Name: analysis of epididymal protein synthesis and secretion
Uploaded: 2018-08-25T15:00:00
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Gli autori desidera ringraziare il National Health and Medical Research Consiglio di Australia progetto Grant APP1103176 per il supporto di questo lavoro.

Tutte le procedure sperimentali riguardanti la raccolta di tessuto animale sono state approvate dal comitato di etica e cura degli animali dell'Università di Newcastle.
1. immunofluorescenza delle sezioni dell'epididimo paraffina (figure 1 e 2)
<ol><li>Immediatamente dopo l'eutanasia dei topi adulti tramite inalazione di CO2 (topi svizzeri, oltre 8 settimane di vita), accuratamente sezionare l'epididimo (utilizzando forbici e pinzette) gratuita di sovrastante del tessuto connetti...

Questi studi incorporato l'uso del tessuto epididimario fisso di Bouin che era stati sottoposti a protocolli standard di sezionamento e di inclusione in paraffina. Soluzione fissante di Bouin comprende una miscela di formaldeide, acido picrico e acido acetico, con ogni componente con una funzione specifica e complementare. Così, formaldeide reagisce con le ammine primarie per formare legami incrociati della proteina, acido picrico penetra lentamente il tessuto formando sali e quindi la coagulazione delle proteine basich...

Gli spermatozoi di tutte le specie di mammiferi acquisiscono il potenziale per visualizzare avanti motilità progressiva e di fecondare un ovulo durante la loro discesa prolungata attraverso l'epididimo, una regione altamente specializzata del sistema del maschio condotto extra-testicolari, che possono prendere 7-14 giorni per navigare (a seconda della specie)1. A causa della estrema condensazione della cromatina paterna e lo spargimento della maggior parte del citoplasma che accompagna il cytodifferentiation degli spermatozoi all'interno dei testicoli, la loro successiva maturazione funzionale è guidato esclusivamente dalla loro interazione con il microambiente dell'epididimo. Questo ambiente è, a sua volta, creato dall'attività secretiva e assorbente del soma epididimaria fodera e visualizza un livello eccezionale di segmenti variazione1. Così, i segmenti più attivi in termini di sintesi delle proteine e secrezione sono quelli situati nella parte prossimale dell' epididimo (vale a dire, il caput e corpus)2. Questa attività rispecchia il profilo funzionale degli spermatozoi, con l'inizio primo di celle per visualizzare i tratti distintivi di competenza funzionale (cioè., motilità progressiva e la capacità di legarsi a zona acido-solubilizzato glicoproteine) seguente loro passaggio attraverso l' epididimo caput3. Questi attributi funzionali continuano a svilupparsi prima di raggiungere i livelli ottimali come lo sperma raggiunge il segmento distale dell'epididimo (cauda), in cui sono memorizzati in stato di quiescenza nella prontezza per eiaculazione precoce. La formazione e la manutenzione di questo serbatoio di immagazzinaggio dello sperma è anche intimamente legata all'epitelio di rivestimento, che nella cauda è dominato dalla forte attività assorbente4,5. Anche se le differenze anatomiche sono stati segnalati6,7,8, tale divisione regionalizzata del lavoro sembra essere una caratteristica dell'epididimo che è condivisa tra la maggior parte delle specie di mammiferi studiato fino ad oggi, compreso il nostro9,10. Infatti, da un punto di vista clinico, è noto che la disfunzione dell'epididimo dà un importante contributo all'eziologia del fattore maschio sterilità11, evidenziando così l'importanza della comprensione della regolazione di questo tessuto specializzato.
È quindi deplorevole che la nostra comprensione della fisiologia dell'epididimo e i meccanismi che regolano le fasi sequenziale di maturazione degli spermatozoi e archiviazione all'interno di questo tessuto, rimangono per essere completamente risolto. Tra i fattori di contributo, limitanti avanzamenti nella ricerca dell'epididimo sono la complessità di questo tessuto e la conoscenza dei meccanismi che esercitano il controllo normativo sopra suo microambiente luminale. Anatomicamente, sappiamo che di là della distinzione dei segmenti caput, corpus e cauda, l'epididimo può essere ulteriormente suddivisi in diverse zone (Figura 1A), ciascuno separati da setti12 e caratterizzata da profili discreti di proteina/del gene espressione13,14,15,16,17,18. Infatti, sulla base di dettagliate profiling trascrizionale dell'espressione genica segmentale nell'epididimo, oltre 6 e 9 zone distinte dell'epididimo sono stati segnalati nei modelli di topo e di ratto, rispettivamente19,20. Tale complessità presumibilmente riflette la composizione del soma dell'epididimo, un epitelio pseudostratified composto da numerosi tipi cellulari differenti; ogni diverse rispetto alle loro attività di abbondanza, distribuzione e secretiva/assorbente lungo la lunghezza del tratto. Così, le cellule principali sono di gran lunga la più abbondante dell'epididimo cella tipo che costituisce verso l'alto di 80% di tutte le cellule epiteliali. Di conseguenza, le cellule principali sono responsabili per la maggior parte della proteina dell'epididimo biosintesi e secrezione5. Al contrario, la popolazione di cellule chiare, che si allineano come il tipo di cella secondo più abbondante all'interno del soma dell'epididimo, è principalmente coinvolti in assorbimento selettivo di luminal componenti e l'acidificazione di questo microambiente5. Aggiunta di un altro livello di complessità, androgeni e altri fattori di lumicrine di origine testicolare esercitano controllo differenziale su ciascuno di questi tipi di cellule dell'epididimo a seconda del loro posizionamento lungo il tratto.
Nonostante le limitazioni imposte da tale complessità, incursioni significative continuano a essere trasformato in risoluzione la base meccanicistica della funzione dell'epididimo. Una chiave per questi studi è stata l'applicazione di strategie avanzate spettrometria di massa per stabilire gli inventari di larga scala del proteoma dell'epididimo, in tandem con analisi dettagliate delle singole proteine scelti fra queste indagini iniziali. Un'illustrazione di questo approccio è la nostra recente caratterizzazione della famiglia DNM di mechanoenzymes nel modello del mouse21. Il nostro interesse iniziale in DNM è stato alimentato da sua duplice azione nell'accoppiamento di exo - ed endocitosi processi. Basandosi su queste osservazioni, siamo stati in grado di dimostrare che le tre isoforme di canoniche di DNM (DNM1 - DNM3) sono altamente espressi nell'epididimo del mouse e posizionate in modo appropriato per soddisfare i ruoli regolatori in proteina secrezione e assorbimento21 . Inoltre, siamo stati in grado di distinguere chiaramente ciascuna isoforma DNM sulla base della loro localizzazione cellulare e subcellulare, suggerendo così che possiedono complementari, al contrario di attività ridondanti, all'interno l' epitelio dell'epididimo21.
Qui, descriviamo la metodologia sperimentale impiegata per lo studio dell'espressione di DNM nell'epididimo del mouse con la speranza che queste informazioni saranno trovare ampia applicazione nella caratterizzazione delle proteine dell'epididimo alternativi e contribuire così alla nostra comprensione della funzione di questo importante elemento del tratto riproduttivo maschio. In particolare, descriviamo lo sviluppo di una metodologia robusta per l'etichettatura di immunofluorescenza di proteine bersaglio in paraffina sezioni dell'epididimo e il successivo rilevamento della distribuzione spaziale di queste proteine tramite immunofluorescenza microscopia. Documentiamo ulteriormente il nostro recentemente ottimizzato protocolli22 per l'isolamento e la caratterizzazione di epididymosomes; piccole vescicole di esosomi-come che costituiscono gli elementi chiave del profilo secretivo dell'epididimo e sembrano tenere un ruolo di primo piano nella promozione di maturazione degli spermatozoi23. Come un approccio complementare, descriviamo anche la rilevazione di immunofluorescenza di proteine bersaglio in una linea cellulare di topo immortalizzate caput epididimario epiteliali (mECap18) e l'uso di questa risorsa come un modello con cui esplorare il regolamento di epididimaria l'attività secretiva in vitro.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dynamin 1 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab108458</td>
			<td>Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamin 2 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-6400</td>
			<td>Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamin 3 antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>14737-1-AP</td>
			<td>Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP6V1B1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-21206</td>
			<td>Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553758</td>
			<td>Host species: Rat, Isotype: IgG, Class: monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flotillin-1 antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1180</td>
			<td>Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALOX15 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab80221</td>
			<td>Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUBB antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-5274</td>
			<td>Host species: Mouse, Isotype: IgG, Class: monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSMD7 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11436</td>
			<td>Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Goat Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A11055</td>
			<td>Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Goat Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A11058</td>
			<td>Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rat Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A11007</td>
			<td>Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rabbit HRP</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>DC03L</td>
			<td>Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rat HRP</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>DC01L</td>
			<td>Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Mouse HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td>Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>propidium iodide (PI)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>475904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td>SFBS-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#945;-androstan-17&#946;-ol-3-oneC-IIIN</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>1330-20-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Astral</td>
			<td>0497-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-octane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-gysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>78787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>A6-2.5 L GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly (vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>783-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss Axio Imager A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>Optima Max-XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuges</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Heracell</td>
			<td>150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Orbital Shaker</td>
			<td>Ratek</td>
			<td>OM7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>LG</td>
			<td>MS3840SR /00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab pH Meter</td>
			<td>MeterLab</td>
			<td>PHM220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid-repellent slide marker</td>
			<td>Daido Sangyo</td>
			<td>Mini</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>CELLSTAR</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plate</td>
			<td>CELLSTAR</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>Mikro-Glass</td>
			<td>SF41296PLMK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m filter</td>
			<td>Millox-HV</td>
			<td>SLHV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes Dustfree Paper</td>
			<td>KIMTECH</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tube (2.2 ml, 11 &#215; 35 mm)</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>347356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tube (3.2 ml, 13 &#215; 56 mm)</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>362305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 70 &#181;m Nylon</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35 &#215; 10 mm with cams</td>
			<td>SARSTED</td>
			<td>82.1135.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide jar</td>
			<td>TRAJAN</td>
			<td>#23 319 00</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of epididymal protein synthesis and secretion

L'epididimo mammiferi genera uno dei fluidi intraluminale più complessi di qualsiasi ghiandola endocrina al fine di sostenere la maturazione post-testicolare e la conservazione degli spermatozoi. Tale complessità presenta dovuto l'attività secretiva e assorbente combinata delle cellule epiteliali di rivestimento. Qui, descriviamo le tecniche per l'analisi della sintesi proteica dell'epididimo e secrezione focalizzando l'attenzione sulla famiglia delle proteine modello della dinamina (DNM) mechanoenzymes; GTPasi grandi che hanno il potenziale per regolare gli eventi traffico di membrana bi-direzionale. Per lo studio dell'espressione proteica in tessuto epididimario, descriviamo solida metodologia per l'etichettatura di immunofluorescenza di proteine bersaglio nelle sezioni di paraffina e la successiva rilevazione della distribuzione spaziale di queste proteine tramite microscopia di immunofluorescenza. Inoltre descriviamo la metodologia ottimizzata per l'isolamento e la caratterizzazione di esosomi come vescicole, noto come epididymosomes, che sono secreti nel lume dell'epididimo di partecipare a comunicazione intercellulare con la maturazione delle cellule dello sperma. Come un approccio complementare, descriviamo anche la rilevazione di immunofluorescenza delle proteine bersaglio in una linea cellulare di SV40-immortalato mouse caput epididimario epiteliali (mECap18). Inoltre discutiamo l'utilità della linea cellulare mECap18 come un modello adatto in vitro con cui esplorare il regolamento di attività secretiva dell'epididimo. Per questo scopo, si descrivono i requisiti coltura per il mantenimento della linea cellulare mECap18 e l'uso di regimi di inibizione farmacologica selettiva che sono in grado di influenzare il loro profilo di proteine secretorie. Questi ultimi sono prontamente valutati tramite raccolta del medium condizionato di cultura, la concentrazione di proteine secrete tramite precipitazione di acido tricloroacetico/acetone e la loro successiva analisi tramite SDS-PAGE e immunoblotting. Sosteniamo che questi metodi combinati sono adatti per l'analisi dei bersagli proteici epididimaria alternativo come un preludio alla determinazione del loro ruolo funzionale in maturazione degli spermatozoi e/o deposito.

Figura 1 e Figura 2 mostrano risultati rappresentativi della localizzazione di immunofluorescenza di DNM nell'epididimo caput del mouse. Ognuna delle tre isoforme DNM studiati i profili di visualizzazione localizzazione distinta. Così, DNM1 è caratterizzato da modesta etichettatura diffusa delle cellule dell'epididimo in tutto il segmento e caput dell'epididimo iniziale (Figura 2A)...

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Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion

Qui, segnaliamo la localizzazione di immunofluorescenza della dinamina per illustrare i protocolli per il rilevamento delle proteine nelle sezioni dell'epididimo paraffina-incastonato del mouse e quelli di una linea di cellulari immortalizzate epididimaria (mECap18). Inoltre descriviamo i protocolli per l'isolamento delle proteine secretorie da sia fluido epididimario e media condizionato delle cellule.

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