Name: isolation of extracellular vesicles from murine bronchoalveolar lavage fluid using an ultrafiltration centrifugation technique
Uploaded: 2018-11-09T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique at JoVE.com

Het werk wordt ondersteund door de NHLBI/NIH subsidies HL103868 (voor pct.) en HL137076 (tot pct.), de American Heart Association Grant-in-Aid (naar pct.) en de Samuel Oschin uitgebreide kanker instituut (SOCCI) Lung Cancer Research Award (naar pct.). Wij zouden graag onze grote waardering uitspreken voor de Smidt Heart Institute in het Cedars-Sinai Medical Center waarmee ons een Nanosight machine voor EV nanoparticle bijhouden van analyse.

Het gebruik van dieren en alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik commissies (IACUC) bij het Cedars-Sinai Medical Center (CSMC).
1. lymfkliertest Bronchoalveolar Lavage vloeistof (BALF) verzameling en voorbereiding
<ol><li>BALF collectie<ol>
<li>Euthanaseren muizen met een cocktail van ketamine (300 mg/kg) en xylazine (30 mg/kg) via de intraperitoneaal route gevolgd door cervicale dislocatie.</li>
		<li>Plaats een 22 G-angiocatheter in de lu...

<ol>
	<li>Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+composition,+biogenesis+and+function.">Exosomes: composition, biogenesis and function.</a> Nature Reviews Immunology. 2, 569-579 (2002).</li><li>Kosaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+Mechanisms+and+Intercellular+Transfer+of+MicroRNAs+in+Living+Cells.">Secretory Mechanisms and Intercellular Transfer of MicroRNAs in Living Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17442-17452 (2010).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Fujita, Y., Kosaka, N., Araya, J., Kuwano, K., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+lung+microenvironment+and+pathogenesis.">Extracellular vesicles in lung microenvironment and pathogenesis.</a> Trends in Molecular Medicine. 21 (9), 533-542 (2015).</li><li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+function+of+exosomes+in+cancer.">The biology and function of exosomes in cancer.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).</li><li>Janowska-Wieczorek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+derived+from+activated+platelets+induce+metastasis+and+angiogenesis+in+lung+cancer.">Microvesicles derived from activated platelets induce metastasis and angiogenesis in lung cancer.</a> International Journal of Cancer. 113 (5), 752-760 (2005).</li><li>Valadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells.">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).</li><li>Colombo, M., Raposo, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis,+Secretion,+and+Intercellular+Interactions+of+Exosomes+and+Other+Extracellular+Vesicles.">Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 255-289 (2014).</li><li>Rocco, G. D., Baldari, S., Toietta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+other+extracellular+vesicles-mediated+microRNA+delivery+for+cancer+therapy.">Exosomes and other extracellular vesicles-mediated microRNA delivery for cancer therapy.</a> Translational Cancer Research. 6 (Supplement 8), S1321-S1330 (2017).</li><li>Peterson, M. F., Otoc, N., Sethi, J. K., Gupta, A., Antes, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+systems+for+exosome+investigation.">Integrated systems for exosome investigation.</a> Methods. 87 (1), 31-45 (2015).</li><li>Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+isolation+and+characterization:+toward+clinical+application.">Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application.</a> Journal of Clinical Investigation. 126, 1152-1162 (2016).</li><li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles:+results+of+a+worldwide+survey.">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945 (2016).</li><li>Inglis, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+to+improve+detection+and+analysis+of+extracellular+vesicles+using+flow+cytometry.">Techniques to improve detection and analysis of extracellular vesicles using flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 87 (11), 1052-1063 (2015).</li><li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+Exosome+Isolation+Techniques.">Progress in Exosome Isolation Techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li><li>Willis, G. R., Kourembanas, S., Mitsialis, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+Exosome-Based+Therapeutics:+Isolation,+Heterogeneity,+and+Fit-for-Purpose+Potency.">Toward Exosome-Based Therapeutics: Isolation, Heterogeneity, and Fit-for-Purpose Potency.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 20389 (2017).</li><li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 27031 (2015).</li><li>Benedikter, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafiltration+combined+with+size+exclusion+chromatography+efficiently+isolates+extracellular+vesicles+from+cell+culture+media+for+compositional+and+functional+studies.">Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies.</a> Scientific Reports. 7 (1), 15297 (2017).</li><li>Vergauwen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confounding+factors+of+ultrafiltration+and+protein+analysis+in+extracellular+vesicle+research.">Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2704 (2017).</li><li>Kesimer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+exosome-like+vesicles+released+from+human+tracheobronchial+ciliated+epithelium:+a+possible+role+in+innate+defense.">Characterization of exosome-like vesicles released from human tracheobronchial ciliated epithelium: a possible role in innate defense.</a> The FASEB Journal. 23 (6), 1858-1868 (2009).</li><li>Torregrosa Paredes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoalveolar+lavage+fluid+exosomes+contribute+to+cytokine+and+leukotriene+production+in+allergic+asthma.">Bronchoalveolar lavage fluid exosomes contribute to cytokine and leukotriene production in allergic asthma.</a> Allergy. 67 (7), 911-919 (2012).</li><li>Alipoor, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+Exosomal+miRNA+in+Respiratory+Diseases.">Exosomes and Exosomal miRNA in Respiratory Diseases.</a> Mediators of Inflammation. 2016, 5628404 (2016).</li><li>Hough, K. P., Chanda, D., Duncan, S. R., Thannickal, V. J., Deshane, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+Immunoregulation+of+Chronic+Lung+Diseases.">Exosomes in Immunoregulation of Chronic Lung Diseases.</a> Allergy. 72 (4), 534-544 (2017).</li><li>Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoalveolar+Lavage+of+Murine+Lungs+to+Analyze+Inflammatory+Cell+Infiltration.">Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).</li><li>Minciacchi, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MYC+Mediates+Large+Oncosome-Induced+Fibroblast+Reprogramming+in+Prostate+Cancer.">MYC Mediates Large Oncosome-Induced Fibroblast Reprogramming in Prostate Cancer.</a> Cancer Research. 77 (9), 2306-2317 (2017).</li><li>Koliha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+Affects+the+Composition+of+Blood+Cell-Derived+Extracellular+Vesicles.">Melanoma Affects the Composition of Blood Cell-Derived Extracellular Vesicles.</a> Frontiers in Immunology. 7, 581 (2016).</li><li>Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses.">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).</li><li>Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes/microvesicles+as+a+mechanism+of+cell-to-cell+communication.">Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication.</a> Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).</li><li>Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+microvesicles:+extracellular+vesicles+for+genetic+information+transfer+and+gene+therapy.">Exosomes and microvesicles: extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy.</a> Human Molecular Genetics. 21, R125-R134 (2012).</li><li>Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Guti&#233;rrez-V&#225;zquez, C., S&#225;nchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+it+out:+Regulation+of+exosome+loading.">Sorting it out: Regulation of exosome loading.</a> Seminars in Cancer Biology. 28, 3-13 (2014).</li><li>Hoshino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+exosome+integrins+determine+organotropic+metastasis.">Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis.</a> Nature. 527, 329-335 (2015).</li><li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Exosome+Total+Isolation+Chip.">The Exosome Total Isolation Chip.</a> ACS Nano. 11 (11), 10712-10723 (2017).</li><li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator.">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).</li><li>Zhao, Z., Yang, Y., Zeng, Y., He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Microfluidic+ExoSearch+Chip+for+Multiplexed+Exosome+Detection+Towards+Blood-based+Ovarian+Cancer+Diagnosis.">A Microfluidic ExoSearch Chip for Multiplexed Exosome Detection Towards Blood-based Ovarian Cancer Diagnosis.</a> Lab on a Chip. 16 (3), 489-496 (2016).</li><li>Fang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+application+of+a+microfluidic+chip+for+immunocapture+and+quantification+of+circulating+exosomes+to+assist+breast+cancer+diagnosis+and+molecular+classification.">Clinical application of a microfluidic chip for immunocapture and quantification of circulating exosomes to assist breast cancer diagnosis and molecular classification.</a> PloS ONE. 12 (4), e0175050 (2017).</li><li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator.">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> American Journal Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).</li><li>Kornilov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+ultrafiltration-based+protocol+to+deplete+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum.">Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).</li><li>Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+protein,+microRNA,+and+mRNA+yields+using+different+methods+of+urinary+exosome+isolation+for+the+discovery+of+kidney+disease+biomarkers.">Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers.</a> Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).</li><li>Bosch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+prevents+aggregation+of+exosomes+and+cryodamage.">Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage.</a> Scientific Reports. 6 (1), 329 (2016).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+progenitor+cell-derived+exosomes+prevent+cardiomyocytes+apoptosis+through+exosomal+miR-21+by+targeting+PDCD4.">Cardiac progenitor cell-derived exosomes prevent cardiomyocytes apoptosis through exosomal miR-21 by targeting PDCD4.</a> Cell Death &amp; Disease. 7 (6), e2277 (2016).</li><li>Agarwal, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental,+Systems+and+Computational+Approaches+to+Understanding+the+MicroRNA-Mediated+Reparative+Potential+of+Cardiac+Progenitor+Cell-Derived+Exosomes+From+Pediatric+Patients.">Experimental, Systems and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients.</a> Circulation Research. 120 (4), 701-712 (2017).</li><li>Merchant, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfiltration+isolation+of+human+urinary+exosomes+for+characterization+by+MS.">Microfiltration isolation of human urinary exosomes for characterization by MS.</a> PROTEOMICS - Clinical Applications. 4 (1), 84-96 (2010).</li><li>Gouin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+method+for+identification+of+suitable+reference+genes+in+extracellular+vesicles.">A comprehensive method for identification of suitable reference genes in extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1347019 (2017).</li><li>Betsuyaku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Granule+Proteins+in+Bronchoalveolar+Lavage+Fluid+from+Subjects+with+Subclinical+Emphysema.">Neutrophil Granule Proteins in Bronchoalveolar Lavage Fluid from Subjects with Subclinical Emphysema.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159 (6), 1985-1991 (1999).</li></ol>

In de afgelopen decennia, hebben de wetenschappers de betekenissen van het EVW in cellulaire homeostase ontrafeld. Nog belangrijker, spelen EVs een grote rol in vele ziekteprocessen door modulerende ver en naburige cellen via hun bioactieve lading moleculen1,21,22,26,27 , 28 , 29 ,</sup...

Exosomes zijn de kleinste deelverzameling van het EVW, 50-200 nm in diameter, en meerdere biologische functies overal een veelzijdige signalering processen1,2,3,4,5. Ze regelen cellulaire en weefsel homeostase voornamelijk doordat intercellulaire communicatie via lading moleculen zoals lipiden, eiwitten en nucleïnezuren6,7,8,9 . Een kritieke stap in EV-onderzoek is het proces van isolement. Differentiële ultracentrifugatie (UC), met of zonder dichtheid kleurovergang centrifugeren (DGC), wordt beschouwd als de gouden standaard aanpak, maar deze methode draagt grote beperkingen, met inbegrip van inefficiënte EV herstel tarieven en lage schaalbaarheid10 , 11 , 12, beperken die het beste gebruik te groter volume monsters, zoals cel cultuur bezinken of hoge exosome productie exemplaren. De voor- en nadelen van andere methoden, zoals grootte uitsluiting door ultrafiltratie of chromatografie, immunoaffinity isolatie door kralen of meer sorteerkolommen en microfluidics, worden goed beschreven, en moderne aanvullende procedures zijn ontwikkeld om overwinnen en technische beperkingen in elke aanpak11,12,13,14,15te minimaliseren. Anderen hebben aangetoond dat een ultrafiltratie centrifugeren (UFC) met een nanoporeuze membraan in de filter-eenheid is een alternatieve techniek waarmee vergelijkbare zuiverheid een UC methode16,17,18. Deze techniek kan worden beschouwd als een van de methoden van alternatieve isolatie.
Bronchoalveolar lavage vloeistof (BALF) bevat EVs die talrijke biologische functies in verschillende luchtwegen19,20,21,22 bezitten. Studeren BALF afkomstige EVs houdt sommige uitdagingen als gevolg van de invasiviteit van de bronchoscopie procedure bij de mens, alsmede een beperkte hoeveelheid lavage vloeistof herstel. In kleine laboratoriumdieren zoals muizen, alleen een paar milliliter in normale longaandoeningen kunnen worden hersteld, zelfs minder in longen ontstoken of fibrotische23. Bijgevolg, het verzamelen van een voldoende hoeveelheid BALF voor EV isolatie door een differentiële ultracentrifugatie voor downstream toepassingen kan niet haalbaar. Isoleren van juiste EV populaties is echter een cruciale factor voor het bestuderen van de biologische functies van de EV. Het delicate evenwicht tussen efficiëntie en werkzaamheid blijft een uitdaging in gevestigde EV isolatie methoden.
In deze huidige studie, wij laten zien dat een centrifugaal ultrafiltratie benadering, met gebruikmaking van een 100 kDa molecuulgewicht cut-off (MWCO) nanomembrane filter unit, geschikt voor kleine hoeveelheden biologische specimen zoals BALF. Deze techniek is eenvoudig, efficiënt en biedt hoge zuiverheid en schaalbaarheid ter ondersteuning van de studie van het EVW BALF-afgeleide.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 centrifugal filters Ultracel-100K</td>
			<td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Corning Cellgro, Manassas, VA</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td>
			<td>EMD8550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Research Products International, Prospect, IL</td>
			<td>75277-39-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Corning Cellgro, Manassas, VA</td>
			<td>46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td>
			<td>S3014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep</td>
			<td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td>
			<td>MKCD9753</td>
			<td>Density Gradient Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>VetOne, Boise, ID</td>
			<td>13985-702-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Akorn Animal Health, Lake Forest, IL</td>
			<td>59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td>BD Syringe, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>309656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angiocatheter 20G</td>
			<td>BD Syringe, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>381703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes 15 mL</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes 50 mL</td>
			<td>Corning Cellgro, Manassas, VA</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicinchonic acid (BCA) protein assay</td>
			<td>Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse TSG101 Antibody</td>
			<td>AbCam, Cambridge, MA</td>
			<td>AB125011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse PE-CD63 Antibody</td>
			<td>Biolegend, San Diego, CA</td>
			<td>143904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Danvers, MA</td>
			<td>7074S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x LDS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Reducing agent (Bolt)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Lysis buffer (Bolt)</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Danvers, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolt 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>NW04120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Nitrocellulose mini stacks</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>IB23002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescent HRP antibody detection reagent HyGLO</td>
			<td>Denville Scientific, Holliston, MA</td>
			<td>E2400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes 17 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, Pasadena, CA</td>
			<td>337986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes 38.5 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, Pasadena, CA</td>
			<td>326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning SFCA Syringe Filters 0.2 &#181;m pore</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>09-754-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter, Pasadena, CA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight (NS300)</td>
			<td>Malvern, Worcestershire, UK</td>
			<td>-</td>
			<td>To measure particle size distribution and particle concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQuant Analyzer 10 flow cytometer</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot Transfer Apparatus</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System</td>
			<td>Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v. 10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of extracellular vesicles from murine bronchoalveolar lavage fluid using an ultrafiltration centrifugation technique

Extracellulaire blaasjes (EVs) zijn pas ontdekte subcellular componenten die spelen een belangrijke rol in vele biologische functies signalering tijdens fysiologische en pathologische staten. Het isolement van het EVW blijft een grote uitdaging op dit gebied, als gevolg van beperkingen die inherent is aan iedere techniek. De differentiële ultracentrifugatie met dichtheid kleurovergang centrifugeren methode is een veel gebruikte aanpak en wordt beschouwd als de gouden standaard procedure voor EV isolatie. Deze procedure is echter tijdrovend, arbeidsintensief, en over het algemeen resulteert in lage schaalbaarheid, die mogelijk niet geschikt voor kleine aantallen monsters zoals bronchoalveolar lavage vloeistof. We laten zien dat een ultrafiltratie centrifugeren isolatie methode eenvoudig is en tijd en arbeid-energiezuinige nog een hoge herstel opbrengst en zuiverheid biedt. Wij stellen voor dat deze isolatie-methode kan een alternatieve benadering die geschikt is voor EV isolatie, met name voor kleine hoeveelheden biologische specimens.

We EV isolatie van muis BALF uitgevoerd met behulp van de UFC en UC-DGC isolatie-methoden op dezelfde dag. De UFC-methode vereist ongeveer 2,5-3 h, overwegende dat de UC-DGC techniek 8 h verwerkingstijd vereist. Worden hier niet meegerekend buffers en reagens voorbereidingstijd. Opgemerkt moet worden dat bepaalde andere taken kunnen worden uitgevoerd tijdens de perioden van de lange centrifugeren. Echter duurde de gehele procedure bijna een hele dag voor de UC-DGC isolatie-techniek.
<...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique at JoVE.com

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

Hier beschrijven we twee extracellulaire vesikel isolatie protocollen, ultrafiltratie centrifugeren en ultracentrifugatie met dichtheid kleurovergang centrifugeren, te isoleren van extracellulaire blaasjes van lymfkliertest bronchoalveolar lavage vloeibare steekproeven. De extracellulaire blaasjes lymfkliertest bronchoalveolar lavage vloeistof door beide methoden afgeleid zijn gekwantificeerd en gekenmerkt.

Isolatie van extracellulaire blaasjes aan de lymfkliertest Bronchoalveolar Lavage vloeistof met behulp van een techniek van ultrafiltratie centrifugeren

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during ...

Deze methode kan helpen bij het aanpakken van vragen met betrekking tot de efficiëntie, herstelopbrengst en zuiverheid van bronchoalveolaire lavage vloeistof afgeleid extracellulaire vesicles met behulp van een ultrafiltratie centrifugatie benadering. We hebben deze techniek direct vergeleken met een ultracentrifugatie- en dichtheidgradiënt zuiveringstechniek. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het eenvoudig, efficiënt en geschikt is voor kleine volumemonsters zoals murine bronchoalveolaire lavage vloeistof.Wat nog belangrijker is, het biedt een hoge zuiverheid en aanzienlijk hogere schaalbaarheid in vergelijking met een ultracentrifugatie-isolatiemethode. Het aantonen van de procedure zal mr. Norman Garrett III zijn, onderzoeksmedewerker voor mijn laboratorium. Om te beginnen plaatst u een angiocatheter van 22 meter in de luchtpijp van een geëuthanaseerde muis.Bevestig een insulinespuit met een milliliter ijskoud steriele DPBS, en inboezemen een milliliter in beide van de longen. Trek langzaam de spuitzuiger terug om bronchoalveolar lavage vloeistof, of BAL vloeistof op te halen. En doseer de BAL-vloeistof in een conische buis op ijs.Trek hierna BAL-vloeistof uit 25 muizen en verdeel het in twee gelijke sets. Centrifuge de BAL vloeistof op 400 keer G gedurende vijf minuten op vier graden Celsius. Verzamel de supernatant en centrifuge het op 15.000 keer G op vier graden Celsius gedurende 10 minuten.Verzamel vervolgens de supernatant en ga onmiddellijk naar de EV isolatiestappen. Filtreer eerst de supernatant door een 0,2 micrometer steriel spuitfilter. Daarna moet u de centrifugaalfiltereenheid gedurende 10 minuten met steriele DPBS in evenwicht brengen.Dan centrifugeren de centrifugaal eenheid op 15.000 keer G gedurende 10 minuten op vier graden Celsius. Vul het filter met 15 milliliter BAL-vloeistof. En centrifugeren het op 3.000 G's gedurende 30 minuten op vier graden Celsius.Daarna was je het retentaat met 14 milliliter steriele DPBS door herhaaldelijk voorzichtig te pipetten. Verheerlijk de filtereenheid op 3,000 G's bij vier graden Celsius gedurende 30 minuten om de DPBS te verwijderen en het retentaat te concentreren. Om de geconcentreerde BAL vloeistof afgeleide EV's te verzamelen, steek je een pipetter in de bodem van de filterunit en trek je het monster terug met behulp van een veegbeweging van links naar rechts.Dan aliquot de BAL vloeistof afgeleide EV's en bewaar ze op min 80 graden Celsius. U ook beginnen met het overbrengen van de vorige verworven supernatant naar een ultracentrifuge buis. En centrifugeren het op 10.000 G's gedurende 30 minuten op vier graden Celsius.Verzamel dan de supernatant en centrifuge. Gooi de supernatant weg en hang de EV-pellet opnieuw op in 200 microliters van DPBS. Meng hierna de EV-vering met 300 microliters van 50%iodixanol werkoplossing.En breng het over op een 15 milliliter ultracentrifugebuis. Voeg vervolgens bufferoplossing toe volgens het tekstprotocol om een verloop van een dichtheidsgradiënt te maken en deze gedurende drie uur en 50 minuten te centrifugeren bij 100, 000 G's. Verzamel de 15% en de 25%iodixanol fracties, en verdun ze in DPBS om het volume te brengen tot 15 milliliter.Breng de fracties over op een nieuwe ultracentrifugebuis en centrifuge bij 100.000 G's bij vier graden Celsius gedurende 60 minuten. Gooi de supernatant weg en hang de EV-pellets opnieuw op in 50 microliter van steriel DPBS. Om te beginnen nano deeltjes tracking analyse, verdun het EV monster in een milliliter van DPBS.En laad het monster in een insulinespuit. Bevestig hierna de spuit aan een spuitpomp en meet de deeltjesnummers en -grootte. Stel het cameraniveau in op 14 en de detectiedrempel op één.Gebruik vervolgens een plaatlezer om de hoeveelheid eiwit in het EV-monster te kwantificeren via colorimetrische detectie. Los een gelijke hoeveelheid EV-eiwit uit elk monster op met een blotting-laadbuffer en DTT. Verwarm vervolgens de monsters op 70 graden Celsius gedurende 10 minuten.Laad de monsters in een Bis-Tris Plus acrylamide gel en voer elektroforese gedurende 35 minuten. Breng de eiwitten vervolgens over naar een nitrocellulosemembraan met behulp van een droge overdrachtsmethode. Daarna, blokkeer het membraan met vijf procent magere melk gedurende 60 minuten met zachte schommelen.Incubeer het membraan met een antilichaam aan een EV oppervlakte eiwitmarkering bij vier graden celsius met zacht schommelen 's nachts. Ontwikkel het membraan door het membraan 60 minuten lang uit te broeden met HRP-verbindingsantilichaam bij kamertemperatuur. Was het membraan 10 minuten met tbst-buffer drie keer.Ten slotte, ontwikkel het membraan met chemiluminescent HRP-antilichaamdetectiereagens voordat u overgaat tot beeldvorming. Om te beginnen met de stroom cytometrie, verdun bal vloeistof afgeleide EV's in 49 microliters van PEB kleuring buffer. Voeg vervolgens drie antilichamen toe aan elk van de monsters, voordat u de monsters bij vier graden Celsius uitbroedt met 60 minuten schommelen in het donker.Ten slotte verdun de monsters met 40 microliters membraan gefilterde PEB-kleuringsbuffer en voer de stromingscytometrieanalyse uit. In dit protocol werden EV's geïsoleerd van muis BAL vloeistof met behulp van een UFC en UC-DGC methoden. BAL vloeistof afgeleid EV's van normale muizen geïsoleerd door de UFC methode weergegeven kleinere maten en meer uniforme grootte distributie dan de UC-DGC-EV's.De UFC-techniek had ook aanzienlijk hogere totale deeltjestellingen in vergelijking met de UC-DGC-techniek. De totale eiwitterugwinning gemeten in milligram van de UFC-EV's was ook hoger dan die van de UC-DGC-EV's, wat aangeeft dat de UFC-techniek meer tijd en moeite efficiënt is. Ten slotte werden de BAL vloeistof afgeleide EV's ook verder gekenmerkt via flow cytometrie.De UFC-EV's en UC-DGC-EV's hebben beide cd63, CD9 en CD81 uitgedrukt. Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om de ultrafiltratie-eenheid membraan rehydrateren met DPBS. Zodra het membraan gehydrateerd is, moet het apparaat te allen tijde nat worden gehouden totdat het wordt gebruikt.Het ophalen van extracellulaire vesicle retentate uit de filterunit kan een uitdaging zijn. Zorg ervoor dat de pipettepunt van links naar rechts wordt geveegd om de meeste EV's uit de filterunit te halen. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van extracellulaire blaasisolatie om de biologische functies van bronchoalveolaire lavage afgeleide extracellulaire blaasjes te verkennen in zowel normale als pathologische omstandigheden bij kleine dieren.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

Isolatie van corticale Microglia met Conserven immunofenotype en functionaliteit van Muriene Pasgeborenen

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

Het gebruik van Oropharyngeal Intratracheaal PAMP Administratie en bronchoalveolaire lavage om de immuunrespons van de gastheer in Muizen Evalueer

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Isolatie van muizen lymfkliertest stromale cellen

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Isolatie en intraveneuze injectie van muizen beenmerg afgeleide Monocyten

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Isolatie van leukocyten uit de Murine Tissues de Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

Isolatie en Activering van Muizen lymfocyten

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Flow Virometry Analyseer antigene Spectra van Virions en extracellulaire blaasjes

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Bronchoalveolaire lavage van meneuze longen om ontstekingscelinfiltratie te analyseren

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolatie en karakterisatie van extracellulaire blaasjes van volwassen Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment

Verwerking van bronchoalveolaire lavage vloeistof en geëvenaard bloed voor alveolaar macrofaag en CD4+ T-cel Immunophenotypering en HIV-reservoir beoordeling