Name: isolation of extracellular vesicles from murine bronchoalveolar lavage fluid using an ultrafiltration centrifugation technique
Uploaded: 2018-11-09T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique at JoVE.com

작품은 NHLBI/NIH 교부 금 HL103868 (컴퓨터)에 및 HL137076 (시공)를, (PC)를 미국 심장 협회 선진적인 및 Samuel Oschin 포괄적인 암 연구소 (솟) 폐 암 연구 상 (컴퓨터)에 의해 지원 됩니다. 우리는 우리에 게 EV 나노 분석 추적에 대 한 Nanosight 기계를 제공 하는 삼목 시 나이 의료 센터에 Smidt 심장 연구소에 우리의 큰 감사를 표현 하 고 싶습니다.

동물의 활용 및 모든 동물 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 삼목 시 나이 의료 센터 (CSMC)에 의해 승인 되었다.
1. murine Bronchoalveolar 게 액체 (BALF) 수집 및 준비
<ol><li>BALF 컬렉션<ol>
<li>케 타 민 (300 mg/kg) 및 자 궁 경부 전위 뒤 복 루트를 통해 xylazine (30 mg/kg)의 칵테일 쥐 안락사</li>
		<li>기도에 22 G angiocatheter를 삽입 합니다. 얼음 처럼 차가운 살 균 Dulbecco의 인산 염 버...

<ol>
	<li>Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+composition,+biogenesis+and+function.">Exosomes: composition, biogenesis and function.</a> Nature Reviews Immunology. 2, 569-579 (2002).</li><li>Kosaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+Mechanisms+and+Intercellular+Transfer+of+MicroRNAs+in+Living+Cells.">Secretory Mechanisms and Intercellular Transfer of MicroRNAs in Living Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17442-17452 (2010).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Fujita, Y., Kosaka, N., Araya, J., Kuwano, K., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+lung+microenvironment+and+pathogenesis.">Extracellular vesicles in lung microenvironment and pathogenesis.</a> Trends in Molecular Medicine. 21 (9), 533-542 (2015).</li><li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+function+of+exosomes+in+cancer.">The biology and function of exosomes in cancer.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).</li><li>Janowska-Wieczorek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+derived+from+activated+platelets+induce+metastasis+and+angiogenesis+in+lung+cancer.">Microvesicles derived from activated platelets induce metastasis and angiogenesis in lung cancer.</a> International Journal of Cancer. 113 (5), 752-760 (2005).</li><li>Valadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells.">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).</li><li>Colombo, M., Raposo, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis,+Secretion,+and+Intercellular+Interactions+of+Exosomes+and+Other+Extracellular+Vesicles.">Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 255-289 (2014).</li><li>Rocco, G. D., Baldari, S., Toietta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+other+extracellular+vesicles-mediated+microRNA+delivery+for+cancer+therapy.">Exosomes and other extracellular vesicles-mediated microRNA delivery for cancer therapy.</a> Translational Cancer Research. 6 (Supplement 8), S1321-S1330 (2017).</li><li>Peterson, M. F., Otoc, N., Sethi, J. K., Gupta, A., Antes, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+systems+for+exosome+investigation.">Integrated systems for exosome investigation.</a> Methods. 87 (1), 31-45 (2015).</li><li>Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+to+improve+detection+and+analysis+of+extracellular+vesicles+using+flow+cytometry.">Techniques to improve detection and analysis of extracellular vesicles using flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 87 (11), 1052-1063 (2015).</li><li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+Exosome+Isolation+Techniques.">Progress in Exosome Isolation Techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li><li>Willis, G. R., Kourembanas, S., Mitsialis, S. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafiltration+combined+with+size+exclusion+chromatography+efficiently+isolates+extracellular+vesicles+from+cell+culture+media+for+compositional+and+functional+studies.">Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies.</a> Scientific Reports. 7 (1), 15297 (2017).</li><li>Vergauwen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confounding+factors+of+ultrafiltration+and+protein+analysis+in+extracellular+vesicle+research.">Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2704 (2017).</li><li>Kesimer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+exosome-like+vesicles+released+from+human+tracheobronchial+ciliated+epithelium:+a+possible+role+in+innate+defense.">Characterization of exosome-like vesicles released from human tracheobronchial ciliated epithelium: a possible role in innate defense.</a> The FASEB Journal. 23 (6), 1858-1868 (2009).</li><li>Torregrosa Paredes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoalveolar+lavage+fluid+exosomes+contribute+to+cytokine+and+leukotriene+production+in+allergic+asthma.">Bronchoalveolar lavage fluid exosomes contribute to cytokine and leukotriene production in allergic asthma.</a> Allergy. 67 (7), 911-919 (2012).</li><li>Alipoor, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+Exosomal+miRNA+in+Respiratory+Diseases.">Exosomes and Exosomal miRNA in Respiratory Diseases.</a> Mediators of Inflammation. 2016, 5628404 (2016).</li><li>Hough, K. P., Chanda, D., Duncan, S. R., Thannickal, V. J., Deshane, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+Immunoregulation+of+Chronic+Lung+Diseases.">Exosomes in Immunoregulation of Chronic Lung Diseases.</a> Allergy. 72 (4), 534-544 (2017).</li><li>Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoalveolar+Lavage+of+Murine+Lungs+to+Analyze+Inflammatory+Cell+Infiltration.">Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).</li><li>Minciacchi, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MYC+Mediates+Large+Oncosome-Induced+Fibroblast+Reprogramming+in+Prostate+Cancer.">MYC Mediates Large Oncosome-Induced Fibroblast Reprogramming in Prostate Cancer.</a> Cancer Research. 77 (9), 2306-2317 (2017).</li><li>Koliha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+Affects+the+Composition+of+Blood+Cell-Derived+Extracellular+Vesicles.">Melanoma Affects the Composition of Blood Cell-Derived Extracellular Vesicles.</a> Frontiers in Immunology. 7, 581 (2016).</li><li>Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses.">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).</li><li>Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes/microvesicles+as+a+mechanism+of+cell-to-cell+communication.">Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication.</a> Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).</li><li>Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+microvesicles:+extracellular+vesicles+for+genetic+information+transfer+and+gene+therapy.">Exosomes and microvesicles: extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy.</a> Human Molecular Genetics. 21, R125-R134 (2012).</li><li>Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Guti&#233;rrez-V&#225;zquez, C., S&#225;nchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+it+out:+Regulation+of+exosome+loading.">Sorting it out: Regulation of exosome loading.</a> Seminars in Cancer Biology. 28, 3-13 (2014).</li><li>Hoshino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+exosome+integrins+determine+organotropic+metastasis.">Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis.</a> Nature. 527, 329-335 (2015).</li><li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Exosome+Total+Isolation+Chip.">The Exosome Total Isolation Chip.</a> ACS Nano. 11 (11), 10712-10723 (2017).</li><li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator.">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).</li><li>Zhao, Z., Yang, Y., Zeng, Y., He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Microfluidic+ExoSearch+Chip+for+Multiplexed+Exosome+Detection+Towards+Blood-based+Ovarian+Cancer+Diagnosis.">A Microfluidic ExoSearch Chip for Multiplexed Exosome Detection Towards Blood-based Ovarian Cancer Diagnosis.</a> Lab on a Chip. 16 (3), 489-496 (2016).</li><li>Fang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+application+of+a+microfluidic+chip+for+immunocapture+and+quantification+of+circulating+exosomes+to+assist+breast+cancer+diagnosis+and+molecular+classification.">Clinical application of a microfluidic chip for immunocapture and quantification of circulating exosomes to assist breast cancer diagnosis and molecular classification.</a> PloS ONE. 12 (4), e0175050 (2017).</li><li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator.">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> American Journal Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).</li><li>Kornilov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+ultrafiltration-based+protocol+to+deplete+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum.">Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).</li><li>Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+protein,+microRNA,+and+mRNA+yields+using+different+methods+of+urinary+exosome+isolation+for+the+discovery+of+kidney+disease+biomarkers.">Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers.</a> Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).</li><li>Bosch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+prevents+aggregation+of+exosomes+and+cryodamage.">Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage.</a> Scientific Reports. 6 (1), 329 (2016).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+progenitor+cell-derived+exosomes+prevent+cardiomyocytes+apoptosis+through+exosomal+miR-21+by+targeting+PDCD4.">Cardiac progenitor cell-derived exosomes prevent cardiomyocytes apoptosis through exosomal miR-21 by targeting PDCD4.</a> Cell Death &amp; Disease. 7 (6), e2277 (2016).</li><li>Agarwal, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental,+Systems+and+Computational+Approaches+to+Understanding+the+MicroRNA-Mediated+Reparative+Potential+of+Cardiac+Progenitor+Cell-Derived+Exosomes+From+Pediatric+Patients.">Experimental, Systems and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients.</a> Circulation Research. 120 (4), 701-712 (2017).</li><li>Merchant, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfiltration+isolation+of+human+urinary+exosomes+for+characterization+by+MS.">Microfiltration isolation of human urinary exosomes for characterization by MS.</a> PROTEOMICS - Clinical Applications. 4 (1), 84-96 (2010).</li><li>Gouin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+method+for+identification+of+suitable+reference+genes+in+extracellular+vesicles.">A comprehensive method for identification of suitable reference genes in extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1347019 (2017).</li><li>Betsuyaku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Granule+Proteins+in+Bronchoalveolar+Lavage+Fluid+from+Subjects+with+Subclinical+Emphysema.">Neutrophil Granule Proteins in Bronchoalveolar Lavage Fluid from Subjects with Subclinical Emphysema.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159 (6), 1985-1991 (1999).</li></ol>

지난 몇 년간, 과학자는 세포 항상성에서 EVs의 significances unraveled는. 더 중요 한 것은, EVs 역할 주요 많은 질병 과정에 그들의 생리 화물 분자1,21,22,,2627 를 통해 이웃과 먼 셀을 변조 하 여 , 28 , 29 , 30</s...

Exosomes는 EVs, 50-200 nm 직경에서의 작은 하위 집합 그리고 신호 처리1,2,3,,45의 다양 한 배열을 통해 여러 생물 학적 기능을가지고. 그들은 주로 지질, 단백질 및 핵 산6,,78,9 등 화물 분자 세포 통신을 촉진 하 여 세포와 조직의 항상성 적용 . EV 연구에서 하나의 중요 한 단계는 격리 프로세스입니다. 차동 ultracentrifugation (UC), 또는 밀도 그라데이션 원심 (DGC) 없이 황금 표준 접근 방식으로 간주 됩니다 하지만이 방법은 비효율적 EV 복구 속도 낮은 확장성10 를 포함 하 여 주요 제한 사항 , 11 , 12, 그 큰 볼륨 샘플, 셀 문화 표면에 뜨는 또는 높은 exosome 생산 표본 등의 최고의 사용률을 제한합니다. 적용 또는 크로마토그래피, immunoaffinity 격리 구슬 또는 열 및 마이크로, 크기 배제 같은 다른 방법의 장단점은 잘 설명 하 고 현대 보충 절차 개발 되었습니다. 극복 하 고 각 접근11,12,13,,1415에 기술적 한계를 최소화 합니다. 다른 필터 단위에서 성공 막으로 한 원심 (UFC) UC 방법16,,1718에 비해 순도 제공 하는 대체 기법입니다 나타났습니다. 이 기술은 다른 절연 방법 중 하나로 간주 될 수 있습니다.
Bronchoalveolar 게 액체 (BALF) 들어 EVs를 다양 한 호흡기 조건19,20,,2122에서 다양 한 생물 학적 기능을가지고 있습니다. 공부 BALF 파생 EVs 임무 인 인간, 상계 절차로 제한 된 양의 게 유체 복구의 침입으로 인해 몇 가지 도전. 쥐 같은 작은 실험실 동물에 몇 밀리 리터 정상적인 폐 조건에서 복구할 수 있습니다, 그리고 염증 또는 거리 폐23에 덜도. 따라서, EV 격리에 대 한 충분 한 양의 BALF 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 차동 ultracentrifugation에 의해 수집 수 있습니다 실현. 그러나, 올바른 EV 인구 격리 EV 생물 학적 기능을 공부에 대 한 중요 한 요소 이다. 효율성과 효능 사이의 미묘한 균형 잘 설립 EV 격리 방법에 도전 하 고 있습니다.
현재이 연구는 100 kDa 분자량 컷오프 (MWCO) nanomembrane 필터 단위를 활용 하 여 원심 외 접근 BALF 같은 작은 볼륨 생물 표본 적합은 보여 줍니다. 이 기술은 간단 하 고 효율적으로, 그리고 높은 순도 BALF 파생 EVs의 연구를 지 원하는 확장성을 제공 합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 centrifugal filters Ultracel-100K</td>
			<td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Corning Cellgro, Manassas, VA</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td>
			<td>EMD8550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Research Products International, Prospect, IL</td>
			<td>75277-39-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Corning Cellgro, Manassas, VA</td>
			<td>46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td>
			<td>S3014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep</td>
			<td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td>
			<td>MKCD9753</td>
			<td>Density Gradient Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>VetOne, Boise, ID</td>
			<td>13985-702-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Akorn Animal Health, Lake Forest, IL</td>
			<td>59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td>BD Syringe, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>309656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angiocatheter 20G</td>
			<td>BD Syringe, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>381703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes 15 mL</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes 50 mL</td>
			<td>Corning Cellgro, Manassas, VA</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicinchonic acid (BCA) protein assay</td>
			<td>Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse TSG101 Antibody</td>
			<td>AbCam, Cambridge, MA</td>
			<td>AB125011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse PE-CD63 Antibody</td>
			<td>Biolegend, San Diego, CA</td>
			<td>143904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Danvers, MA</td>
			<td>7074S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x LDS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Reducing agent (Bolt)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Lysis buffer (Bolt)</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Danvers, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolt 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>NW04120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Nitrocellulose mini stacks</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>IB23002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescent HRP antibody detection reagent HyGLO</td>
			<td>Denville Scientific, Holliston, MA</td>
			<td>E2400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes 17 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, Pasadena, CA</td>
			<td>337986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes 38.5 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, Pasadena, CA</td>
			<td>326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning SFCA Syringe Filters 0.2 &#181;m pore</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>09-754-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter, Pasadena, CA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight (NS300)</td>
			<td>Malvern, Worcestershire, UK</td>
			<td>-</td>
			<td>To measure particle size distribution and particle concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQuant Analyzer 10 flow cytometer</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot Transfer Apparatus</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System</td>
			<td>Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v. 10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of extracellular vesicles from murine bronchoalveolar lavage fluid using an ultrafiltration centrifugation technique

Extracellular 소포 (EVs)는 많은 생물학 기능 생리 및 병리학 상태 동안 신호에 중요 한 역할을 하는 새로 발견된 된 subcellular 요소입니다. EVs의 각 기법에 기본 제한으로 인해이 분야에서 주요 도전 되 고 있습니다. 조밀도 기온 변화도 원심 분리 방법으로 차동 ultracentrifugation 일반적으로 사용 되는 방식 이며, EV 격리에 대 한 표준 절차로 간주 됩니다. 그러나,이 절차 시간이, 노동 집약, 그리고 일반적으로 bronchoalveolar 게 액체 같은 작은 볼륨 샘플에 적합 하지 않을 수 있습니다 낮은 확장성에서 결과. 한 원심 분리 방법 간단 하 고 시간 및 노동 효율 아직 제공 높은 복구 수율 및 순도 설명 합니다. 우리는이 격리 방법 EV 격리, 작은 볼륨 생물학 견본을 위해 특히 적합 한 대체 접근 될 수 있는 제안 합니다.

마우스 BALF에서에서 EV 격리를 수행 하는 우리 같은 날에 UFC와 UC DGC 격리 방법을 사용 하 여. 반면에 UC DGC 기술 필요한 처리 시간의 8 h UFC 메서드 약 2.5-3 h, 필요 합니다. 이 버퍼 및 시 약 준비 시간을 포함 하지 않았다. 그것은 긴 원심 기간 동안 다른 작업을 수행할 수는 주목 한다. 그럼에도 불구 하 고, 전체 절차는 거의 하루 종일 UC DGC 격리 기술에 대 한 지속.
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Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

여기, 두 세포 외 기 격리 프로토콜, 한 원심 분리 및 밀도 그라데이션 원심 분리, extracellular 소포 murine bronchoalveolar 게 액체 샘플에서 분리 된 ultracentrifugation 설명 합니다. 두 방법으로 murine bronchoalveolar 게 액체에서 파생 된 세포 외 소포는 계량 하 고 특징.

Extracellular 소포 Murine Bronchoalveolar 게 유체는 한 원심 분리 기법을 사용 하 여에서 격리

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during ...

이 방법은 초여유 원심분리 접근법을 사용하여 세포외 소포 유래 기관지포 용암체의 효율성, 회수 수율 및 순도와 관련된 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리는 직접 초원심분리 및 밀도 그라데이션 정화 기술에이 기술을 비교했다. 이 기술의 주요 장점은 머린 기관지 알포라 라베액과 같은 소량 샘플에 간단하고 효율적이며 적합하다는 것입니다.더 중요한 것은 초원심분리 방법에 비해 높은 순도와 확장성을 제공한다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구 동료 인 노먼 개렛 III (Norman Garrett III)가 될 것입니다. 시작하려면 안락사 된 마우스의 기관에 22 게이지 협경화를 삽입하십시오.인슐린 주사기를 얼음 냉멸 균 DPBS 1 밀리리터로 부착하고 두 폐에 1 밀리리터를 주입합니다. 기관지알포라 라베액 또는 BAL 유체를 회수하기 위해 주사기 플런저를 천천히 철회합니다. 그리고 BAL 유체를 얼음의 원물 튜브에 분배합니다.그 후, 25마리의 마우스에서 BAL 액을 끌어내어 두 개의 동일한 세트로 나눕니다. 발 유체를 섭씨 4도에서 5분간 400배 G로 원심분리합니다. 10 분 동안 섭씨 4도에서 15, 000 배 G에서 상체및 원심 분리기를 수집합니다.그런 다음 상체를 수집하고 즉시 EV 격리 단계로 진행합니다. 먼저 0.2 마이크로미터 멸균 주사기 필터를 통해 슈퍼 나탄을 필터링합니다. 그 후, 10 분 동안 멸균 DPBS와 원심 필터 장치를 평형.그런 다음 원심 유닛을 섭씨 4도에서 10분 동안 15, 000배 G에서 원심 장치를 원심분리합니다. 15 밀리리터의 BAL 유체로 필터를 채웁니다. 그리고 원심 분리는 섭씨 4도에서 30 분 동안 3, 000 G의 3, 000 G에서 분리됩니다.그 후, 반복적으로 부드럽게 파이펫을 하여 멸균 DPBS의 14 밀리리터로 보용을 씻으십시오. 3, 000 G의 필터 유닛을 섭씨 4도에서 30분 동안 원심분리하여 DPBS를 제거하고 보기를 농축합니다. 농축 BAL 유체 유래 EV를 수집하려면, 필터 장치의 바닥에 피프터를 삽입하고, 측면 스위핑 모션을 사용하여 샘플을 철회한다.그런 다음 BAL 유체파생 EV를 알리쿼트와 섭씨 영하 80도에 저장합니다. 또는, 초원심분리기 튜브에 이전 이전하여 시작합니다. 그리고 원심 분리는 섭씨 4도에서 30 분 동안 10, 000 G의.그런 다음 상체와 원심 분리기를 수집합니다. 상체를 폐기하고 DPBS의 200 마이크로 리터에서 EV 펠릿을 다시 중단하십시오. 그 후 EV 서스펜션을 50%의 iodixanol 작동 솔루션300 마이크로리터와 혼합합니다.그리고 15 밀리리터 초원심분리기 튜브로 옮김합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 따라 버퍼 솔루션을 추가하여 부력 밀도 그라데이션을 만들고 원심분리기를 100, 000 G에서 3시간 50분 동안 만듭니다. 15%와 25%의 iodixanol 분획을 수집하고 DPBS에서 희석하여 최대 15밀리리터의 부피를 가져옵니다.분획을 새로운 초원심분리기 튜브와 원심분리기100, 000 G의 섭씨 4도에서 60분간 전송합니다. 상체를 버리고 멸균 DPBS의 50 마이크로 리터에서 EV 펠릿을 다시 중단하십시오. 나노 입자 추적 분석을 시작하려면 EV 샘플을 DPBS의 1 밀리리터로 희석하십시오.그리고 인슐린 주사기에 샘플을로드합니다. 그 후 주사기 펌프에 주사기를 부착하고 파티클 수와 크기를 측정합니다. 카메라 레벨을 14로 설정하고 감지 임계값을 하나로 설정합니다.다음으로, 플레이트 판독기를 사용하여 색탐지를 통해 EV 샘플의 단백질 양을 정량화한다. 블로팅 로딩 버퍼 및 DTT를 사용하여 각 샘플에서 동일한 양의 EV 단백질을 용해합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 70도에서 10분 동안 가열합니다.샘플을 비스 트리스 플러스 아크릴아미드 젤에 적재하고 전기 전도를 35분 동안 실행합니다. 그런 다음 건조 전달 방법을 사용하여 니트로 셀룰로오스 막으로 단백질을 전달합니다. 그 후, 부드러운 흔들림으로 60 분 동안 5 % 탈지 우유로 멤브레인을 차단하십시오.밤새 부드러운 흔들림과 함께 섭씨 4도에서 EV 표면 단백질 마커에 항체로 멤브레인을 배양하십시오. 실온에서 60분 동안 HRP 링크 항체로 멤브레인을 배양하여 멤브레인을 개발한다. TBST 버퍼로 멤브레인을 3번 세척합니다.마지막으로, 화상 진찰을 진행하기 전에 화학 발광 HRP 항체 검출 시약으로 막을 개발하십시오. 유동 세포측정을 시작하려면 BAL 유체 파생 EV를 PEB 염색 버퍼 49마이크로리터로 희석합니다. 그런 다음 각 샘플에 3개의 항체를 추가하고, 어둠 속에서 60분 동안 흔들면서 섭씨 4도에서 샘플을 배양합니다.마지막으로, 40 마이크로리터의 멤브레인 여과 PEB 염색 버퍼로 샘플을 희석시키고 유동 세포 측정 분석을 수행합니다. 이 프로토콜에서 EV는 UFC 및 UC-DGC 방법을 사용하여 마우스 BAL 유체로부터 분리되었습니다. BAL 유체 파생 EV는 UFC 방법에 의해 분리된 일반 마우스로부터 UC-DGC-EV보다 더 작은 크기와 균일한 크기 분포를 나타냈다.UFC 기술은 또한 UC-DGC 기술에 비해 훨씬 더 높은 총 입자 수를 가지고 있었다. UFC-EV의 밀리그램으로 측정된 총 단백질 회수도 UC-DGC-EV의 단백질 회복보다 높았으며, 이는 UFC 기술이 더 많은 시간과 노력 효율적이라는 것을 나타냅니다. 마지막으로, BAL 유체 유래 EV는 또한 유동 세포측정을 통해 더욱 특징지어졌다.UFC-EV와 UC-DGC-EV는 모두 CD63, CD9, CD81을 표현했다. 이 절차를 시도하는 동안 DPBS로 초여과 장치 멤브레인을 수화하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 멤브레인이 수화되면 장치가 사용될 때까지 항상 젖어 있어야 합니다.필터 장치에서 세포 외 소포 를 회수하는 것은 어려울 수 있습니다. 파이펫 팁이 필터 장치에서 EV의 대부분을 복구하기 위해 좌우로 스윕되어 있는지 확인합니다. 개발 후, 이 기술은 작은 동물의 정상 또는 병리학 적 조건에서 세포외 소포 유래 기관지 정맥포 라베이지의 생물학적 기능을 탐구하기 위해 세포 외 소포 격리 분야의 연구자들에게 길을 열었습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

쥐과 신생아에서 보존 면역 표현형과 기능으로 두피 소교 세포의 분리

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

연구

면역학 및 감염병학

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

마우스의 호스트 면역 반응을 평가하기 위해 구인두 기관 내 PAMP 관리 및 폐포의 활용

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

쥐과 림프절 기질 세포의 분리

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

분리 및 설치류 골수의 정맥 주사 유래 단핵구

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

산모 - 태아 인터페이스에서 쥐의 조직에서 백혈구의 분리

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

분리 및 쥐 림프구의 활성화

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

비리의 항원 스펙트럼과 세포 외 소포를 분석하는 Virometry 흐름

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

쥐 폐의 기관지 폐포 세척은 염증성 세포의 침윤을 분석하는

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

절연 및 Extracellular 소포 특성 성인 Schistosoma 나무 에서

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment