Name: isolation of extracellular vesicles from murine bronchoalveolar lavage fluid using an ultrafiltration centrifugation technique
Uploaded: 2018-11-09T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique at JoVE.com

Arbeidet er støttet av NHLBI/NIH tilskudd HL103868 (for PC) og HL137076 (for PC), American Heart Association Grant-in-Aid (for PC) og Samuel Oschin omfattende Cancer Institute (SOCCI) lunge kreft forskning prisen (for PC). Vi ønsker å uttrykke vår stor takknemlighet til Smidt Heart Institute ved Cedars-Sinai Medical Center som gir oss en Nanosight maskin for EV hydrogenion sporing analyse.

Utnyttelsen av dyr og alle dyr prosedyrer ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteer (IACUC) på Cedars-Sinai Medical Center (CSMC).
1. murine Bronchoalveolar Lavage væske (BALF) innsamling og forberedelse
<ol><li>BALF samling<ol>
<li>Euthanize mus med en cocktail av ketamin (300 mg/kg) og xylazine (30 mg/kg) via intraperitoneal-ruten etterfulgt av cervical forvridning.</li>
		<li>Sett inn en 22 G angiocatheter i luftrøret. Knytt en insulinsprøyte som inneholder 1 mL (mL...

<ol>
	<li>Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+composition,+biogenesis+and+function.">Exosomes: composition, biogenesis and function.</a> Nature Reviews Immunology. 2, 569-579 (2002).</li><li>Kosaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+Mechanisms+and+Intercellular+Transfer+of+MicroRNAs+in+Living+Cells.">Secretory Mechanisms and Intercellular Transfer of MicroRNAs in Living Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17442-17452 (2010).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Fujita, Y., Kosaka, N., Araya, J., Kuwano, K., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+lung+microenvironment+and+pathogenesis.">Extracellular vesicles in lung microenvironment and pathogenesis.</a> Trends in Molecular Medicine. 21 (9), 533-542 (2015).</li><li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+function+of+exosomes+in+cancer.">The biology and function of exosomes in cancer.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).</li><li>Janowska-Wieczorek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+derived+from+activated+platelets+induce+metastasis+and+angiogenesis+in+lung+cancer.">Microvesicles derived from activated platelets induce metastasis and angiogenesis in lung cancer.</a> International Journal of Cancer. 113 (5), 752-760 (2005).</li><li>Valadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells.">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).</li><li>Colombo, M., Raposo, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis,+Secretion,+and+Intercellular+Interactions+of+Exosomes+and+Other+Extracellular+Vesicles.">Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 255-289 (2014).</li><li>Rocco, G. D., Baldari, S., Toietta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+other+extracellular+vesicles-mediated+microRNA+delivery+for+cancer+therapy.">Exosomes and other extracellular vesicles-mediated microRNA delivery for cancer therapy.</a> Translational Cancer Research. 6 (Supplement 8), S1321-S1330 (2017).</li><li>Peterson, M. F., Otoc, N., Sethi, J. K., Gupta, A., Antes, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+systems+for+exosome+investigation.">Integrated systems for exosome investigation.</a> Methods. 87 (1), 31-45 (2015).</li><li>Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+isolation+and+characterization:+toward+clinical+application.">Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application.</a> Journal of Clinical Investigation. 126, 1152-1162 (2016).</li><li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles:+results+of+a+worldwide+survey.">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945 (2016).</li><li>Inglis, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+to+improve+detection+and+analysis+of+extracellular+vesicles+using+flow+cytometry.">Techniques to improve detection and analysis of extracellular vesicles using flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 87 (11), 1052-1063 (2015).</li><li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+Exosome+Isolation+Techniques.">Progress in Exosome Isolation Techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li><li>Willis, G. R., Kourembanas, S., Mitsialis, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+Exosome-Based+Therapeutics:+Isolation,+Heterogeneity,+and+Fit-for-Purpose+Potency.">Toward Exosome-Based Therapeutics: Isolation, Heterogeneity, and Fit-for-Purpose Potency.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 20389 (2017).</li><li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 27031 (2015).</li><li>Benedikter, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafiltration+combined+with+size+exclusion+chromatography+efficiently+isolates+extracellular+vesicles+from+cell+culture+media+for+compositional+and+functional+studies.">Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies.</a> Scientific Reports. 7 (1), 15297 (2017).</li><li>Vergauwen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confounding+factors+of+ultrafiltration+and+protein+analysis+in+extracellular+vesicle+research.">Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2704 (2017).</li><li>Kesimer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+exosome-like+vesicles+released+from+human+tracheobronchial+ciliated+epithelium:+a+possible+role+in+innate+defense.">Characterization of exosome-like vesicles released from human tracheobronchial ciliated epithelium: a possible role in innate defense.</a> The FASEB Journal. 23 (6), 1858-1868 (2009).</li><li>Torregrosa Paredes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoalveolar+lavage+fluid+exosomes+contribute+to+cytokine+and+leukotriene+production+in+allergic+asthma.">Bronchoalveolar lavage fluid exosomes contribute to cytokine and leukotriene production in allergic asthma.</a> Allergy. 67 (7), 911-919 (2012).</li><li>Alipoor, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+Exosomal+miRNA+in+Respiratory+Diseases.">Exosomes and Exosomal miRNA in Respiratory Diseases.</a> Mediators of Inflammation. 2016, 5628404 (2016).</li><li>Hough, K. P., Chanda, D., Duncan, S. R., Thannickal, V. J., Deshane, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+Immunoregulation+of+Chronic+Lung+Diseases.">Exosomes in Immunoregulation of Chronic Lung Diseases.</a> Allergy. 72 (4), 534-544 (2017).</li><li>Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoalveolar+Lavage+of+Murine+Lungs+to+Analyze+Inflammatory+Cell+Infiltration.">Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).</li><li>Minciacchi, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MYC+Mediates+Large+Oncosome-Induced+Fibroblast+Reprogramming+in+Prostate+Cancer.">MYC Mediates Large Oncosome-Induced Fibroblast Reprogramming in Prostate Cancer.</a> Cancer Research. 77 (9), 2306-2317 (2017).</li><li>Koliha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+Affects+the+Composition+of+Blood+Cell-Derived+Extracellular+Vesicles.">Melanoma Affects the Composition of Blood Cell-Derived Extracellular Vesicles.</a> Frontiers in Immunology. 7, 581 (2016).</li><li>Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses.">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).</li><li>Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes/microvesicles+as+a+mechanism+of+cell-to-cell+communication.">Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication.</a> Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).</li><li>Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+microvesicles:+extracellular+vesicles+for+genetic+information+transfer+and+gene+therapy.">Exosomes and microvesicles: extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy.</a> Human Molecular Genetics. 21, R125-R134 (2012).</li><li>Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Guti&#233;rrez-V&#225;zquez, C., S&#225;nchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+it+out:+Regulation+of+exosome+loading.">Sorting it out: Regulation of exosome loading.</a> Seminars in Cancer Biology. 28, 3-13 (2014).</li><li>Hoshino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+exosome+integrins+determine+organotropic+metastasis.">Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis.</a> Nature. 527, 329-335 (2015).</li><li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Exosome+Total+Isolation+Chip.">The Exosome Total Isolation Chip.</a> ACS Nano. 11 (11), 10712-10723 (2017).</li><li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator.">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).</li><li>Zhao, Z., Yang, Y., Zeng, Y., He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Microfluidic+ExoSearch+Chip+for+Multiplexed+Exosome+Detection+Towards+Blood-based+Ovarian+Cancer+Diagnosis.">A Microfluidic ExoSearch Chip for Multiplexed Exosome Detection Towards Blood-based Ovarian Cancer Diagnosis.</a> Lab on a Chip. 16 (3), 489-496 (2016).</li><li>Fang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+application+of+a+microfluidic+chip+for+immunocapture+and+quantification+of+circulating+exosomes+to+assist+breast+cancer+diagnosis+and+molecular+classification.">Clinical application of a microfluidic chip for immunocapture and quantification of circulating exosomes to assist breast cancer diagnosis and molecular classification.</a> PloS ONE. 12 (4), e0175050 (2017).</li><li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator.">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> American Journal Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).</li><li>Kornilov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+ultrafiltration-based+protocol+to+deplete+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum.">Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).</li><li>Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+protein,+microRNA,+and+mRNA+yields+using+different+methods+of+urinary+exosome+isolation+for+the+discovery+of+kidney+disease+biomarkers.">Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers.</a> Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).</li><li>Bosch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+prevents+aggregation+of+exosomes+and+cryodamage.">Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage.</a> Scientific Reports. 6 (1), 329 (2016).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+progenitor+cell-derived+exosomes+prevent+cardiomyocytes+apoptosis+through+exosomal+miR-21+by+targeting+PDCD4.">Cardiac progenitor cell-derived exosomes prevent cardiomyocytes apoptosis through exosomal miR-21 by targeting PDCD4.</a> Cell Death &amp; Disease. 7 (6), e2277 (2016).</li><li>Agarwal, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental,+Systems+and+Computational+Approaches+to+Understanding+the+MicroRNA-Mediated+Reparative+Potential+of+Cardiac+Progenitor+Cell-Derived+Exosomes+From+Pediatric+Patients.">Experimental, Systems and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients.</a> Circulation Research. 120 (4), 701-712 (2017).</li><li>Merchant, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfiltration+isolation+of+human+urinary+exosomes+for+characterization+by+MS.">Microfiltration isolation of human urinary exosomes for characterization by MS.</a> PROTEOMICS - Clinical Applications. 4 (1), 84-96 (2010).</li><li>Gouin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+method+for+identification+of+suitable+reference+genes+in+extracellular+vesicles.">A comprehensive method for identification of suitable reference genes in extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1347019 (2017).</li><li>Betsuyaku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Granule+Proteins+in+Bronchoalveolar+Lavage+Fluid+from+Subjects+with+Subclinical+Emphysema.">Neutrophil Granule Proteins in Bronchoalveolar Lavage Fluid from Subjects with Subclinical Emphysema.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159 (6), 1985-1991 (1999).</li></ol>

I de siste tiårene, har forskere unraveled betydninger av EVs i mobilnettet homeostase. Enda viktigere, spille EVs viktige roller i mange sykdom prosesser ved modulerende nærliggende og fjerne celler gjennom deres bioaktive Last molekyler1,21,22,26,27 , 28 , 29 , <sup class="xre...

Exosomes er den minste undergruppe av EVs, 50-200 nm i diameter, og har flere biologisk funksjoner på tvers av et variert utvalg av signalering prosesser,1,,2,,3,,4,,5. De styrer cellular og vev homeostase av lette intercellulære kommunikasjon gjennom Last molekyler som lipider, proteiner og nukleinsyrer6,7,8,9 . En kritisk trinn i EV forskning er en isolert prosess. Differensial ultracentrifugation (UC), med eller uten tetthet gradert sentrifugering (DGC), anses gullstandarden tilnærming, men denne metoden har store begrensninger, inkludert ineffektiv EV utvinningsgraden og lav skalerbarhet10 , 11 , 12, som begrenser dens beste utnyttelse til større volum utvalgene, for eksempel celle kultur supernatant eller høy exosome produksjon prøver. Fordeler og ulemper med andre metoder, som størrelse utelukkelse av ultrafiltrasjon eller Ture, immunoaffinity isolasjon av perler eller kolonner og microfluidics, er godt beskrevet og moderne supplerende prosedyrer har blitt utviklet til overvinne og minimere tekniske begrensninger i hver tilnærming11,12,13,14,15. Andre har vist at en ultrafiltrasjon sentrifugering (UFC) med en nanoporous membran i filter enheten er en alternativ teknikk som gir sammenlignbare renhet til en UC metoden16,17,18. Denne teknikken kan betraktes som én av metodene alternativ isolasjon.
Bronchoalveolar lavage væske (BALF) inneholder EVs som har mange biologiske funksjoner i ulike åndedrettsproblemer19,20,21,22. Studere BALF-avledet EVs innebærer noen utfordringer på grunn av invasiveness av bronkoskopi prosedyren mennesker, samt et begrenset antall lavage væske utvinning. I lite laboratorium dyr som mus, bare noen få ml kan gjenopprettes i normal tette forhold, selv mindre betent eller fibrotiske lungene23. Følgelig kan samle en tilstrekkelig mengde BALF EV isolering av en differensiell ultracentrifugation for nedstrøms programmer ikke være gjennomførbart. Men er isolere riktig EV populasjoner en avgjørende faktor for å studere EV biologiske funksjoner. Den skjøre balansen mellom effektivitet og effekt fortsetter å være en utfordring i veletablerte EV isolasjon metoder.
I denne nåværende studien viser vi at en sentrifugal ultrafiltrasjon tilnærming, utnytte en 100 kDa molekylvekt cut-off (MWCO) nanomembrane filter enhet, er egnet for små volumer biologiske prøven som BALF. Denne teknikken er enkel og effektiv, og gir høy renhetsgrad og skalerbarhet støtte studiet av BALF-avledet EVs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 centrifugal filters Ultracel-100K</td>
			<td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Corning Cellgro, Manassas, VA</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td>
			<td>EMD8550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Research Products International, Prospect, IL</td>
			<td>75277-39-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Corning Cellgro, Manassas, VA</td>
			<td>46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td>
			<td>S3014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep</td>
			<td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td>
			<td>MKCD9753</td>
			<td>Density Gradient Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>VetOne, Boise, ID</td>
			<td>13985-702-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Akorn Animal Health, Lake Forest, IL</td>
			<td>59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td>BD Syringe, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>309656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angiocatheter 20G</td>
			<td>BD Syringe, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>381703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes 15 mL</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes 50 mL</td>
			<td>Corning Cellgro, Manassas, VA</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicinchonic acid (BCA) protein assay</td>
			<td>Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse TSG101 Antibody</td>
			<td>AbCam, Cambridge, MA</td>
			<td>AB125011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse PE-CD63 Antibody</td>
			<td>Biolegend, San Diego, CA</td>
			<td>143904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Danvers, MA</td>
			<td>7074S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x LDS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Reducing agent (Bolt)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Lysis buffer (Bolt)</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Danvers, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolt 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>NW04120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Nitrocellulose mini stacks</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>IB23002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescent HRP antibody detection reagent HyGLO</td>
			<td>Denville Scientific, Holliston, MA</td>
			<td>E2400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes 17 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, Pasadena, CA</td>
			<td>337986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes 38.5 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, Pasadena, CA</td>
			<td>326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning SFCA Syringe Filters 0.2 &#181;m pore</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>09-754-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter, Pasadena, CA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight (NS300)</td>
			<td>Malvern, Worcestershire, UK</td>
			<td>-</td>
			<td>To measure particle size distribution and particle concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQuant Analyzer 10 flow cytometer</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot Transfer Apparatus</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System</td>
			<td>Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v. 10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of extracellular vesicles from murine bronchoalveolar lavage fluid using an ultrafiltration centrifugation technique

Ekstracellulære blemmer (EVs) er nyoppdagede subcellular komponenter som spiller viktige roller i mange biologiske signalering funksjoner under fysiologiske og patologiske tilstander. Isolasjon av EVs fortsetter å være en stor utfordring i dette feltet på grunn av begrensninger iboende til hver teknikk. Differensial ultracentrifugation tetthet gradert sentrifugering metode er en brukte tilnærming og anses å være gullstandarden prosedyren for EV isolasjon. Men denne prosedyren er tidkrevende, arbeidskrevende, og vanligvis resulterer i lav skalerbarhet, som ikke kanskje er egnet for små volumer prøver som bronchoalveolar lavage væske. Vi viser at en ultrafiltrasjon sentrifugering isolasjon metoden er enkel og tid - og arbeidskrevende effektiv ennå gir en høy grad av utvinning avkastning og renhet. Vi foreslår at denne isolasjon metoden kan være en alternativ tilnærming som passer for EV isolasjon, spesielt for små volumer biologiske prøver.

Vi utførte EV isolert fra mus BALF bruke UFC og UC-DGC isolasjon på samme dag. Metoden UFC kreves ca 2,5-3 h, mens UC-DGC teknikken nødvendig 8t behandling tid. Dette inkluderte ikke buffere og reagens Forberedelsestid. Det bør bemerkes at noen andre oppgaver kan utføres i lang sentrifugering perioder. Likevel varte hele framgangsmåten nesten en hel dag for UC-DGC isolasjon teknikken.
BALF-avledet EVs fra normal mus isoler...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique at JoVE.com

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

Her beskriver vi to ekstracellulære vesicle isolasjon protokoller, ultrafiltrasjon sentrifugering og ultracentrifugation med tetthet gradert sentrifugering, isolere ekstracellulære blemmer fra murine bronchoalveolar lavage prøver. De ekstracellulære blemmer avledet fra murine bronchoalveolar lavage væske av begge metodene er kvantifisert og preget.

Isolering av ekstracellulære blemmer fra Murine Bronchoalveolar Lavage – bruk en ultrafiltrasjon sentrifugering teknikk

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during ...

Denne metoden kan bidra til å løse spørsmål knyttet til effektivitet, utvinning utbytte, og renhet av bronkoalveolar lavage væske avledet ekstracellulære vesikler ved hjelp av en ultrafiltrering sentrifugering tilnærming. Vi sammenlignet denne teknikken direkte med en ultracentrifugation og tetthet gradient rensing teknikk. Den største fordelen med denne teknikken er at den er enkel, effektiv og egnet for små volumprøver som murine bronkosalveolrskyllingsvæske.Enda viktigere er det høy renhet og betydelig høyere skalerbarhet sammenlignet med en ultracentrifugation isolasjonsmetode. Å demonstrere prosedyren vil være Mr. Norman Garrett III, forskningsmedarbeider for laboratoriet mitt. For å begynne, sett inn en 22 gauge angiocatheter i luftrøret til en eutanisert mus.Fest en insulinsprøyte med en milliliter iskald steril DPBS, og innpod en milliliter i begge lungene. Trekk forsiktig sprøytestempelet for å hente bronkoalveollærskyllingsvæske, eller BAL-væske. Og dispenser BAL-væsken inn i et konisk rør på is.Etter dette trekker du BAL væske fra 25 mus og deler den i to like sett. Sentrifuger BAL-væsken ved 400 ganger G i fem minutter ved fire grader celsius. Samle supernatant og sentrifuge det på 15.000 ganger G ved fire grader celsius i 10 minutter.Deretter samler du supernatanten og går videre til EV-isolasjonstrinnene umiddelbart. Først må du filtrere super natanten gjennom et 0,2 mikrometer sterilt sprøytefilter. Etter dette, likevekt sentrifugal filterenheten med sterile DPBS i 10 minutter.Sentrifuger deretter sentrifugalenheten ved 15.000 ganger G i 10 minutter ved fire grader celsius. Fyll filteret med 15 milliliter BAL-væske. Og sentrifuge det på 3000 G's for 30 minutter på fire grader celsius.Etter dette, vask retentate med 14 milliliter sterile DPBS ved forsiktig pipettering gjentatte ganger. Sentrifuger filterenheten ved 3000 G ved fire grader celsius i 30 minutter for å fjerne DPBS og konsentrere retentatet. For å samle den konsentrerte BAL-væsken avledet EV-er, sett inn en pipetter i bunnen av filterenheten, og trekk ut prøven ved hjelp av en side til side feiende bevegelse.Deretter aliquot BAL væsken avledet EV og lagre dem på minus 80 grader celsius. Alternativt kan du starte med å overføre den tidligere ervervede supernatant til en ultracentrifuge tube. Og sentrifuge det på 10,000 G's for 30 minutter på fire grader celsius.Samle deretter overnaturant og sentrifuge. Kast supernatant og re-suspendere EV pellet i 200 mikroliter av DPBS. Etter dette blander du EV-suspensjonen med 300 mikroliter på 50 % iodiksanolarbeidsløsning.Og overføre den til en 15 milliliter ultracentrifuge tube. Legg deretter til bufferløsning i henhold til tekstprotokollen for å opprette en spenstig tetthetsgradient, og sentrifuge den på 100, 000 G i tre timer og 50 minutter. Samle 15%og 25% iodixanol fraksjoner, og fortynne dem i DPBS for å bringe volumet opp til 15 milliliter.Overfør fraksjonene til et nytt ultracentrifugerør og sentrifuge ved 100,000 G's ved fire grader celsius i 60 minutter. Kast supernatant og re-suspendere EV pellets i 50 mikroliter sterile DPBS. For å starte nanopartikkelsporingsanalyse, fortynne EV-prøven i en milliliter DPBS.Og legg prøven i en insulinsprøyte. Deretter fester du sprøyten til en sprøytepumpe og måler partikkelnumrene og størrelsen. Sett kameranivået til 14 og registreringsterskelen til ett.Deretter bruker du en plateleser til å kvantifisere mengden protein i EV-prøven via kolorimetrisk deteksjon. Oppløs en lik mengde EV-protein fra hver prøve med en blotting lastbuffer og DTT. Varm deretter prøvene ved 70 grader celsius i 10 minutter.Last prøvene i en Bis-Tris Plus akrylamidgel og kjør elektroforese i 35 minutter. Overfør deretter proteinene til en nitrocellulosemembran ved hjelp av en tørr overføringsmetode. Etter dette, blokkere membranen med fem prosent skummet melk i 60 minutter med mild gynge.Inkuber membranen med et antistoff til en EV overflateproteinmarkør ved fire grader celsius med mild gynge over natten. Utvikle membranen ved å inkubere membranen med HRP-koblingsantistoff i 60 minutter ved romtemperatur. Vask membranen i 10 minutter med TBST-buffer tre ganger.Til slutt, utvikle membranen med chemiluminescent HRP antistoff deteksjon reagens før du går videre til bildebehandling. For å starte strømningscytometri, fortynne BAL væske avledet EV's i 49 mikroliter peb farging buffer. Deretter legger du til tre antistoffer i hver av prøvene, før du inkuberer prøvene ved fire grader celsius med gynge i 60 minutter i mørket.Til slutt fortynne prøvene med 40 mikroliter membran filtrert PEB farging buffer og utføre flyt cytometri analyse. I denne protokollen ble EV-er isolert fra mus BAL væske ved hjelp av en UFC og UC-DGC metoder. BAL væske avledet EV-er fra normale mus isolert av UFC-metoden viste mindre størrelser og mer ensartet størrelsesfordeling enn UC-DGC-EV-er.UFC-teknikken hadde også betydelig høyere totale partikkeltall sammenlignet med UC-DGC-teknikken. Den totale proteinutvinningen målt i milligram av UFC-EV-ene var også høyere enn for UC-DGC-EV-ene, noe som indikerer at UFC-teknikken er mer tid og krefter effektiv. Til slutt ble BAL-væsken avledet EV-er også ytterligere karakterisert via strømningscytometri.UFC-EV-ene og UC-DGC-EV's uttrykte både CD63, CD9 og CD81. Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske å rehydrere ultrafiltrasjonsenhetmembranen med DPBS. Når membranen er hydrert, må enheten holdes våt til enhver tid til den brukes.Det kan være utfordrende å hente ekstracellulær vesikkel fra filterenheten. Pass på at pipettespissen er feid fra side til side for å gjenopprette de fleste av ev-ene fra filterenheten. Etter utviklingen banet denne teknikken vei for forskere innen ekstracellulær vesikkelisolering for å utforske de biologiske funksjonene til bronkoalveolarskylling avledet ekstracellulære vesikler i både normale eller patologiske forhold hos små dyr.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

Isolering av Cortical Microglia med Bevarte Immunfenotype og funksjonalitet fra Murine Nyfødte

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

Utnyttelsen av orofaryngeal røret PAMP Administrasjon og Bronchoalveolar Lavage å evaluere vertens immunrespons i Mus

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Isolering av Murint Lymph Node stromale celler

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Isolasjon og intravenøs injeksjon av murine Bone Marrow Avledet Monocytter

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Isolering av leukocyttene fra Murine Vev på Maternal Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

Isolering og aktivering av lymfocytter Murine

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Flow Virometry å analysere Antigen Spectra av Virioner og ekstracellulære vesikler

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Bronchoalveolar Lavage av Murine Lunger å analysere inflammatorisk celleinfiltrasjon

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolering og karakterisering av ekstracellulære blemmer fra voksen Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment