Name: isolation of extracellular vesicles from murine bronchoalveolar lavage fluid using an ultrafiltration centrifugation technique
Uploaded: 2018-11-09T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique at JoVE.com

仕事をサポートするには、(PC) へ NHLBI/NIH 助成金 HL103868 と HL137076 (PC) へ、(PC の場合) にアメリカ心臓協会費と (パソコン) にサミュエル ・ オシン包括的がん研究所 (SOCCI) 肺がん研究賞を受賞。EV ナノ粒子追跡の分析のための Nanosight マシンを提供してくれますヒマラヤスギ シナイ医療センターで Smidt 心研究所に大感謝したいと思います。

動物の使用率および動物のすべてのプロシージャは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ヒマラヤスギ シナイ医療センター (CSMC) でによって承認されました。
1. マウスの気管支肺胞洗浄液 (BALF) コレクションと準備
<ol><li>BALF コレクション<ol>
<li>ケタミン (300 mg/kg) と頚部転位によって腹腔内経路を介してキシラジン (30 mg/kg) のカクテルとマウスを安楽死させます。</li...

<ol>
	<li>Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+composition,+biogenesis+and+function.">Exosomes: composition, biogenesis and function.</a> Nature Reviews Immunology. 2, 569-579 (2002).</li><li>Kosaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+Mechanisms+and+Intercellular+Transfer+of+MicroRNAs+in+Living+Cells.">Secretory Mechanisms and Intercellular Transfer of MicroRNAs in Living Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17442-17452 (2010).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Fujita, Y., Kosaka, N., Araya, J., Kuwano, K., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+lung+microenvironment+and+pathogenesis.">Extracellular vesicles in lung microenvironment and pathogenesis.</a> Trends in Molecular Medicine. 21 (9), 533-542 (2015).</li><li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+function+of+exosomes+in+cancer.">The biology and function of exosomes in cancer.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).</li><li>Janowska-Wieczorek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+derived+from+activated+platelets+induce+metastasis+and+angiogenesis+in+lung+cancer.">Microvesicles derived from activated platelets induce metastasis and angiogenesis in lung cancer.</a> International Journal of Cancer. 113 (5), 752-760 (2005).</li><li>Valadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells.">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).</li><li>Colombo, M., Raposo, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis,+Secretion,+and+Intercellular+Interactions+of+Exosomes+and+Other+Extracellular+Vesicles.">Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 255-289 (2014).</li><li>Rocco, G. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+to+improve+detection+and+analysis+of+extracellular+vesicles+using+flow+cytometry.">Techniques to improve detection and analysis of extracellular vesicles using flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 87 (11), 1052-1063 (2015).</li><li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+Exosome+Isolation+Techniques.">Progress in Exosome Isolation Techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li><li>Willis, G. R., Kourembanas, S., Mitsialis, S. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafiltration+combined+with+size+exclusion+chromatography+efficiently+isolates+extracellular+vesicles+from+cell+culture+media+for+compositional+and+functional+studies.">Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies.</a> Scientific Reports. 7 (1), 15297 (2017).</li><li>Vergauwen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confounding+factors+of+ultrafiltration+and+protein+analysis+in+extracellular+vesicle+research.">Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2704 (2017).</li><li>Kesimer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+exosome-like+vesicles+released+from+human+tracheobronchial+ciliated+epithelium:+a+possible+role+in+innate+defense.">Characterization of exosome-like vesicles released from human tracheobronchial ciliated epithelium: a possible role in innate defense.</a> The FASEB Journal. 23 (6), 1858-1868 (2009).</li><li>Torregrosa Paredes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoalveolar+lavage+fluid+exosomes+contribute+to+cytokine+and+leukotriene+production+in+allergic+asthma.">Bronchoalveolar lavage fluid exosomes contribute to cytokine and leukotriene production in allergic asthma.</a> Allergy. 67 (7), 911-919 (2012).</li><li>Alipoor, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+Exosomal+miRNA+in+Respiratory+Diseases.">Exosomes and Exosomal miRNA in Respiratory Diseases.</a> Mediators of Inflammation. 2016, 5628404 (2016).</li><li>Hough, K. P., Chanda, D., Duncan, S. R., Thannickal, V. J., Deshane, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+Immunoregulation+of+Chronic+Lung+Diseases.">Exosomes in Immunoregulation of Chronic Lung Diseases.</a> Allergy. 72 (4), 534-544 (2017).</li><li>Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoalveolar+Lavage+of+Murine+Lungs+to+Analyze+Inflammatory+Cell+Infiltration.">Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).</li><li>Minciacchi, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MYC+Mediates+Large+Oncosome-Induced+Fibroblast+Reprogramming+in+Prostate+Cancer.">MYC Mediates Large Oncosome-Induced Fibroblast Reprogramming in Prostate Cancer.</a> Cancer Research. 77 (9), 2306-2317 (2017).</li><li>Koliha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+Affects+the+Composition+of+Blood+Cell-Derived+Extracellular+Vesicles.">Melanoma Affects the Composition of Blood Cell-Derived Extracellular Vesicles.</a> Frontiers in Immunology. 7, 581 (2016).</li><li>Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses.">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).</li><li>Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes/microvesicles+as+a+mechanism+of+cell-to-cell+communication.">Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication.</a> Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).</li><li>Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+microvesicles:+extracellular+vesicles+for+genetic+information+transfer+and+gene+therapy.">Exosomes and microvesicles: extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy.</a> Human Molecular Genetics. 21, R125-R134 (2012).</li><li>Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Guti&#233;rrez-V&#225;zquez, C., S&#225;nchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+it+out:+Regulation+of+exosome+loading.">Sorting it out: Regulation of exosome loading.</a> Seminars in Cancer Biology. 28, 3-13 (2014).</li><li>Hoshino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+exosome+integrins+determine+organotropic+metastasis.">Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis.</a> Nature. 527, 329-335 (2015).</li><li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Exosome+Total+Isolation+Chip.">The Exosome Total Isolation Chip.</a> ACS Nano. 11 (11), 10712-10723 (2017).</li><li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator.">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).</li><li>Zhao, Z., Yang, Y., Zeng, Y., He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Microfluidic+ExoSearch+Chip+for+Multiplexed+Exosome+Detection+Towards+Blood-based+Ovarian+Cancer+Diagnosis.">A Microfluidic ExoSearch Chip for Multiplexed Exosome Detection Towards Blood-based Ovarian Cancer Diagnosis.</a> Lab on a Chip. 16 (3), 489-496 (2016).</li><li>Fang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+application+of+a+microfluidic+chip+for+immunocapture+and+quantification+of+circulating+exosomes+to+assist+breast+cancer+diagnosis+and+molecular+classification.">Clinical application of a microfluidic chip for immunocapture and quantification of circulating exosomes to assist breast cancer diagnosis and molecular classification.</a> PloS ONE. 12 (4), e0175050 (2017).</li><li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator.">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> American Journal Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).</li><li>Kornilov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+ultrafiltration-based+protocol+to+deplete+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum.">Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).</li><li>Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+protein,+microRNA,+and+mRNA+yields+using+different+methods+of+urinary+exosome+isolation+for+the+discovery+of+kidney+disease+biomarkers.">Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers.</a> Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).</li><li>Bosch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+prevents+aggregation+of+exosomes+and+cryodamage.">Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage.</a> Scientific Reports. 6 (1), 329 (2016).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+progenitor+cell-derived+exosomes+prevent+cardiomyocytes+apoptosis+through+exosomal+miR-21+by+targeting+PDCD4.">Cardiac progenitor cell-derived exosomes prevent cardiomyocytes apoptosis through exosomal miR-21 by targeting PDCD4.</a> Cell Death &amp; Disease. 7 (6), e2277 (2016).</li><li>Agarwal, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental,+Systems+and+Computational+Approaches+to+Understanding+the+MicroRNA-Mediated+Reparative+Potential+of+Cardiac+Progenitor+Cell-Derived+Exosomes+From+Pediatric+Patients.">Experimental, Systems and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients.</a> Circulation Research. 120 (4), 701-712 (2017).</li><li>Merchant, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfiltration+isolation+of+human+urinary+exosomes+for+characterization+by+MS.">Microfiltration isolation of human urinary exosomes for characterization by MS.</a> PROTEOMICS - Clinical Applications. 4 (1), 84-96 (2010).</li><li>Gouin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+method+for+identification+of+suitable+reference+genes+in+extracellular+vesicles.">A comprehensive method for identification of suitable reference genes in extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1347019 (2017).</li><li>Betsuyaku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Granule+Proteins+in+Bronchoalveolar+Lavage+Fluid+from+Subjects+with+Subclinical+Emphysema.">Neutrophil Granule Proteins in Bronchoalveolar Lavage Fluid from Subjects with Subclinical Emphysema.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159 (6), 1985-1991 (1999).</li></ol>

過去数十年間、科学者は生体のホメオスタシスの EVs の意義を解明しています。EVs がその生理活性貨物分子1,21,22,26,27を近隣や遠くの細胞を調節することによって多くの病気プロセスに大きな役割を果すより重要なは、,28,29...

エクソソームは、EVs を, 直径 50-200 nm の最小サブセット、シグナリング プロセス1,2,3,4、5の多様なアレイにまたがって複数の生物学的機能を持っています。彼らは主に脂質、蛋白質および核酸6,7,8,9 など貨物分子を介して細胞間コミュニケーションを促進することで細胞およびティッシュの恒常性を支配します。.EV 研究の 1 つの重要なステップは、分離プロセスです。差動遠心 (UC)、密度勾配遠心法 (DGC) の有無は金標準的なアプローチが、この方法には非効率的な EV 回収率と低いスケーラビリティ10などを含む、主要な制限事項,11,12、それは細胞培養上清または高エキソソーム生産試料などの大きなボリューム サンプルへ最高の利用を制限します。利点と限外ろ過、クロマトグラフィー、ビーズや、列ごとマイクロ流体、immunoaffinity 分離サイズ排除など、他の方法の不利な点はよく記述されているとする現代の補足的な手順が開発されて克服し、各アプローチ11,12,の13,14,15の技術的制限を最小限に抑えます。他は UC のメソッド16,17,18に匹敵する純度を提供する代替手法であるフィルター ユニットのナノポーラス膜の限外ろ過遠心分離 (UFC) 示されています。この手法は、代替の分離方法の一つとして考えられます。
気管支肺胞洗浄液 (BALF) では、さまざまな呼吸器の条件19,20,21,22に多数の生物学的機能を持つ EVs が含まれます。BALF 派生 EVs が伴います洗浄回収の限られた量と同様に、ヒトでは、気管支鏡検査手順の侵襲によるいくつかの課題を勉強しています。マウスなどの小型実験動物、数ミリリットルのみ正常肺条件で回復することができます、炎症や線維化肺23より。その結果、下流用差動遠心による BALF の EV の分離のための十分な量を収集できないことがあります。ただし、正しい EV 集団を分離は、EV の生物学的機能を研究するための重要な要因です。効率と効果の微妙なバランスは、よく確立された EV 分離方法に挑戦を続けています。
この現在の調査を示す 100 kDa 分子量カットオフ (MWCO) ナノ膜フィルター ユニットを利用した遠心限外濾過法アプローチは BALF など少量の生体試料に適している.この手法は、簡単に効率的と高純度および BALF 由来の電気自動車の研究をサポートするための拡張性を提供します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 centrifugal filters Ultracel-100K</td>
			<td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Corning Cellgro, Manassas, VA</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td>
			<td>EMD8550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Research Products International, Prospect, IL</td>
			<td>75277-39-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Corning Cellgro, Manassas, VA</td>
			<td>46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td>
			<td>S3014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep</td>
			<td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td>
			<td>MKCD9753</td>
			<td>Density Gradient Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>VetOne, Boise, ID</td>
			<td>13985-702-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Akorn Animal Health, Lake Forest, IL</td>
			<td>59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td>BD Syringe, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>309656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angiocatheter 20G</td>
			<td>BD Syringe, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>381703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes 15 mL</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes 50 mL</td>
			<td>Corning Cellgro, Manassas, VA</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicinchonic acid (BCA) protein assay</td>
			<td>Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse TSG101 Antibody</td>
			<td>AbCam, Cambridge, MA</td>
			<td>AB125011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse PE-CD63 Antibody</td>
			<td>Biolegend, San Diego, CA</td>
			<td>143904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Danvers, MA</td>
			<td>7074S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x LDS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Reducing agent (Bolt)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Lysis buffer (Bolt)</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Danvers, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolt 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>NW04120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Nitrocellulose mini stacks</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>IB23002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescent HRP antibody detection reagent HyGLO</td>
			<td>Denville Scientific, Holliston, MA</td>
			<td>E2400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes 17 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, Pasadena, CA</td>
			<td>337986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes 38.5 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, Pasadena, CA</td>
			<td>326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning SFCA Syringe Filters 0.2 &#181;m pore</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>09-754-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter, Pasadena, CA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight (NS300)</td>
			<td>Malvern, Worcestershire, UK</td>
			<td>-</td>
			<td>To measure particle size distribution and particle concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQuant Analyzer 10 flow cytometer</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot Transfer Apparatus</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System</td>
			<td>Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v. 10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of extracellular vesicles from murine bronchoalveolar lavage fluid using an ultrafiltration centrifugation technique

細胞小胞 (Ev) は、通知機能を生理学的および病理学的状態の間に多くの生物学的に重要な役割を果たす新たに発見された細胞レベル下のコンポーネントです。EVs の分離は、各テクニックに固有の制限のため、この分野で主要な挑戦を続けています。密度勾配遠心法で差動遠心は一般的に使用されるアプローチと EV 分離のゴールド スタンダード プロシージャと見なされます。ただし、この手順は、時間のかかる、労働集約的で、一般的に気管支肺胞洗浄液などの少量サンプルが適さない場合があります低レベルの拡張性の結果します。限外ろ過遠心分離法は簡単な時間と労働効率の良い高回収率と純度をまだ提供して示す.この分離方法は特に少量試料のための EV 分離に適している方法でされる可能性を提案します。

マウス BALF から EV 分離を行った同じ日に UFC と UC DGC の分離方法を使用して。UFC メソッドは、UC DGC テクニック必要な処理時間の 8 時間に対し、約 2.5-3 h を必要しました。これはバッファーと試薬の準備時間を含んでいませんでした。遠心分離の長い期間の間にいくつか他のタスクを実行できる可能性がありますをそれに留意されたいです。それにもかかわらず、全体...

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Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

ここでは、2 つ小胞細胞の隔離のプロトコル、遠心限外濾過とマウスの気管支肺胞洗浄液のサンプルから細胞小胞を分離する密度勾配遠心法と遠心をについて説明します。両法によりマウスの気管支肺胞洗浄液由来細胞の小胞は定量化され、特徴付けられます。

限外ろ過遠心分離法を用いたマウスの気管支肺胞洗浄液細胞小胞の分離

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during ...

この方法は、限外濾過遠心分離アプローチを用いて、気管支肺胞溶岩液由来の気管支肺胞溶岩液の効率、回収収率、純度に関する質問に対処するのに役立ちます。この技術を超遠心化と密度勾配精製技術と直接比較した。この技術の主な利点は、それが簡単で効率的で、マウス気管支肺胞洗浄液などの少量サンプルに適していることです。さらに重要なのは、超遠心分離法に比べて高純度で拡張性が著しく高くなることです。この手順を実証することは、私の研究室の研究員であるノーマン・ギャレット3世です。まず、安楽死させたマウスの気管に22ゲージの血管カテーテルを挿入します。1ミリリットルの氷冷滅菌DPBSでインスリン注射器を取り付け、両方の肺に1ミリリットルを植え付けます。気管支肺胞洗浄液、またはBAL液を取り出すためにゆっくりと注射器プランジャーを引き出します。そして、氷の上の円錐管にBAL流体を分配します。この後、25匹のマウスからBAL液を引き出し、2つの等しいセットに分けます。400倍GでBAL液を摂氏4度で5分間遠心する。上清を集め、摂氏4度で15,000倍Gで10分間遠心分離します。その後、上清を収集し、すぐにEV分離手順に進みます。まず、0.2マイクロメートルの滅菌シリンジフィルターを通してスーパーナタントをフィルターします。この後、遠心フィルターユニットを滅菌DPBSで10分間平衡化する。その後、遠心単位を摂氏4度で10分間15,000倍Gで遠心分離します。15 ミリリットルの BAL 液でフィルターを充填します。そして、摂氏4度で30分間3,000 Gで遠心分離します。この後、14ミリリットルの無菌DPBSでリテン酸を軽くピペット処理して繰り返し洗浄します。フィルター単位を摂氏4度で3,000Gで遠心し、DPBSを取り除き、再狭窄を濃縮する。濃縮BAL流体由来EVを収集するには、フィルターユニットの底部にピペッタを挿入し、側面から横へのスイープ動作を使用してサンプルを引き出します。その後、BAL流体由来EVをアリクォートし、マイナス80°Cで保存します。あるいは、先に、先に取得した上清を超遠心チューブに移す。そして、摂氏4度で30分間10,000 Gで遠心分離します。その後、上清と遠心分離機を収集します。上清を捨て、200マイクロリットルのDPBSでEVペレットを再懸濁します。この後、EV懸濁液を50%イオジキサノール作動溶液の300マイクロリットルと混合する。そして15ミリリットルの超遠心チューブに移す。次に、テキストプロトコルに従ってバッファ溶液を追加して浮力密度勾配を作成し、遠心分離機を100,000 Gで3時間50分間追加します。15%と25%のイオデキサノール分画を収集し、15ミリリットルまでの体積をもたらすためにDPBSでそれらを希釈します。100,000 Gの新しい超遠心チューブと遠心分離機に4°Cで60分間移動します。上清を捨て、50マイクロリットルの無菌DPBSでEVペレットを再中断します。ナノ粒子追跡解析を開始するには、EVサンプルを1ミリリットルのDPBSで希釈します。そして、インスリン注射器にサンプルをロードします。この後、シリンジをシリンジポンプに取り付け、粒子数とサイズを測定します。カメラレベルを 14 に設定し、検出しきい値を 1 に設定します。次に、プレートリーダーを使用して、色分け検出を介してEVサンプル中のタンパク質の量を定量化します。各サンプルから同量のEVタンパク質をブロッティングローディングバッファーと DTT で溶解します。その後、70°Cで10分間加熱します。サンプルをビストリプラスアクリルアミドゲルにロードし、35分間電気泳動を実行します。次に、乾燥移動法を用いてニトロセルロース膜にタンパク質を移す。この後、穏やかな揺れで60分間5%の脱脂ミルクで膜をブロックします。一晩穏やかな揺れで4°CでEV表面タンパク質マーカーに抗体で膜をインキュベートします。膜をHRPリンク抗体で室温で60分間インキュベートして開発します。膜をTBSTバッファーで10分間洗浄します。最後に、イメージングに進む前に、化学発光HRP抗体検出試薬で膜を開発します。フローサイトメトリーを開始するために、49マイクロリットルのPEB染色バッファーでBAL流体由来EVを希釈した。次に、サンプルのそれぞれに3つの抗体を加え、暗闇の中で60分間揺れ動かしてサンプルを摂氏4度でインキュベートします。最後に、40マイクロリットルの膜濾過されたPEB染色バッファーでサンプルを希釈し、フローサイトメトリー分析を行います。このプロトコルでは、EVは、UFCおよびUC-DGC法を用いてマウスBAL流体から分離した。BAL流体は、UFC法によって単離された正常マウス由来のEVを導出し、UC-DGC-EVよりも小さいサイズおよびより均一なサイズ分布を示した。また、UFC技術は、UC-DGC技術と比較して、総粒子数が有意に高い。UFC-EVのミリグラムで測定された総タンパク質回収率もUC-DGC-EVのそれよりも高く、UFC技術がより時間と労力の効率的であることを示しています。最後に、BAL流体由来EVもフローサイトメトリーを介してさらに特徴付けられていた。UFC-EVとUC-DGC-EVは、いずれもCD63、CD9、CD81を表現した。この手順を試みている間、DPBSで限外濾過ユニット膜を水分補給することを忘れないでください。膜が水和したら、単位は使用されるまで常に濡れておく必要があります。フィルターユニットから細胞外小胞リテン酸を取り出すことは困難です。フィルターユニットからEVの大部分を回復するために、ピペットチップが左右にスイープされていることを確認してください。その開発後、この技術は、細胞外小胞の分離の分野の研究者が、小動物の正常または病理学的状態の両方で気管支肺胞溶岩由来の細胞外小胞の生物学的機能を探求する道を開いた。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

マウス新生児から保護免疫表現と機能皮質ミクログリアの分離

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

マウスにおける宿主の免疫応答を評価する口腔咽頭気管内PAMP管理および気管支肺胞の活用

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

ネズミリンパ節間質細胞の単離

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

単離とマウス骨髄由来の単球の静脈注射

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

母体·胎児界面におけるマウス組織からの白血球の分離

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

単離とマウスリンパ球の活性化

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

ビリオンの抗原性スペクトルと細胞外ベシクルを分析するためのフローVirometry

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

炎症性細胞の浸潤を分析するための肺胞の気管支肺胞洗浄

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

分離と大人住血吸虫から細胞外小胞のキャラクタリゼーション

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment