мембраны. Сдвиньте верхнюю камеру электрода на основание и свиньте две части вместе. Поместите собранный электрод на его основание и соедините электрод с системой мониторинга.Чтобы определить скорость энзиматической реакции, используйте чувствительный к кислороду электрод типа Clark, с компьютерной интеграцией для измерения потребления кислорода через блок управления электродом. Добавьте один миллилитр буфера Tris в соответствующем объеме субстрата в электродную камеру и перемешайте раствор в течение 10 секунд. Через 10 секунд, медленно запечатать камеру с поршень, и винт сверху вниз.Используйте чистую ткань, чтобы впитать избыток жидкости, которая вытесняется из камеры, и позволить электроду уравнять, где он может производить стабильное измерение концентрации кислорода в растворе, по крайней мере одну минуту. Затем используйте газопритяжный 10-микролитровый шприц, чтобы добавить примерно один микролитер фермента в электродную камеру через поршень и собрать данные о скорости. Когда вся скорость для данной концентрации субстрата была собрана, используйте пластиковую трубку, подключенную к боковой руке вакуумной колбы, чтобы очистить электродную камеру, и неоднократно промыть камеру в течение четырех-шести циклов с водой.Затем установите раствор в электроде, как только что продемонстрировано, используя новую концентрацию субстрата. SDS-PAGE гель анализ отдельных фракций из DesB-мальтозы связывания белка синтеза конструкции очистки показывает изоляцию чистого белкового продукта, в стороне от наличия DesB и мальтозы связывания белковых продуктов домена, которые расщепляются друг от друга. После того, как все кинетические измерения были приняты, активность DesB с галлатом, например, может быть получена путем измерения скорости потребления кислорода в различных концентрациях галлата.И наоборот, скорость ингибирования DesB с четырьмя нитрокатехолами может быть определена путем наблюдения за снижением скорости потребления кислорода DesB с одномимимола галлатом при наличии различных концентраций четырехтрокатехола, что указывает, например, на то, что четырехнитокатехол подавляет потребление кислорода и тем самым реакцию DesB. Хотя этот метод может дать представление об изучении феррос-зависимых ферментов диоксигеназы, он может быть применен к другим системам, таким как другие металлоэнзимы. Не забывайте, что работа в бардачке может быть сложной задачей, так что позаботьтесь, чтобы не спешить при выполнении этой техники.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Способ идентификации низкомолекулярных соединений ингибиторов белок-белкового взаимодействия между HCN1 и TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Экспрессия, очистка и антимикробная активность S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 в 1: один шаг очищение сродства для параллельного анализа протеин протеина и белка метаболит комплексов

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Очистка и восстановление TRPV1 для спектроскопического анализа

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

Эффективное очищение и LC-MS/MS-на основе анализа развития для десяти-одиннадцати транслокации-2 5-метилцитозин Dioxygenase

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Выборки и предварительной обработки эмали зубов карбонат для стабильной углерода и кислорода изотопный анализ

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

Изучая белка импорта в хлоропластов, используя протопластов

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Измерение и интерпретации показателей потребления кислорода в целом летать головы сегментов

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Протеомного анализа человека макрофагов поляризации в среде с низким содержанием кислорода

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Изучая РНК посредники РНК активирована во время цикла Mammalian клетки киназы протеина

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...