Name: isolation of extracellular vesicles from murine bronchoalveolar lavage fluid using an ultrafiltration centrifugation technique
Uploaded: 2018-11-09T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique at JoVE.com

העבודה נתמכת על ידי את NHLBI/NIH מענקים HL103868 (P.C.) ו HL137076 (כדי P.C.), את האמריקאי הלב האגודה מענק הסיוע (כדי P.C.) את פרס מחקר סמואל Oschin מקיף סרטן המכון (SOCCI) סרטן ריאות (כדי P.C.). ברצוננו להביע הערכה גדולה מכון הלב Smidt במרכז הרפואי Cedars-Sinai המספק לנו מכונה Nanosight EV nanoparticle מעקב ניתוח.

ניצול בעלי החיים ואת כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ו שימוש ועדות (IACUC) בבית Cedars-Sinai רפואי במרכז (CSMC).
1. מאתר Bronchoalveolar שטיפה נוזל (BALF) אוסף והכנות
<ol><li>אוסף BALF<ol>
<li>המתת חסד עכברים עם קוקטייל של קטאמין (300 מ"ג/ק"ג), חריגות השירותים הווטרינריים (30 מ"ג/ק"ג) ד?...

<ol>
	<li>Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+composition,+biogenesis+and+function.">Exosomes: composition, biogenesis and function.</a> Nature Reviews Immunology. 2, 569-579 (2002).</li><li>Kosaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+Mechanisms+and+Intercellular+Transfer+of+MicroRNAs+in+Living+Cells.">Secretory Mechanisms and Intercellular Transfer of MicroRNAs in Living Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17442-17452 (2010).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Fujita, Y., Kosaka, N., Araya, J., Kuwano, K., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+lung+microenvironment+and+pathogenesis.">Extracellular vesicles in lung microenvironment and pathogenesis.</a> Trends in Molecular Medicine. 21 (9), 533-542 (2015).</li><li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+function+of+exosomes+in+cancer.">The biology and function of exosomes in cancer.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).</li><li>Janowska-Wieczorek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+derived+from+activated+platelets+induce+metastasis+and+angiogenesis+in+lung+cancer.">Microvesicles derived from activated platelets induce metastasis and angiogenesis in lung cancer.</a> International Journal of Cancer. 113 (5), 752-760 (2005).</li><li>Valadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells.">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).</li><li>Colombo, M., Raposo, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis,+Secretion,+and+Intercellular+Interactions+of+Exosomes+and+Other+Extracellular+Vesicles.">Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 255-289 (2014).</li><li>Rocco, G. D., Baldari, S., Toietta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+other+extracellular+vesicles-mediated+microRNA+delivery+for+cancer+therapy.">Exosomes and other extracellular vesicles-mediated microRNA delivery for cancer therapy.</a> Translational Cancer Research. 6 (Supplement 8), S1321-S1330 (2017).</li><li>Peterson, M. F., Otoc, N., Sethi, J. K., Gupta, A., Antes, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+systems+for+exosome+investigation.">Integrated systems for exosome investigation.</a> Methods. 87 (1), 31-45 (2015).</li><li>Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+isolation+and+characterization:+toward+clinical+application.">Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application.</a> Journal of Clinical Investigation. 126, 1152-1162 (2016).</li><li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles:+results+of+a+worldwide+survey.">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945 (2016).</li><li>Inglis, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+to+improve+detection+and+analysis+of+extracellular+vesicles+using+flow+cytometry.">Techniques to improve detection and analysis of extracellular vesicles using flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 87 (11), 1052-1063 (2015).</li><li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+Exosome+Isolation+Techniques.">Progress in Exosome Isolation Techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li><li>Willis, G. R., Kourembanas, S., Mitsialis, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+Exosome-Based+Therapeutics:+Isolation,+Heterogeneity,+and+Fit-for-Purpose+Potency.">Toward Exosome-Based Therapeutics: Isolation, Heterogeneity, and Fit-for-Purpose Potency.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 20389 (2017).</li><li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 27031 (2015).</li><li>Benedikter, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafiltration+combined+with+size+exclusion+chromatography+efficiently+isolates+extracellular+vesicles+from+cell+culture+media+for+compositional+and+functional+studies.">Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies.</a> Scientific Reports. 7 (1), 15297 (2017).</li><li>Vergauwen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confounding+factors+of+ultrafiltration+and+protein+analysis+in+extracellular+vesicle+research.">Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2704 (2017).</li><li>Kesimer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+exosome-like+vesicles+released+from+human+tracheobronchial+ciliated+epithelium:+a+possible+role+in+innate+defense.">Characterization of exosome-like vesicles released from human tracheobronchial ciliated epithelium: a possible role in innate defense.</a> The FASEB Journal. 23 (6), 1858-1868 (2009).</li><li>Torregrosa Paredes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoalveolar+lavage+fluid+exosomes+contribute+to+cytokine+and+leukotriene+production+in+allergic+asthma.">Bronchoalveolar lavage fluid exosomes contribute to cytokine and leukotriene production in allergic asthma.</a> Allergy. 67 (7), 911-919 (2012).</li><li>Alipoor, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+Exosomal+miRNA+in+Respiratory+Diseases.">Exosomes and Exosomal miRNA in Respiratory Diseases.</a> Mediators of Inflammation. 2016, 5628404 (2016).</li><li>Hough, K. P., Chanda, D., Duncan, S. R., Thannickal, V. J., Deshane, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+Immunoregulation+of+Chronic+Lung+Diseases.">Exosomes in Immunoregulation of Chronic Lung Diseases.</a> Allergy. 72 (4), 534-544 (2017).</li><li>Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoalveolar+Lavage+of+Murine+Lungs+to+Analyze+Inflammatory+Cell+Infiltration.">Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).</li><li>Minciacchi, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MYC+Mediates+Large+Oncosome-Induced+Fibroblast+Reprogramming+in+Prostate+Cancer.">MYC Mediates Large Oncosome-Induced Fibroblast Reprogramming in Prostate Cancer.</a> Cancer Research. 77 (9), 2306-2317 (2017).</li><li>Koliha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+Affects+the+Composition+of+Blood+Cell-Derived+Extracellular+Vesicles.">Melanoma Affects the Composition of Blood Cell-Derived Extracellular Vesicles.</a> Frontiers in Immunology. 7, 581 (2016).</li><li>Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses.">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).</li><li>Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes/microvesicles+as+a+mechanism+of+cell-to-cell+communication.">Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication.</a> Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).</li><li>Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+microvesicles:+extracellular+vesicles+for+genetic+information+transfer+and+gene+therapy.">Exosomes and microvesicles: extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy.</a> Human Molecular Genetics. 21, R125-R134 (2012).</li><li>Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Guti&#233;rrez-V&#225;zquez, C., S&#225;nchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+it+out:+Regulation+of+exosome+loading.">Sorting it out: Regulation of exosome loading.</a> Seminars in Cancer Biology. 28, 3-13 (2014).</li><li>Hoshino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+exosome+integrins+determine+organotropic+metastasis.">Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis.</a> Nature. 527, 329-335 (2015).</li><li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Exosome+Total+Isolation+Chip.">The Exosome Total Isolation Chip.</a> ACS Nano. 11 (11), 10712-10723 (2017).</li><li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator.">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).</li><li>Zhao, Z., Yang, Y., Zeng, Y., He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Microfluidic+ExoSearch+Chip+for+Multiplexed+Exosome+Detection+Towards+Blood-based+Ovarian+Cancer+Diagnosis.">A Microfluidic ExoSearch Chip for Multiplexed Exosome Detection Towards Blood-based Ovarian Cancer Diagnosis.</a> Lab on a Chip. 16 (3), 489-496 (2016).</li><li>Fang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+application+of+a+microfluidic+chip+for+immunocapture+and+quantification+of+circulating+exosomes+to+assist+breast+cancer+diagnosis+and+molecular+classification.">Clinical application of a microfluidic chip for immunocapture and quantification of circulating exosomes to assist breast cancer diagnosis and molecular classification.</a> PloS ONE. 12 (4), e0175050 (2017).</li><li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator.">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> American Journal Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).</li><li>Kornilov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+ultrafiltration-based+protocol+to+deplete+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum.">Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).</li><li>Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+protein,+microRNA,+and+mRNA+yields+using+different+methods+of+urinary+exosome+isolation+for+the+discovery+of+kidney+disease+biomarkers.">Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers.</a> Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).</li><li>Bosch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+prevents+aggregation+of+exosomes+and+cryodamage.">Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage.</a> Scientific Reports. 6 (1), 329 (2016).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+progenitor+cell-derived+exosomes+prevent+cardiomyocytes+apoptosis+through+exosomal+miR-21+by+targeting+PDCD4.">Cardiac progenitor cell-derived exosomes prevent cardiomyocytes apoptosis through exosomal miR-21 by targeting PDCD4.</a> Cell Death &amp; Disease. 7 (6), e2277 (2016).</li><li>Agarwal, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental,+Systems+and+Computational+Approaches+to+Understanding+the+MicroRNA-Mediated+Reparative+Potential+of+Cardiac+Progenitor+Cell-Derived+Exosomes+From+Pediatric+Patients.">Experimental, Systems and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients.</a> Circulation Research. 120 (4), 701-712 (2017).</li><li>Merchant, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfiltration+isolation+of+human+urinary+exosomes+for+characterization+by+MS.">Microfiltration isolation of human urinary exosomes for characterization by MS.</a> PROTEOMICS - Clinical Applications. 4 (1), 84-96 (2010).</li><li>Gouin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+method+for+identification+of+suitable+reference+genes+in+extracellular+vesicles.">A comprehensive method for identification of suitable reference genes in extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1347019 (2017).</li><li>Betsuyaku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Granule+Proteins+in+Bronchoalveolar+Lavage+Fluid+from+Subjects+with+Subclinical+Emphysema.">Neutrophil Granule Proteins in Bronchoalveolar Lavage Fluid from Subjects with Subclinical Emphysema.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159 (6), 1985-1991 (1999).</li></ol>

ב העשורים האחרונים, מדענים יש פרם את חשיבות של EVs בהומאוסטזיס הסלולר. וחשוב מכך, EVs לשחק תפקידים עיקריים בתהליכים רבים של המחלה על ידי להתכוונן תאים שכנים ומרוחק דרך שלהם מטען ביואקטיביות מולקולות1,21,22,26,27...

Exosomes המשנה הקטן ביותר של EVs, 50 – 200 ננומטר בקוטר, יש מספר תפקודים ביולוגיים על פני מערך מגוון של איתות תהליכים1,2,3,4,5. הם חלים על הומאוסטזיס הסלולר ורקמות בעיקר על ידי הקלת תקשורת המערכת באמצעות מטען מולקולות כמו שומנים, חלבונים וחומצות גרעין6,7,8,9 . צעד קריטי במחקר EV הוא תהליך בידוד. Ultracentrifugation דיפרנציאלית (UC), עם או בלי צפיפות הדרגתיות צנטריפוגה (DGC), נחשב הגישה תקן זהב, אך שיטה זו נושאת מגבלות הגדולות, כולל המחירים לא יעיל של שחזור EV, מדרגיות נמוכה10 , 11 , 12, זה להגביל את הניצול הטוב ביותר כדי דגימות נפח גדול יותר, כגון תא תרבות exosome supernatant או גבוהה ייצור דגימות. היתרונות והחסרונות של שיטות אחרות, כגון גודל הדרה אולטראפילטרציה או כרומטוגרפיה, בידוד immunoaffinity על-ידי חרוזים או עמודות ולאחר מיקרופלואידיקה, מתוארים היטב, נהלים משלימה המודרנית פותחו כדי להתגבר על ולצמצם את מגבלות טכניות כל גישה11,12,13,14,15. אחרים הראו כי צנטריפוגה אולטראפילטרציה (UFC) עם קרום nanoporous ביחידה מסנן הוא טכניקה חלופית המספק טוהר דומות ל UC שיטת16,17,18. טכניקה זו יכולה להיחשב באחת השיטות בידוד חלופי.
נוזל שטיפה Bronchoalveolar (BALF) מכיל EVs שקיימים מספר תפקודים ביולוגיים שונים מערכת הנשימה תנאים19,20,21,22. לומדת EVs BALF-derived כרוך כמה אתגרים בשל invasiveness של ההליך ברונכוסקופיה אצל בני אדם, כמו גם כמות מוגבלת של שחזור נוזל שטיפה. בחיות מעבדה קטנה כגון עכברים, רק כמה מיליליטר ניתן לשחזר בתנאי ריאות רגילה, אפילו פחות הריאות מודלק או שהותירה23. כתוצאה מכך, איסוף כמות מספקת של BALF EV בידוד על ידי ultracentrifugation דיפרנציאלי עבור יישומי הזרם לא יכול להיות ריאלי. אולם, בידוד אוכלוסיות EV הנכון הוא גורם מכריע ללמוד תפקודים ביולוגיים EV. האיזון העדין בין היעילות ומועילות ימשיך להיות אתגר בשיטות בידוד ומבוססת EV.
במחקר הנוכחי, נדגים כי בגישה אולטראפילטרציה צנטריפוגלי, ניצול 100 kDa משקל מולקולרי ניתוק (MWCO) nanomembrane מסנן יחידה, מתאים בנפח מצומצם דגימה ביולוגית כגון BALF. טכניקה זו פשוטה, יעילה, ומספק טוהר גבוהה ומדרגיות לתמוך המחקר של EVs נגזר BALF.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 centrifugal filters Ultracel-100K</td>
			<td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Corning Cellgro, Manassas, VA</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td>
			<td>EMD8550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Research Products International, Prospect, IL</td>
			<td>75277-39-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Corning Cellgro, Manassas, VA</td>
			<td>46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td>
			<td>S3014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep</td>
			<td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td>
			<td>MKCD9753</td>
			<td>Density Gradient Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>VetOne, Boise, ID</td>
			<td>13985-702-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Akorn Animal Health, Lake Forest, IL</td>
			<td>59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td>BD Syringe, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>309656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angiocatheter 20G</td>
			<td>BD Syringe, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>381703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes 15 mL</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes 50 mL</td>
			<td>Corning Cellgro, Manassas, VA</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicinchonic acid (BCA) protein assay</td>
			<td>Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse TSG101 Antibody</td>
			<td>AbCam, Cambridge, MA</td>
			<td>AB125011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse PE-CD63 Antibody</td>
			<td>Biolegend, San Diego, CA</td>
			<td>143904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Danvers, MA</td>
			<td>7074S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x LDS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Reducing agent (Bolt)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Lysis buffer (Bolt)</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Danvers, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolt 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>NW04120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Nitrocellulose mini stacks</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>IB23002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescent HRP antibody detection reagent HyGLO</td>
			<td>Denville Scientific, Holliston, MA</td>
			<td>E2400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes 17 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, Pasadena, CA</td>
			<td>337986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes 38.5 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, Pasadena, CA</td>
			<td>326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning SFCA Syringe Filters 0.2 &#181;m pore</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>09-754-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter, Pasadena, CA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight (NS300)</td>
			<td>Malvern, Worcestershire, UK</td>
			<td>-</td>
			<td>To measure particle size distribution and particle concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQuant Analyzer 10 flow cytometer</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot Transfer Apparatus</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System</td>
			<td>Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v. 10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of extracellular vesicles from murine bronchoalveolar lavage fluid using an ultrafiltration centrifugation technique

חוץ-תאית שלפוחית (EVs) הם מרכיבים subcellular שהתגלתה לשחק תפקידים חשובים רבים ביולוגית איתות פונקציות במהלך מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים. בידודו של EVs ממשיכה להיות אתגר גדול בתחום זה, בשל מגבלות מהותי כל טכניקה. Ultracentrifugation דיפרנציאלי בשיטה צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות היא גישה נפוץ והוא נחשב להיות ההליך תקן הזהב לבידוד EV. עם זאת, הליך זה גוזלת זמן, עתירי עבודה, ותוצאות בדרך כלל מדרגיות נמוכה, אשר ייתכן שלא יתאים לדוגמאות בנפח מצומצם כמו נוזל שטיפה bronchoalveolar. נדגים שיטה בידוד אולטראפילטרציה צנטריפוגה היא פשוטה וזה ואת העבודה-היעילה עדיין מספקת תשואה גבוהה טוהר. אנו מציעים כי שיטה זו בידוד יכול להיות גישה חלופית מתאימה לבידוד EV, במיוחד עבור דגימות ביולוגיות בנפח מצומצם.

ביצענו EV בידוד מן העכבר BALF באמצעות שיטות בידוד UFC, UC-DGC באותו יום. השיטה UFC נדרש כ 2.5-3 h, ואילו הטכניקה UC-DGC נדרש 8 שעות של זמן העיבוד. זה לא כללו buffers וריאגנט זמן הכנה. יצוין, כי היתה אפשרות לבצע מספר משימות אחרות בתקופות ארוכות צנטריפוגה. ובכל זאת, כל ההליך נמשך כמעט יום שלם UC-DGC ב...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique at JoVE.com

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

כאן, אנו מתארים שני שלפוחית חוץ-תאית בידוד םילוקוטורפ אולטראפילטרציה צנטריפוגה, ultracentrifugation עם צפיפות צנטריפוגה הדרגתיות, לבודד שלפוחית חוץ-תאית מדגימות נוזלים שטיפה bronchoalveolar מאתר. השלפוחיות המוגלתיות חוץ-תאית נגזר נוזל שטיפת מאתר bronchoalveolar על ידי שתי השיטות לכמת, מאופיין.

בידוד של שלפוחית חוץ-תאי של נוזל שטיפה Bronchoalveolar מאתר באמצעות טכניקת צנטריפוגה אולטראפילטרציה

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות הקשורות היעילות, תשואת התאוששות, וטוהר של נוזל lavage ברונכואלוולרית נגזר יבולים חוץ תאיים באמצעות גישה צנטריפוגה אולטרה סינון. השווינו ישירות טכניקה זו לטכניקת טיהור הדרגתית אולטרה-מרכזית וצפיפות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה פשוט, יעיל, ומתאים דגימות נפח קטן כגון נוזל lavage ברונכואלוולאר מורין.חשוב מכך, הוא מספק טוהר גבוה ומדרגיות גבוהה משמעותית בהשוואה לשיטת בידוד אולטרה-מרכזית. הדגמת ההליך תהיה מר נורמן גארט השלישי, עמית מחקר במעבדה שלי. כדי להתחיל, להכניס אנגיוקטר מד 22 לתוך קנה הנשימה של עכבר המתת דמה.חבר מזרק אינסולין עם מיליליטר אחד של DPBS סטרילי קר כקרח, ולהחדיר מיליליטר אחד לשתי הריאות. לאט למשוך את הבוכנה מזרק כדי לאחזר נוזל lavage bronchoalveolar, או נוזל BAL. ולחלק את נוזל BAL לתוך צינור חרוט על קרח.לאחר מכן, למשוך נוזל BAL מ 25 עכברים ולחלק אותו לשתי קבוצות שוות. צנטריפוגה נוזל BAL ב 400 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאסוף את supernatant ו צנטריפוגה זה ב 15, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.לאחר מכן לאסוף את supernatant ולהמשיך את צעדי בידוד EV מיד. ראשית, לסנן את natant סופר באמצעות מסנן מזרק סטרילי מיקרומטר 0.2. לאחר מכן, יש לצייד את יחידת הסינון הצנטריפוגלית ב- DPBS סטרילי למשך 10 דקות.ואז צנטריפוגה יחידת הצנטריפוגלי ב 15, 000 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מלא את המסנן עם 15 מיליליטר של נוזל BAL. וצנטריפוגה זה ב3, 000 G של במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן, לשטוף את retentate עם 14 מיליליטר של DPBS סטרילי על ידי צינורות בעדינות שוב ושוב. צנטריפוגה יחידת המסנן ב 3, 000 G של בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי להסיר את DPBS ולרכז את retentate. כדי לאסוף את נוזל BAL מרוכז נגזר EV של, להכניס pipetter לתוך החלק התחתון של יחידת המסנן, ולמשוך את המדגם באמצעות תנועה גורפת מצד לצד.ואז aliquot נוזל BAL נגזר EV של ולאחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס. לחלופין, התחל בהעברת העל-טבעי הקודם שנרכש לצינור אולטרה-מרכזי. וצנטריפוגה זה ב10, 000 G של במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.ואז לאסוף את העל טבעי צנטריפוגה. השלך את העל-טבעי והשהה מחדש את גלולת ה-EV ב-200 מיקרוליטרים של DPBS. לאחר מכן, לערבב את ההשעיה EV עם 300 microliters של 50% יודקסנול פתרון עבודה.ולהעביר אותו לצינור אולטרהצנטריפוגה 15 מיליליטר. לאחר מכן הוסף פתרון מאגר בהתאם לפרוטוקול הטקסט כדי ליצור שיפוע צפיפות ציפה, וצנטריפוג אותו ב 100, 000 G של במשך שלוש שעות ו 50 דקות. לאסוף את 15%ואת שברי iodixanol 25%, ולדלל אותם DPBS להביא את עוצמת הקול עד 15 מיליליטר.מעבירים את השברים לצינור אולטרהצנטריפוגה חדש וצנטריפוגה ב 100, 000 G של בארבע מעלות צלזיוס במשך 60 דקות. השלך את העל-טבעי והשהה מחדש את כדורי ה- EV ב- 50 מיקרוליטרים של DPBS סטרילי. כדי להתחיל ניתוח מעקב חלקיקי ננו, לדלל את מדגם EV במיליליטר אחד של DPBS.ותטען את הדגימה למזרק אינסולין. לאחר מכן, לצרף את המזרק למשאבת מזרק, ולמדוד את מספרי החלקיק ואת גודל. הגדר את רמת המצלמה ל- 14 ואת סף הזיהוי לאחד.לאחר מכן, השתמש בקורא לוחות כדי לכמת את כמות החלבון בדגימה EV באמצעות זיהוי colorimetric. ממיסים כמות שווה של חלבון EV מכל דגימה עם מאגר טעינה סופג ו- DTT. ואז לחמם את הדגימות ב 70 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.לטעון את הדגימות לתוך ג'ל ביס-טריס פלוס אקרילאמיד ולהפעיל אלקטרופורזה במשך 35 דקות. לאחר מכן מעבירים את החלבונים לממברנה ניטרוסלולוס בשיטת העברה יבשה. לאחר מכן, לחסום את הממברנה עם חמישה אחוז חלב דל שומן במשך 60 דקות עם נדנדה עדינה.הדגירה את הממברנה עם נוגדן לסמן חלבון משטח EV בארבע מעלות צלזיוס עם נדנדה עדינה לילה. לפתח את הממברנה על ידי דגירה הממברנה עם נוגדן קישור HRP במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את הממברנה במשך 10 דקות עם חיץ TBST שלוש פעמים.לבסוף, לפתח את הממברנה עם reagent זיהוי נוגדנים HRP chemiluminescent לפני שתמשיך הדמיה. כדי להתחיל ציטומטריית זרימה, לדלל נוזל BAL נגזר EV של 49 microliters של מאגר כתמי PEB. לאחר מכן מוסיפים שלושה נוגדנים לכל אחת מהדגימות, לפני הדגירה של הדגימות בארבע מעלות צלזיוס עם נדנדה במשך 60 דקות בחושך.לבסוף, לדלל את הדגימות עם 40 microliters של מאגר כתמי PEB מסונן קרום ולבצע ניתוח cytometry זרימה. בפרוטוקול זה, EV של היו מבודדים מנוזל BAL העכבר באמצעות UFC ושיטות UC-DGC. נוזל BAL נגזר EV של עכברים רגילים מבודדים על ידי שיטת UFC הציג גדלים קטנים יותר התפלגות גודל אחיד יותר מאשר UC-DGC-EV של.בטכניקת UFC היו גם ספירת חלקיקים כוללת גבוהה משמעותית בהשוואה לטכניקת UC-DGC. התאוששות החלבון הכוללת שנמדדה במיליגרם של UFC-EV היה גם גבוה יותר מזה של UC-DGC-EV של, המציין כי טכניקת UFC הוא יותר זמן ומאמץ יעיל. לבסוף, נוזל BAL נגזר EV של גם התאפיינו עוד יותר באמצעות ציטומטריה זרימה.ה-UFC-EV ו-UC-DGC-EV של שניהם מבוטא CD63, CD9, ו CD81. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור rehydrate קרום יחידת אולטרה סינון עם DPBS. לאחר הממברנה הוא hydrated, היחידה צריכה להישמר רטוב בכל עת עד בשימוש.אחזור ניתוב חוץ-תאי מיחידה סינון יכול להיות מאתגר. ודא כי קצה פיפטה נסחף מצד לצד כדי לשחזר את רוב EV של מיחידה סינון. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום בידוד הגוף החוץ-תאי כדי לחקור את הפונקציות הביולוגיות של מליפת ברונכואלוולרית שמקורה בווסקולרים חוץ-תאיים בתנאים נורמליים או פתולוגיים בבעלי חיים קטנים.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

בידוד של קליפת המוח Microglia עם immunophenotype משומר ופונקציונאלי מילודי Murine

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

הניצול של לוע התחתון Intratracheal PAMP מנהל ושטיפה ברונכואלוואולרית כדי להעריך את תגובת מארח חיסון של עכברים

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

בידוד של תאי Murine לימפה צומת סטרומה

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

המונוציטים בידוד והזרקה תוך ורידית של Murine מח העצם נגזר

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

בידוד של לויקוציטים מרקמות Murine בממשק האם והעובר

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

בידוד ההפעלה של Murine לימפוציטים

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

זרימה Virometry לנתח אנטיגני ספקטרה של virions ואת תאי שלפוחית

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

ברונכאלווולאר של ריאות Murine כדי לנתח דלקת תאים דלקתית

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

בידוד ושלפוחיות אפיון של חוץ-תאית מן הבוגרים עלקת הבילהרציה japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment