Name: analysis of epididymal protein synthesis and secretion
Uploaded: 2018-08-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion at JoVE.com

Авторы хотели бы признать национального здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралии проект Грант APP1103176 за поддержку этой работы.

Все экспериментальные процедуры, связанные с коллекцией тканей животных были утверждены университета Ньюкасла животных уход и Комитета по этике.
1. иммунофлюоресценции окрашивания от парафин врезанных эпидидимальных секций (рисунки 1 и 2)
<ol><li>Сразу же после эвтаназии в...

Эти исследования включено использование Буэна в фиксированной эпидидимальных ткани, которые подвергались встраивание парафин и стандартные протоколы секущей. Буэна фиксирующие решение состоит из смеси формальдегида, Пикриновая кислота и уксусная кислота, с каждым компонентом, имею?...

Сперматозоиды всех видов млекопитающих приобретать потенциал для отображения вперед прямолинейное и оплодотворить яйцеклетку во время их продолжительного спуска через придатка, узкоспециализированные региона мужской экстра яичка канальные системы, которая может 7-14 дней для навигации (в зависимости от вида)1. Из-за экстремальных конденсации отцовской хроматина и пролития часть цитоплазмы, которая сопровождает чувствующего сперматозоидов в яичках их последующее функционального созревания управляется исключительно их взаимодействия с эпидидимальных микроокружения. Это окружение в свою очередь, создается секреторную и освоения активность Сома эпидидимальных накладки и отображает исключительный уровень сегмента сегмент вариант1. Таким образом наиболее активных сегментов с точки зрения белкового синтеза и секреции являются те, которые расположены в проксимальной части придатка (а именно, caput и корпус)2. Эта деятельность отражает профиль функциональной сперматозоидов, с началом первой ячейки для отображения клейма функциональной компетенции (т.е., прямолинейное и возможность привязки к солюбилизирован кислоты zona гликопротеинов) следующие их проход через caput придатка3. Эти функциональные атрибуты продолжают развивать до достижения оптимального уровня как сперме достигнуть дистальной эпидидимальных сегмента (конского), где они хранятся в состоянии покоя в готовности для эякуляции. Формирование и поддержание этого водохранилища хранения спермы также тесно связаны с подкладкой эпителия, что в конского доминирует сильный освоения деятельности4,5. Хотя анатомические различия были сообщил6,7,8, такие регионализованное разделение труда, как представляется, характеристика придатка, которая является общей среди большинства млекопитающих учился на сегодняшний день, включая наш собственный9,10. Действительно с точки зрения клинической, известно, что эпидидимальных дисфункция делает важный вклад этиологии мужского фактора бесплодия11, таким образом подчеркнув важность понимания регулирования этой специализированной ткани.
Поэтому весьма прискорбно, что наше понимание эпидидимальных физиологии и механизмов, которые регулируют последовательных этапов созревания сперматозоидов и хранение в пределах этой ткани, по-прежнему быть полностью урегулирован. Среди факторов ограничивающих прогресс в исследованиях эпидидимальных являются общей сложности этой ткани и знаний о механизмах, которые оказывают регулирующего контроля над его Люминал микроокружения. Анатомически мы знаем, что помимо различия caput, корпус и конского сегментов, придатка могут подразделяться на несколько зон (Рисунок 1A), каждый разделены перегородками12 и характеризуется дискретных профили гена/белка выражение13,14,,1516,17,18. Действительно на основе подробного транскрипционный анализ профиля экспрессии генов сегментарный в придатка, как 6 и 9 различных эпидидимальных зон были зарегистрированы в моделях мыши и крысы, соответственно19,20. Такие сложности предположительно отражает состав эпидидимальных сома, псевдомногослойный эпителия, состоящий из многочисленных различных типов клеток; Каждый различные их изобилие, распределения и секреторную/освоения деятельности вдоль тракта. Таким образом основные клетки являются, на сегодняшний день наиболее распространенным эпидидимальных ячейки типа составляют свыше 80% всех эпителиальных клеток. Соответственно основные клетки несут ответственность за основную часть эпидидимальных белка биосинтеза и секреции5. Напротив Светлоклеточная население, которое выстраивают в ряд как вторым наиболее распространенным типом ячейки в пределах эпидидимальных сома, занимаются прежде всего избирательного поглощения Люминал компонентов и подкисление этой микроокружения5. Добавляя еще один уровень сложности, андрогены и других факторов lumicrine яичек происхождения оказывают Дифференциальный контроль над каждым из этих типов эпидидимальных ячеек в зависимости от их размещения вдоль тракта.
Несмотря на ограничения, введенные на такие сложности продолжают быть существенных успехов в решении механистический основу эпидидимальных функции. Ключ для этих исследований был применение стратегий передовых масс-спектрометрии для установления широких масштабах инвентаризации эпидидимальных протеома в тандеме с детальным анализом отдельных белков, отобранных из числа этих первоначальных обследований. Примером такого подхода является нашей недавней характеристика DNM семьи mechanoenzymes в мыши модель21. Наш первоначальный интерес в ДНМ был вызван его двойного действия в муфте экзо - и endocytotic процессов. Опираясь на эти замечания, мы смогли продемонстрировать, что три канонические изоформ DNM (DNM1 - DNM3) сильно выражена в мыши придатка и надлежащим образом позиционируется для выполнения нормативных функций секрецию белка и поглощения21 . Кроме того мы смогли четко дифференцировать каждый DNM изоформы на основе их клеточном и субклеточном локализации, таким образом, о том, что они обладают взаимодополняющими, в отличие от избыточной, деятельность в рамках эпидидимальных эпителия21.
Здесь мы описываем экспериментальной методологии для изучения DNM выражения в мыши придатка с надеждой на то, что эта информация будет найти более широкое применение в характеристике альтернативных эпидидимальных белков и тем самым способствовать нашей понимание функции этого важного элемента мужского репродуктивного тракта. В частности мы описывают развитие надежной методологии иммунофлюоресценции маркировки белков-мишеней в парафин врезанных эпидидимальных секций и последующего обнаружения пространственного распределения этих белков через иммунофлуоресценции микроскопия. Мы далее документ нашего недавно оптимизированный протоколы22 для изоляции и характеристика epididymosomes; малые exosome как пузырьки, которые представляют собой ключевые элементы эпидидимальных секреторной профиля и появляются провести важную роль в продвижении сперматозоидов созревания23. Как дополнительный подход мы также описывают иммунофлюоресценции обнаружение целевых белков в увековечен мыши caput эпидидимальных эпителия (mECap18) клеток линии и использования этого ресурса в качестве модели с для изучения регуляции эпидидимальных секреторную активность в пробирке.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dynamin 1 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab108458</td>
			<td>Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamin 2 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-6400</td>
			<td>Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamin 3 antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>14737-1-AP</td>
			<td>Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP6V1B1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-21206</td>
			<td>Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553758</td>
			<td>Host species: Rat, Isotype: IgG, Class: monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flotillin-1 antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1180</td>
			<td>Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALOX15 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab80221</td>
			<td>Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUBB antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-5274</td>
			<td>Host species: Mouse, Isotype: IgG, Class: monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSMD7 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11436</td>
			<td>Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Goat Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A11055</td>
			<td>Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Goat Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A11058</td>
			<td>Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rat Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A11007</td>
			<td>Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rabbit HRP</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>DC03L</td>
			<td>Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rat HRP</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>DC01L</td>
			<td>Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Mouse HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td>Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>propidium iodide (PI)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>475904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td>SFBS-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#945;-androstan-17&#946;-ol-3-oneC-IIIN</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>1330-20-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Astral</td>
			<td>0497-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-octane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-gysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>78787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>A6-2.5 L GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly (vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>783-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss Axio Imager A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>Optima Max-XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuges</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Heracell</td>
			<td>150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Orbital Shaker</td>
			<td>Ratek</td>
			<td>OM7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>LG</td>
			<td>MS3840SR /00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab pH Meter</td>
			<td>MeterLab</td>
			<td>PHM220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid-repellent slide marker</td>
			<td>Daido Sangyo</td>
			<td>Mini</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>CELLSTAR</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plate</td>
			<td>CELLSTAR</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>Mikro-Glass</td>
			<td>SF41296PLMK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m filter</td>
			<td>Millox-HV</td>
			<td>SLHV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes Dustfree Paper</td>
			<td>KIMTECH</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tube (2.2 ml, 11 &#215; 35 mm)</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>347356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tube (3.2 ml, 13 &#215; 56 mm)</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>362305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 70 &#181;m Nylon</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35 &#215; 10 mm with cams</td>
			<td>SARSTED</td>
			<td>82.1135.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide jar</td>
			<td>TRAJAN</td>
			<td>#23 319 00</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of epididymal protein synthesis and secretion

Млекопитающих придатка генерирует один из самых сложных жидкостей внутрипросветная любой эндокринной железы с целью поддержки после яичка созревания и хранения сперматозоидов. Такая сложность возникает из-за совместная деятельность секреторных и освоения накладки эпителиальных клеток. Здесь мы описываем методы для анализа эпидидимальных белкового синтеза и секреции, сосредоточив внимание на модели белков семейства Динамин (ДНМ) mechanoenzymes; большие GTPases, которые имеют потенциал, чтобы регулировать двунаправленным мембраны оборота событий. Для изучения экспрессии белков в эпидидимальных ткани мы описываем надежной методологии Этикетировочный иммунофлуоресценции белков-мишеней в парафин врезанных секций и последующего обнаружения пространственного распределения этих белков через иммунофлуоресценции. Мы также обсудим оптимизированный методологии для изоляции и характеристика exosome как пузырьки, известный как epididymosomes, который выделяется в эпидидимальных люмен участвовать в межклеточные связи с созревания сперматозоидов. Как дополнительный подход мы также описывают иммунофлюоресценции обнаружение целевых белков в увековечен SV40 мыши caput эпидидимальных эпителия (mECap18) клеток линии. Кроме того мы обсуждаем утилита mECap18 клеточной линии как модель подходит в пробирке с для изучения регулирование эпидидимальных секреторную активность. Для этой цели мы описываем культивирования требования для поддержания линии клеток mECap18 и использование селективного фармакологических ингибирование схем, которые способны влиять на их профиль белка секреторных. Они легко оценить через уборки кондиционером питательной среды, концентрация секретируемые белки через трихлоруксусной кислоты/ацетон осадков и их последующего анализа через SDS-PAGE и immunoblotting. Мы утверждаем, что эти комбинированные методы подходят для анализа альтернативных эпидидимальных белковых мишеней в качестве прелюдии к определению их функциональной роли в созревания сперматозоидов и/или хранения.

Рисунок 1 и Рисунок 2 представителя результаты иммунофлюоресценции локализации DNM в мыши caput придатка. Каждый из трех изоформ DNM расследование профили отображения отдельных локализации. Таким образом DNM1 характеризуется относи?...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion at JoVE.com

Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion

Здесь мы приводим иммунофлюоресценции локализации Динамин для иллюстрации протоколы для обнаружения белков в парафин врезанных мыши эпидидимальных секций и тех, кто увековечен эпидидимальных клеточной линии (mECap18). Мы также описывают протоколы для изоляции секреторной белков от эпидидимальных жидкости и кондиционером ячейки СМИ.

Анализ эпидидимальных белкового синтеза и секреции

The mammalian epididymis generates one of the most complex intraluminal fluids of any endocrine gland in order to support the post-testicular maturation ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Количественный анализ экспрессии белка по изучению Lineage Спецификация в клетках мышиной предимплантационной эмбрионов

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Одновременная оценка кардиомиоцитов синтеза ДНК и плоидности: метод для оказания помощи квантификации кардиомиоцитов регенерации и оборота

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Простой метод для идентификации киназ, которые регулируют плюрипотентность эмбриональных стволовых клеток посредством высокопроизводительного скрининга ингибиторов

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Визуализация и количественный анализ эмбрионального ангиогенеза у<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands

Анализ белково-белковых взаимодействий и ко-локализация между компонентами разрывов, затянутых и адгезивных соединений в молочных железах мышей

Cell-cell interactions play a pivotal role in preserving tissue integrity and the barrier between the different compartments of the mammary gland. These ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Корреляционные суперразрешением и электронной микроскопии решить локализация белка в Zebrafish сетчатки

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Кинетический анализ Vasculogenesis дает количественную оценку динамики Vasculogenesis и ангиогенеза в пробирке

Vasculogenesis is a complex process by which endothelial stem and progenitor cells undergo de novo vessel formation. Quantitative assessment of ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

Изоляция и окрашивание мыши кожи кератиноцитов для клеточного цикла Специфический анализ выражения клеточного белка массой цитометрии

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging и анализ мышечных сокращений в дрозофилы эмбриона

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

Приготовление экстракта белка и ко-иммунопреципиентация от Caenorhabditis elegans

Co-immunoprecipitation methods are frequently used to study protein-protein interactions. Confirmation of hypothesized protein-protein interactions or ...