Name: isolation of extracellular vesicles from murine bronchoalveolar lavage fluid using an ultrafiltration centrifugation technique
Uploaded: 2018-11-09T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique at JoVE.com

العمل معتمد من قبل منح المعاهد الوطنية للصحة/NHLBI HL103868 (للكمبيوتر) و HL137076 (على الكمبيوتر)، ومعونات جمعية القلب الأمريكية (للكمبيوتر) وجائزة البحث معهد السرطان الشامل صامويل أوشين (سوتشي) سرطان الرئة (للكمبيوتر). ونود أن نعرب عن تقديرنا الكبير لمعهد القلب سميت في سيدرز-سيناء الطبي أن يوفر لنا آلة Nanosight نانوحبيبات EV تتبع تحليل.

قد أقر استخدام الحيوانات وجميع الإجراءات الحيوان "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجان (إياكوك) في سيدرز-سيناء الطبي مركز (كسمك).
1-مورين للفيسيولوجيا الغسل السائل (بالف) جمع وإعداد
<ol><li>مجموعة بالف<ol>
<li>Euthanize الفئران مع مزيج من الكيتامين (300 ملغ/كغ) وإكسيلازيني (30 ملغ/كغ) عب...

<ol>
	<li>Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+composition,+biogenesis+and+function.">Exosomes: composition, biogenesis and function.</a> Nature Reviews Immunology. 2, 569-579 (2002).</li><li>Kosaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+Mechanisms+and+Intercellular+Transfer+of+MicroRNAs+in+Living+Cells.">Secretory Mechanisms and Intercellular Transfer of MicroRNAs in Living Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17442-17452 (2010).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Fujita, Y., Kosaka, N., Araya, J., Kuwano, K., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+lung+microenvironment+and+pathogenesis.">Extracellular vesicles in lung microenvironment and pathogenesis.</a> Trends in Molecular Medicine. 21 (9), 533-542 (2015).</li><li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+function+of+exosomes+in+cancer.">The biology and function of exosomes in cancer.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).</li><li>Janowska-Wieczorek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+derived+from+activated+platelets+induce+metastasis+and+angiogenesis+in+lung+cancer.">Microvesicles derived from activated platelets induce metastasis and angiogenesis in lung cancer.</a> International Journal of Cancer. 113 (5), 752-760 (2005).</li><li>Valadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells.">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).</li><li>Colombo, M., Raposo, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis,+Secretion,+and+Intercellular+Interactions+of+Exosomes+and+Other+Extracellular+Vesicles.">Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 255-289 (2014).</li><li>Rocco, G. D., Baldari, S., Toietta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+other+extracellular+vesicles-mediated+microRNA+delivery+for+cancer+therapy.">Exosomes and other extracellular vesicles-mediated microRNA delivery for cancer therapy.</a> Translational Cancer Research. 6 (Supplement 8), S1321-S1330 (2017).</li><li>Peterson, M. F., Otoc, N., Sethi, J. K., Gupta, A., Antes, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+systems+for+exosome+investigation.">Integrated systems for exosome investigation.</a> Methods. 87 (1), 31-45 (2015).</li><li>Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+isolation+and+characterization:+toward+clinical+application.">Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application.</a> Journal of Clinical Investigation. 126, 1152-1162 (2016).</li><li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles:+results+of+a+worldwide+survey.">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945 (2016).</li><li>Inglis, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+to+improve+detection+and+analysis+of+extracellular+vesicles+using+flow+cytometry.">Techniques to improve detection and analysis of extracellular vesicles using flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 87 (11), 1052-1063 (2015).</li><li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+Exosome+Isolation+Techniques.">Progress in Exosome Isolation Techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li><li>Willis, G. R., Kourembanas, S., Mitsialis, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+Exosome-Based+Therapeutics:+Isolation,+Heterogeneity,+and+Fit-for-Purpose+Potency.">Toward Exosome-Based Therapeutics: Isolation, Heterogeneity, and Fit-for-Purpose Potency.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 20389 (2017).</li><li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 27031 (2015).</li><li>Benedikter, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafiltration+combined+with+size+exclusion+chromatography+efficiently+isolates+extracellular+vesicles+from+cell+culture+media+for+compositional+and+functional+studies.">Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies.</a> Scientific Reports. 7 (1), 15297 (2017).</li><li>Vergauwen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confounding+factors+of+ultrafiltration+and+protein+analysis+in+extracellular+vesicle+research.">Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2704 (2017).</li><li>Kesimer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+exosome-like+vesicles+released+from+human+tracheobronchial+ciliated+epithelium:+a+possible+role+in+innate+defense.">Characterization of exosome-like vesicles released from human tracheobronchial ciliated epithelium: a possible role in innate defense.</a> The FASEB Journal. 23 (6), 1858-1868 (2009).</li><li>Torregrosa Paredes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoalveolar+lavage+fluid+exosomes+contribute+to+cytokine+and+leukotriene+production+in+allergic+asthma.">Bronchoalveolar lavage fluid exosomes contribute to cytokine and leukotriene production in allergic asthma.</a> Allergy. 67 (7), 911-919 (2012).</li><li>Alipoor, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+Exosomal+miRNA+in+Respiratory+Diseases.">Exosomes and Exosomal miRNA in Respiratory Diseases.</a> Mediators of Inflammation. 2016, 5628404 (2016).</li><li>Hough, K. P., Chanda, D., Duncan, S. R., Thannickal, V. J., Deshane, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+Immunoregulation+of+Chronic+Lung+Diseases.">Exosomes in Immunoregulation of Chronic Lung Diseases.</a> Allergy. 72 (4), 534-544 (2017).</li><li>Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoalveolar+Lavage+of+Murine+Lungs+to+Analyze+Inflammatory+Cell+Infiltration.">Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).</li><li>Minciacchi, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MYC+Mediates+Large+Oncosome-Induced+Fibroblast+Reprogramming+in+Prostate+Cancer.">MYC Mediates Large Oncosome-Induced Fibroblast Reprogramming in Prostate Cancer.</a> Cancer Research. 77 (9), 2306-2317 (2017).</li><li>Koliha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+Affects+the+Composition+of+Blood+Cell-Derived+Extracellular+Vesicles.">Melanoma Affects the Composition of Blood Cell-Derived Extracellular Vesicles.</a> Frontiers in Immunology. 7, 581 (2016).</li><li>Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses.">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).</li><li>Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes/microvesicles+as+a+mechanism+of+cell-to-cell+communication.">Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication.</a> Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).</li><li>Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+microvesicles:+extracellular+vesicles+for+genetic+information+transfer+and+gene+therapy.">Exosomes and microvesicles: extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy.</a> Human Molecular Genetics. 21, R125-R134 (2012).</li><li>Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Guti&#233;rrez-V&#225;zquez, C., S&#225;nchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+it+out:+Regulation+of+exosome+loading.">Sorting it out: Regulation of exosome loading.</a> Seminars in Cancer Biology. 28, 3-13 (2014).</li><li>Hoshino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+exosome+integrins+determine+organotropic+metastasis.">Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis.</a> Nature. 527, 329-335 (2015).</li><li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Exosome+Total+Isolation+Chip.">The Exosome Total Isolation Chip.</a> ACS Nano. 11 (11), 10712-10723 (2017).</li><li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator.">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).</li><li>Zhao, Z., Yang, Y., Zeng, Y., He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Microfluidic+ExoSearch+Chip+for+Multiplexed+Exosome+Detection+Towards+Blood-based+Ovarian+Cancer+Diagnosis.">A Microfluidic ExoSearch Chip for Multiplexed Exosome Detection Towards Blood-based Ovarian Cancer Diagnosis.</a> Lab on a Chip. 16 (3), 489-496 (2016).</li><li>Fang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+application+of+a+microfluidic+chip+for+immunocapture+and+quantification+of+circulating+exosomes+to+assist+breast+cancer+diagnosis+and+molecular+classification.">Clinical application of a microfluidic chip for immunocapture and quantification of circulating exosomes to assist breast cancer diagnosis and molecular classification.</a> PloS ONE. 12 (4), e0175050 (2017).</li><li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator.">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> American Journal Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).</li><li>Kornilov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+ultrafiltration-based+protocol+to+deplete+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum.">Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).</li><li>Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+protein,+microRNA,+and+mRNA+yields+using+different+methods+of+urinary+exosome+isolation+for+the+discovery+of+kidney+disease+biomarkers.">Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers.</a> Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).</li><li>Bosch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+prevents+aggregation+of+exosomes+and+cryodamage.">Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage.</a> Scientific Reports. 6 (1), 329 (2016).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+progenitor+cell-derived+exosomes+prevent+cardiomyocytes+apoptosis+through+exosomal+miR-21+by+targeting+PDCD4.">Cardiac progenitor cell-derived exosomes prevent cardiomyocytes apoptosis through exosomal miR-21 by targeting PDCD4.</a> Cell Death &amp; Disease. 7 (6), e2277 (2016).</li><li>Agarwal, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental,+Systems+and+Computational+Approaches+to+Understanding+the+MicroRNA-Mediated+Reparative+Potential+of+Cardiac+Progenitor+Cell-Derived+Exosomes+From+Pediatric+Patients.">Experimental, Systems and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients.</a> Circulation Research. 120 (4), 701-712 (2017).</li><li>Merchant, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfiltration+isolation+of+human+urinary+exosomes+for+characterization+by+MS.">Microfiltration isolation of human urinary exosomes for characterization by MS.</a> PROTEOMICS - Clinical Applications. 4 (1), 84-96 (2010).</li><li>Gouin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+method+for+identification+of+suitable+reference+genes+in+extracellular+vesicles.">A comprehensive method for identification of suitable reference genes in extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1347019 (2017).</li><li>Betsuyaku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Granule+Proteins+in+Bronchoalveolar+Lavage+Fluid+from+Subjects+with+Subclinical+Emphysema.">Neutrophil Granule Proteins in Bronchoalveolar Lavage Fluid from Subjects with Subclinical Emphysema.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159 (6), 1985-1991 (1999).</li></ol>

في العقود القليلة الماضية، وقد متدهور العلماء دلالات من المركبات الكهربائية في التوازن الخلوية. الأهم من ذلك، تؤدي المركبات الكهربائية أدواراً رئيسية في العديد من الأمراض العمليات بتحوير الخلايا المجاورة والبعيدة من خلال تلك الشحنات النشطة بيولوجيا الجزيئات1،<sup class="...

اكسوسوميس هي مجموعة فرعية أصغر من المركبات الكهربائية، 50 – 200 نانومتر في القطر، ولها وظائف متعددة والبيولوجية عبر مجموعة متنوعة من إشارات العمليات1،2،3،،من45. أنها تنظم الخلايا والأنسجة والتوازن أساسا بتيسير الاتصالات بين الخلايا عن طريق جزيئات البضائع مثل الدهون والبروتينات، والأحماض النووية6،،من78،9 . واحد خطوة حاسمة في البحث EV هو عملية العزل. التفضيلية تنبيذ فائق (UC), مع أو بدون كثافة التدرج الطرد المركزي (DGC)، يعتبر النهج معيار الذهب، ولكن هذا الأسلوب يحمل القيود الرئيسية، بما في ذلك عدم كفاية معدلات الاسترداد EV وقابلية منخفضة10 , 11 , 12، التي تقيد استخدامها أفضل إلى أكبر حجم العينات، مثل خلية ثقافة اكسوسومي طافية أو ارتفاع إنتاج العينات. مزايا وعيوب الأساليب الأخرى، مثل حجم الاستبعاد ultrafiltration أو اللوني، عزل إيمونوافينيتي بواسطة الخرز أو الأعمدة، وميكروفلويديكس، موصوفة جيدا، ووضعت إجراءات تكميلية الحديثة إلى التغلب عليها، وتقليل القيود التقنية في كل نهج12،،من1113،،من1415. البعض الآخر قد أظهرت أن أولترافيلتريشن الطرد المركزي (الوليد) بغشاء نانوبوروس في وحدة التصفية وهي تقنية بديلة يوفر النقاء مقارنة بتفرد أسلوب16،،من1718. يمكن اعتبار هذا الأسلوب أحد الأساليب البديلة العزلة.
للفيسيولوجيا الغسل السائل (بالف) تحتوي على المركبات الكهربائية التي تمتلك العديد من الوظائف البيولوجية في مختلف ظروف الجهاز التنفسي19،،20،21،22. دراسة يستتبع المركبات الكهربائية المستمدة من بالف بعض التحديات بسبب اختزاع الإجراء القصبات في البشر، فضلا عن كمية محدودة من استعادة السوائل الغسل. في الحيوانات المختبرية الصغيرة مثل الفئران، ملليلتر قليلة فقط يمكن استردادها في الظروف العادية الرئة، وحتى أقل من ذلك في الرئتين ملتهبة أو تليفية23. وبالتالي فإن جمع كمية كافية من بالف لعزل EV تنبيذ فائق تفاضلية للتطبيقات المتلقين للمعلومات قد لا يكون ممكناً. ومع ذلك، عزل السكان EV الصحيح عاملاً حاسما لدراسة الوظائف البيولوجية EV. التوازن الدقيق بين الكفاءة والفعالية لا يزال يشكل تحديا في أساليب العزلة EV الراسخة.
في هذه الدراسة الحالية، ونحن تبين أن نهج ultrafiltration الطرد مركزي، استخدام كاتشين 100 وزن الجزيئي وقف إنتاج المواد الانشطارية (موكو) نانوميمبراني تصفية وحدة، مناسبة للعينة البيولوجية صغيرة الحجم مثل بالف. هذا الأسلوب هو بسيط وفعال، ويوفر درجة نقاء عالية وقابلية لدعم دراسة المركبات الكهربائية المستمدة من بالف.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 centrifugal filters Ultracel-100K</td>
			<td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Corning Cellgro, Manassas, VA</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td>
			<td>EMD8550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Research Products International, Prospect, IL</td>
			<td>75277-39-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Corning Cellgro, Manassas, VA</td>
			<td>46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td>
			<td>S3014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep</td>
			<td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td>
			<td>MKCD9753</td>
			<td>Density Gradient Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>VetOne, Boise, ID</td>
			<td>13985-702-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Akorn Animal Health, Lake Forest, IL</td>
			<td>59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td>BD Syringe, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>309656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angiocatheter 20G</td>
			<td>BD Syringe, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>381703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes 15 mL</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes 50 mL</td>
			<td>Corning Cellgro, Manassas, VA</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicinchonic acid (BCA) protein assay</td>
			<td>Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse TSG101 Antibody</td>
			<td>AbCam, Cambridge, MA</td>
			<td>AB125011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse PE-CD63 Antibody</td>
			<td>Biolegend, San Diego, CA</td>
			<td>143904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Danvers, MA</td>
			<td>7074S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x LDS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Reducing agent (Bolt)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Lysis buffer (Bolt)</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Danvers, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolt 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>NW04120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Nitrocellulose mini stacks</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>IB23002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescent HRP antibody detection reagent HyGLO</td>
			<td>Denville Scientific, Holliston, MA</td>
			<td>E2400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes 17 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, Pasadena, CA</td>
			<td>337986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes 38.5 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, Pasadena, CA</td>
			<td>326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning SFCA Syringe Filters 0.2 &#181;m pore</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>09-754-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter, Pasadena, CA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight (NS300)</td>
			<td>Malvern, Worcestershire, UK</td>
			<td>-</td>
			<td>To measure particle size distribution and particle concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQuant Analyzer 10 flow cytometer</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot Transfer Apparatus</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System</td>
			<td>Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v. 10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of extracellular vesicles from murine bronchoalveolar lavage fluid using an ultrafiltration centrifugation technique

حويصلات خارج الخلية (EVs) هي مكونات سوبسيلولار المكتشفة حديثا التي تلعب أدواراً هامة في البيولوجية العديد من الإشارات وظائف خلال الدول الفسيولوجية والمرضية. عزل المركبات الكهربائية لا يزال يشكل تحديا رئيسيا في هذا المجال، بسبب القيود المتأصلة لكل تقنية. هو نهج استخداماً تنبيذ فائق التفاضلية مع أسلوب الطرد المركزي التدرج الكثافة ويعتبر الإجراء معيار الذهب لعزل EV. بيد أن هذا الإجراء هو مضيعة للوقت، وكثيفة العمالة، ويؤدي عادة في قابلية منخفضة، التي قد لا تكون مناسبة لعينات صغيرة الحجم مثل سائل الغسل للفيسيولوجيا. ونحن تبين أن أسلوب عزل الطرد المركزي أولترافيلتريشن بسيطة وفعالة من حيث الوقت والعمل يوفر الانتعاش عالية الغلة والنقاء. ونحن نقترح أن هذا الأسلوب العزلة يمكن أن يكون نهج بديل مناسب لعزل EV، خاصة بالنسبة للعينات البيولوجية صغيرة الحجم.

نحن يتم عزل EV من الماوس بالف باستخدام أساليب عزل الوليد وجامعة كاليفورنيا-DGC في نفس اليوم. يتطلب الأسلوب الوليد حوالي 2.5 – 3 ح، حين يتطلب تقنية الاتصالات الموحدة--DGC 8 ح الوقت اللازم للتجهيز. هذا لا يشمل المخازن المؤقتة وكاشف إعداد الوقت. تجدر الإشارة إلى أن بعض المهام الأخر?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique at JoVE.com

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

هنا، نحن تصف البروتوكولين من العزلة حويصلة خارج الخلية، أولترافيلتريشن الطرد المركزي وتنبيذ فائق مع كثافة التدرج الطرد المركزي، لعزل حويصلات خارج الخلية من الغسل للفيسيولوجيا مورين عينات السوائل. الحويصلات خارج الخلية المستمدة من سائل الغسل للفيسيولوجيا مورين بكلتا الطريقتين كمياً وتتميز.

عزل حويصلات خارج الخلية من السوائل مورين للفيسيولوجيا الغسل باستخدام أسلوب الطرد المركزي أولترافيلتريشن

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في معالجة الأسئلة المتعلقة بكفاءة، والعائد الانتعاش، ونقاء السائل lava قصبي طاردة مشتقة من خارج الخلية باستخدام نهج الطرد المركزي فائقة الترشيح. قارنا هذه التقنية مباشرة بتقنية الطرد الشديد الكثافة والتنقية الانحدارية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه بسيط وفعال ومناسب لعينات صغيرة الحجم مثل السائل lava القصبات الهوائية.والأهم من ذلك أنه يوفر نقاء عالية وقابلية توسع أعلى بكثير مقارنة بطريقة العزلة فائقة التركيز. إثبات الإجراء سيكون السيد نورمان غاريت الثالث، باحث مشارك في مختبري. للبدء ، أدخل 22 مقياسًا لـ angiocatheter في القصبة الهوائية للماوس القتل الرحيم.إرفاق حقنة الأنسولين مع ملليلتر واحد من الجليد الباردة DPBS العقيمة، وغرس ملليلتر واحد في كل من الرئتين. سحب ببطء المكبس حقنة لاسترداد السائل القصبي lava، أو السوائل BAL. و يوزع سائل BAL في أنبوب مخروطي على الجليدبعد ذلك، سحب سائل BAL من 25 الفئران وتقسيمه إلى مجموعتين متساويتين. أجهزة الطرد المركزي السائل بال في 400 مرة G لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية. جمع طاردة فائقة والطرد المركزي في 15،000 مرات G في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.ثم جمع افرا والشروع في خطوات عزل EV على الفور. أولا، تصفية نات السوبر من خلال 0.2 ميكرومتر معقم فلتر الحقن. بعد ذلك، اكويترولتر وحدة تصفية الطرد المركزي مع DPBS العقيمة لمدة 10 دقائق.ثم الطرد المركزي وحدة الطرد المركزي في 15، 000 مرات G لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. املأ الفلتر بـ 15 ملليلتر من سائل BAL. و جهاز طرد مركزي في 3,000 G لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية.بعد هذا، وغسل retentate مع 14 ملليلتر من DPBS العقيمة عن طريق الأنابيب بلطف مرارا وتكرارا. أجهزة الطرد المركزي وحدة التصفية في 3، 000 G في أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة لإزالة DPBS وتركيز retentate. لجمع السائل بال المركزة المستمدة EV، إدراج أنبوب في الجزء السفلي من وحدة التصفية، وسحب العينة باستخدام حركة شاملة من جانب إلى آخر.ثم aliquot السائل BAL المستمدة EV وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية. بدلا من ذلك، تبدأ عن طريق نقل السابق المكتسبة supernatant إلى أنبوب فائقة الوضوح. و جهاز طرد مركزي عند 10,000 جي لمدة 30 دقيقة بأربع درجات مئويةثم جمع المابير والطرد المركزي. تجاهل عظمى وإعادة تعليق بيليه EV في 200 ميكرولترات من DPBS. بعد ذلك، مزيج تعليق EV مع 300 ميكرولترات من 50٪ iodixanol حل العمل.ونقله إلى أنبوب 15 ملليلتر فائقة الوضوح. ثم إضافة حل العازلة وفقا لبروتوكول النص لإنشاء التدرج كثافة الطفو، والطرد المركزي في 100، 000 G لمدة ثلاث ساعات و 50 دقيقة. جمع 15٪ و 25٪ iodixanol الكسور، وتمييع لهم في DPBS لجعل حجم يصل إلى 15 ملليلتر.نقل الكسور إلى أنبوب جديد فائق التركيز الطرد والطرد المركزي في 100، 000 G في أربع درجات مئوية لمدة 60 دقيقة. تجاهل افراط وإعادة تعليق الكريات EV في 50 ميكرولترات من DPBS العقيمة. لبدء تحليل تتبع الجسيمات النانوية، قم بتخفيف عينة EV في ملليلتر واحد من DPBS.و حمّل العينة في حقنة الأنسولين بعد ذلك، قم بتوصيل الحقنة بمضخة حقنة، وقياس أرقام الجسيمات وحجمها. تعيين مستوى الكاميرا إلى 14 وعتبة الكشف عن واحد.بعد ذلك، استخدم قارئ لوحة لتحديد كمية البروتين في عينة EV عن طريق الكشف colorimetric. قم بتلايب كمية مساوية من بروتين EV من كل عينة مع مخزن تحميل ينفر و DTT. ثم سخني العينات عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.قم بتحميل العينات في جل الاكريلاميد Bis-Tris Plus واجري الكهرباء لمدة 35 دقيقة. ثم نقل البروتينات إلى غشاء نيتروسيلولوز باستخدام طريقة نقل الجافة. بعد ذلك، كتلة الغشاء مع خمسة في المئة الحليب منزوع الدسم لمدة 60 دقيقة مع هزاز لطيف.احتضان الغشاء مع جسم مضاد لعلامة بروتين سطح EV في أربع درجات مئوية مع هزاز لطيف بين عشية وضحاها. تطوير الغشاء عن طريق احتضان الغشاء مع هدب هدب الأجسام المضادة ل 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الغشاء لمدة 10 دقائق مع العازلة TBST ثلاث مرات.وأخيرا، تطوير الغشاء مع كاشف الكشف عن الأجسام المضادة للجسم CHEMILUMINEScent HRP قبل الشروع في التصوير. لبدء تدفق cytometry، تخفيف السوائل BAL المستمدة EV في 49 ميكرولترات من PEB تلطيخ العازلة. ثم إضافة ثلاثة أجسام مضادة لكل من العينات، قبل احتضان العينات في أربع درجات مئوية مع هزاز لمدة 60 دقيقة في الظلام.وأخيرا، تمييع العينات مع 40 ميكرولترات من غشاء تصفية PEB تلطيخ العازلة وتنفيذ تحليل تدفق الخلايا. في هذا البروتوكول، تم عزل EV من سائل الماوس BAL باستخدام أساليب UFC و UC-DGC. بالسوائل BAL المستمدة EV من الفئران العادية المعزولة بواسطة طريقة UFC عرض أحجام أصغر وأكثر توزيع حجم موحدة من UC-DGC-EV.وكان لتقنية UFC أيضاً عدد الجسيمات الإجمالي الأعلى بكثير بالمقارنة مع تقنية UC-DGC. وكان إجمالي استرداد البروتين الذي تم قياسه بالملليغرام من UFC-EV أعلى أيضًا من انتعاش UC-DGC-EV ، مما يشير إلى أن تقنية UFC هي أكثر كفاءة من الوقت والجهد. وأخيرا، تم أيضا وصف السائل BAL المستمدة EV 's كذلك عن طريق تدفق القياسات.وأعرب كل من UFC - EV وUC - DGC EV في CD63 ، CD9 ، و CD81. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر إعادة تهطيب غشاء وحدة الترشيح الفائق مع DPBS. بمجرد رطوبة الغشاء ، يجب أن تظل الوحدة رطبة في كل وقت حتى يتم استخدامها.يمكن أن يكون استرداد خلايا خارج الخلية من وحدة التصفية تحديًا. تأكد من أن يتم اجتاحت تلميح ماصة جنبا إلى جنب لاسترداد معظم EV من وحدة التصفية. بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال عزل الخلايا خارج الخلية لاستكشاف الوظائف البيولوجية لمراحيض القصبات الهوائية المشتقة من الفُيَسَة خارج الخلية في كل من الظروف الطبيعية أو المرضية في الحيوانات الصغيرة.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

عزل الخلايا الدبقية الصغيرة القشرية مع نمط ظاهري مناعي المحفوظة وظيفة من الفئران حديثي الولادة

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

والاستفادة من البلعوم الإدارة داخل القصبة الهوائية والقصبات PAMP الغسل لتقييم استجابة المضيف المناعية في الفئران

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

عزل خلايا الفئران العقدة الليمفاوية اللحمية

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

عزل وحقن في الوريد من الفئران نخاع العظام المستمدة حيدات

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

عزل الكريات البيض من أنسجة الفئران في واجهة الأم والجنين

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

العزلة وتنشيط الخلايا الليمفاوية الفئران

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

تدفق Virometry لتحليل الأنتيجين أطياف Virions وخارج الخلية الحويصلات

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

القصبات الغسل من الفئران الرئتين لتحليل التهاب تسلل خلية

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

عزل وتوصيف حويصلات خارج الخلية من الكبار بالبلەارسيات بلهارسيه

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment