Name: isolation of extracellular vesicles from murine bronchoalveolar lavage fluid using an ultrafiltration centrifugation technique
Uploaded: 2018-11-09T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique at JoVE.com

Arbetet stöds av NHLBI/NIH bidragen HL103868 (till PC) och HL137076 (för PC), den amerikanska hjärtat föreningen bidrag (till PC) och Samuel Oschin omfattande Cancer Institute (SOCCI) Lung Cancer Research Award (för PC). Vi vill uttrycka vår stora uppskattning till Smidt hjärtat institutet vid Cedars-Sinai Medical Center som ger oss en Nanosight maskin för EV nanopartiklar spårning analys.

Utnyttjande av djur och alla djur förfaranden godkändes av institutionella djur vård och användning kommittéer (IACUC) på Cedars-Sinai Medical Center (CSMC).
1. murina bronkoalveolär Lavage vätska (BALF) insamling och förberedelse
<ol><li>BALF samling<ol>
<li>Euthanize möss med en cocktail av ketamin (300 mg/kg) och xylazin (30 mg/kg) via den intraperitoneala vägen följt av cervikal dislokation.</li>
		<li>Infoga en 22 G angiocatheter i luftstrupen. Bifoga en insulinspruta inneh?...

<ol>
	<li>Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+composition,+biogenesis+and+function.">Exosomes: composition, biogenesis and function.</a> Nature Reviews Immunology. 2, 569-579 (2002).</li><li>Kosaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+Mechanisms+and+Intercellular+Transfer+of+MicroRNAs+in+Living+Cells.">Secretory Mechanisms and Intercellular Transfer of MicroRNAs in Living Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17442-17452 (2010).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Fujita, Y., Kosaka, N., Araya, J., Kuwano, K., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+lung+microenvironment+and+pathogenesis.">Extracellular vesicles in lung microenvironment and pathogenesis.</a> Trends in Molecular Medicine. 21 (9), 533-542 (2015).</li><li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+function+of+exosomes+in+cancer.">The biology and function of exosomes in cancer.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).</li><li>Janowska-Wieczorek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+derived+from+activated+platelets+induce+metastasis+and+angiogenesis+in+lung+cancer.">Microvesicles derived from activated platelets induce metastasis and angiogenesis in lung cancer.</a> International Journal of Cancer. 113 (5), 752-760 (2005).</li><li>Valadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells.">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).</li><li>Colombo, M., Raposo, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis,+Secretion,+and+Intercellular+Interactions+of+Exosomes+and+Other+Extracellular+Vesicles.">Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 255-289 (2014).</li><li>Rocco, G. D., Baldari, S., Toietta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+other+extracellular+vesicles-mediated+microRNA+delivery+for+cancer+therapy.">Exosomes and other extracellular vesicles-mediated microRNA delivery for cancer therapy.</a> Translational Cancer Research. 6 (Supplement 8), S1321-S1330 (2017).</li><li>Peterson, M. F., Otoc, N., Sethi, J. K., Gupta, A., Antes, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+systems+for+exosome+investigation.">Integrated systems for exosome investigation.</a> Methods. 87 (1), 31-45 (2015).</li><li>Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+isolation+and+characterization:+toward+clinical+application.">Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application.</a> Journal of Clinical Investigation. 126, 1152-1162 (2016).</li><li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles:+results+of+a+worldwide+survey.">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945 (2016).</li><li>Inglis, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+to+improve+detection+and+analysis+of+extracellular+vesicles+using+flow+cytometry.">Techniques to improve detection and analysis of extracellular vesicles using flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 87 (11), 1052-1063 (2015).</li><li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+Exosome+Isolation+Techniques.">Progress in Exosome Isolation Techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li><li>Willis, G. R., Kourembanas, S., Mitsialis, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+Exosome-Based+Therapeutics:+Isolation,+Heterogeneity,+and+Fit-for-Purpose+Potency.">Toward Exosome-Based Therapeutics: Isolation, Heterogeneity, and Fit-for-Purpose Potency.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 20389 (2017).</li><li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 27031 (2015).</li><li>Benedikter, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafiltration+combined+with+size+exclusion+chromatography+efficiently+isolates+extracellular+vesicles+from+cell+culture+media+for+compositional+and+functional+studies.">Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies.</a> Scientific Reports. 7 (1), 15297 (2017).</li><li>Vergauwen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confounding+factors+of+ultrafiltration+and+protein+analysis+in+extracellular+vesicle+research.">Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2704 (2017).</li><li>Kesimer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+exosome-like+vesicles+released+from+human+tracheobronchial+ciliated+epithelium:+a+possible+role+in+innate+defense.">Characterization of exosome-like vesicles released from human tracheobronchial ciliated epithelium: a possible role in innate defense.</a> The FASEB Journal. 23 (6), 1858-1868 (2009).</li><li>Torregrosa Paredes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoalveolar+lavage+fluid+exosomes+contribute+to+cytokine+and+leukotriene+production+in+allergic+asthma.">Bronchoalveolar lavage fluid exosomes contribute to cytokine and leukotriene production in allergic asthma.</a> Allergy. 67 (7), 911-919 (2012).</li><li>Alipoor, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+Exosomal+miRNA+in+Respiratory+Diseases.">Exosomes and Exosomal miRNA in Respiratory Diseases.</a> Mediators of Inflammation. 2016, 5628404 (2016).</li><li>Hough, K. P., Chanda, D., Duncan, S. R., Thannickal, V. J., Deshane, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+Immunoregulation+of+Chronic+Lung+Diseases.">Exosomes in Immunoregulation of Chronic Lung Diseases.</a> Allergy. 72 (4), 534-544 (2017).</li><li>Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoalveolar+Lavage+of+Murine+Lungs+to+Analyze+Inflammatory+Cell+Infiltration.">Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).</li><li>Minciacchi, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MYC+Mediates+Large+Oncosome-Induced+Fibroblast+Reprogramming+in+Prostate+Cancer.">MYC Mediates Large Oncosome-Induced Fibroblast Reprogramming in Prostate Cancer.</a> Cancer Research. 77 (9), 2306-2317 (2017).</li><li>Koliha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+Affects+the+Composition+of+Blood+Cell-Derived+Extracellular+Vesicles.">Melanoma Affects the Composition of Blood Cell-Derived Extracellular Vesicles.</a> Frontiers in Immunology. 7, 581 (2016).</li><li>Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses.">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).</li><li>Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes/microvesicles+as+a+mechanism+of+cell-to-cell+communication.">Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication.</a> Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).</li><li>Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+microvesicles:+extracellular+vesicles+for+genetic+information+transfer+and+gene+therapy.">Exosomes and microvesicles: extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy.</a> Human Molecular Genetics. 21, R125-R134 (2012).</li><li>Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Guti&#233;rrez-V&#225;zquez, C., S&#225;nchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+it+out:+Regulation+of+exosome+loading.">Sorting it out: Regulation of exosome loading.</a> Seminars in Cancer Biology. 28, 3-13 (2014).</li><li>Hoshino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+exosome+integrins+determine+organotropic+metastasis.">Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis.</a> Nature. 527, 329-335 (2015).</li><li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Exosome+Total+Isolation+Chip.">The Exosome Total Isolation Chip.</a> ACS Nano. 11 (11), 10712-10723 (2017).</li><li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator.">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).</li><li>Zhao, Z., Yang, Y., Zeng, Y., He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Microfluidic+ExoSearch+Chip+for+Multiplexed+Exosome+Detection+Towards+Blood-based+Ovarian+Cancer+Diagnosis.">A Microfluidic ExoSearch Chip for Multiplexed Exosome Detection Towards Blood-based Ovarian Cancer Diagnosis.</a> Lab on a Chip. 16 (3), 489-496 (2016).</li><li>Fang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+application+of+a+microfluidic+chip+for+immunocapture+and+quantification+of+circulating+exosomes+to+assist+breast+cancer+diagnosis+and+molecular+classification.">Clinical application of a microfluidic chip for immunocapture and quantification of circulating exosomes to assist breast cancer diagnosis and molecular classification.</a> PloS ONE. 12 (4), e0175050 (2017).</li><li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator.">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> American Journal Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).</li><li>Kornilov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+ultrafiltration-based+protocol+to+deplete+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum.">Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).</li><li>Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+protein,+microRNA,+and+mRNA+yields+using+different+methods+of+urinary+exosome+isolation+for+the+discovery+of+kidney+disease+biomarkers.">Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers.</a> Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).</li><li>Bosch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+prevents+aggregation+of+exosomes+and+cryodamage.">Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage.</a> Scientific Reports. 6 (1), 329 (2016).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+progenitor+cell-derived+exosomes+prevent+cardiomyocytes+apoptosis+through+exosomal+miR-21+by+targeting+PDCD4.">Cardiac progenitor cell-derived exosomes prevent cardiomyocytes apoptosis through exosomal miR-21 by targeting PDCD4.</a> Cell Death &amp; Disease. 7 (6), e2277 (2016).</li><li>Agarwal, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental,+Systems+and+Computational+Approaches+to+Understanding+the+MicroRNA-Mediated+Reparative+Potential+of+Cardiac+Progenitor+Cell-Derived+Exosomes+From+Pediatric+Patients.">Experimental, Systems and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients.</a> Circulation Research. 120 (4), 701-712 (2017).</li><li>Merchant, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfiltration+isolation+of+human+urinary+exosomes+for+characterization+by+MS.">Microfiltration isolation of human urinary exosomes for characterization by MS.</a> PROTEOMICS - Clinical Applications. 4 (1), 84-96 (2010).</li><li>Gouin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+method+for+identification+of+suitable+reference+genes+in+extracellular+vesicles.">A comprehensive method for identification of suitable reference genes in extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1347019 (2017).</li><li>Betsuyaku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Granule+Proteins+in+Bronchoalveolar+Lavage+Fluid+from+Subjects+with+Subclinical+Emphysema.">Neutrophil Granule Proteins in Bronchoalveolar Lavage Fluid from Subjects with Subclinical Emphysema.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159 (6), 1985-1991 (1999).</li></ol>

I de senaste decennierna, har forskare avslöjad signifikans av EVs i cellulära homeostas. Viktigare, spelar EVs stora roller i många sjukdomsprocesser genom att modulera närliggande och avlägsna celler via deras bioaktiva Last molekyler1,21,22,26,27 , 28 , 29 , <sup class="xr...

Exosomes är den minsta delmängden av EVs, 50 – 200 nm i diameter, och har flera biologiska funktioner över en mångfald av signalering processer1,2,3,4,5. De reglerar cellulär och vävnad homeostas primärt genom att underlätta kommunikationen genom Last molekyler såsom lipider, proteiner och nukleinsyror6,7,8,9 . Ett kritiskt steg i EV forskning är isolering processen. Differentiell ultracentrifugering (UC), med eller utan täthet lutning centrifugering (DGC), anses vara den gyllene standard strategin, men denna metod bär stora begränsningar, ineffektiva EV återvinningsprocent och låg skalbarhet10 , 11 , 12, som begränsar dess bästa utnyttjande till större volym prover, såsom cell kultur supernatant eller hög exosome produktion exemplar. Fördelar och nackdelar med andra metoder, såsom storlek utslagning genom ultrafiltrering eller kromatografi, immunoaffinity isolering av pärlor eller kolumner och mikrofluidik, är väl beskrivna och moderna kompletterande procedurer har utvecklats till övervinna och minimera tekniska begränsningar i varje strategi11,12,13,14,15. Andra har visat att en ultrafiltrering centrifugering (UFC) med nanoporösa membran i Filterenheten är en alternativ teknik som ger jämförbara renhet till en UC metod16,17,18. Denna teknik kunde betraktas som en av de alternativa isoleringsmetoder.
Bronkoalveolär lavage vätska (BALF) innehåller EVs som besitter många biologiska funktioner i olika luftvägsbesvär19,20,21,22. Studera BALF-derived EVs innebär vissa utmaningar på grund av invasivitet av bronkoskopi förfarandet hos människor, liksom en begränsad mängd lavage vätska återhämtning. I små försöksdjur som möss, endast några milliliter kan återställas med normala lungsjukdomar, ännu mindre i inflammerad eller fibrotisk lungorna23. Därför kanske samla en tillräcklig mängd BALF för EV isolering av en differential ultracentrifugering för nedströms program inte genomförbart. Isolera rätt EV populationer är dock en avgörande faktor för att studera EV biologiska funktioner. Den känsliga balansen mellan effektivitet och effekt fortsätter att vara en utmaning i väletablerade EV isoleringsmetoder.
I den här aktuella studien visar vi att en centrifugal ultrafiltrering strategi, utnyttja en 100 kDa molekylvikt cut-off (MWCO) nanomembrane filterenhet, är lämplig för små volymer biologiska preparatet såsom BALF. Denna teknik är enkel, effektiv och ger hög renhet och skalbarhet att stödja studier av BALF-derived EVs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 centrifugal filters Ultracel-100K</td>
			<td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Corning Cellgro, Manassas, VA</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td>
			<td>EMD8550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Research Products International, Prospect, IL</td>
			<td>75277-39-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Corning Cellgro, Manassas, VA</td>
			<td>46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td>
			<td>S3014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep</td>
			<td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td>
			<td>MKCD9753</td>
			<td>Density Gradient Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>VetOne, Boise, ID</td>
			<td>13985-702-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Akorn Animal Health, Lake Forest, IL</td>
			<td>59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td>BD Syringe, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>309656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angiocatheter 20G</td>
			<td>BD Syringe, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>381703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes 15 mL</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes 50 mL</td>
			<td>Corning Cellgro, Manassas, VA</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicinchonic acid (BCA) protein assay</td>
			<td>Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse TSG101 Antibody</td>
			<td>AbCam, Cambridge, MA</td>
			<td>AB125011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse PE-CD63 Antibody</td>
			<td>Biolegend, San Diego, CA</td>
			<td>143904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Danvers, MA</td>
			<td>7074S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x LDS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Reducing agent (Bolt)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Lysis buffer (Bolt)</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Danvers, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolt 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>NW04120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Nitrocellulose mini stacks</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>IB23002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescent HRP antibody detection reagent HyGLO</td>
			<td>Denville Scientific, Holliston, MA</td>
			<td>E2400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes 17 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, Pasadena, CA</td>
			<td>337986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes 38.5 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, Pasadena, CA</td>
			<td>326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning SFCA Syringe Filters 0.2 &#181;m pore</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>09-754-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter, Pasadena, CA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight (NS300)</td>
			<td>Malvern, Worcestershire, UK</td>
			<td>-</td>
			<td>To measure particle size distribution and particle concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQuant Analyzer 10 flow cytometer</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot Transfer Apparatus</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System</td>
			<td>Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v. 10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of extracellular vesicles from murine bronchoalveolar lavage fluid using an ultrafiltration centrifugation technique

Extracellulära blåsor (EVs) är nyupptäckt subcellulära komponenter som spelar viktiga roller i många biologiska signalering funktioner under fysiologiska och patologiska stater. Isolering av EVs fortsätter att vara en stor utmaning i det här fältet, på grund av begränsningar för varje teknik. Den differentiella ultracentrifugering med täthet lutning centrifugering metod är en vanligt förekommande strategi och anses vara guldmyntfot förfarandet för EV isolering. Proceduren är tidskrävande, arbetsintensiva, vilket resulterar i låg skalbarhet, vilket inte kanske är lämplig för små volymer prover såsom bronkoalveolär lavage vätska. Vi visar att en ultrafiltrering centrifugering isolering metod är enkel och tid - och labor-effektiv men ger en hög avkastning och renhet. Vi föreslår att denna metod för isolering kan vara en alternativ metod som är lämplig för EV isolering, särskilt för små volymer biologiska prover.

Vi utförde EV isolering från mus BALF med UFC och UC-DGC isoleringsmetoder på samma dag. Metoden UFC krävs cirka 2,5 – 3 h, medan UC-DGC tekniken krävs 8 h bearbetningstid. Detta inkluderade inte buffertar och reagens förberedelsetid. Det bör noteras att vissa andra uppgifter kan utföras under perioderna som lång centrifugering. Dock varade hela förfarandet nästan en hel dag för UC-DGC isolering teknik.
BALF-derive...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique at JoVE.com

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

Här beskriver vi två extracellulära vesikler isolering protokoll, ultrafiltrering centrifugering och ultracentrifugering med täthet lutning centrifugering, att isolera extracellulära blåsor från murina bronkoalveolär lavage vätskeprover. De extracellulära blåsor som härstammar från murina bronkoalveolär lavage vätska genom båda metoderna är kvantifierade och karakteriseras.

Isolering av extracellulära blåsor från murina bronkoalveolär Lavage vätska med ultrafiltrering centrifugering teknik

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during ...

Denna metod kan hjälpa till att ta itu med frågor som rör effektivitet, återvinning avkastning och renhet bronchoalveolar lavage vätska härledda extracellulära vesiklar med hjälp av en ultrafiltrering centrifugering strategi. Vi jämförde direkt denna teknik med en ultracentrifugering och densitetsgradientreningsteknik. Den största fördelen med denna teknik är att det är enkelt, effektivt, och lämplig för små volymprover såsom murine bronchoalveolar lavage vätska.Ännu viktigare det ger hög renhet och betydligt högre skalbarhet jämfört med en ultracentrifugation isolering metod. Demonstrera förfarandet kommer att mr.Norman Garrett III, forskarassistent för mitt laboratorium. Till att börja, sätt in en 22 gauge angiocatheter i luftstrupen av en avlivad mus.Fäst en insulinspruta med en milliliter iskallt steril DPBS, och ingjuta en milliliter i båda lungorna. Dra långsamt tillbaka sprutkolven för att hämta bronchoalveolar lavagevätska, eller BAL-vätska. Och dosera BAL-vätskan i ett koniskt rör på is.Efter detta, dra BAL-vätska från 25 möss och dela upp den i två lika stora uppsättningar. Centrifugera BAL-vätskan vid 400 gånger G i fem minuter vid fyra grader celsius. Samla supernatanten och centrifugen den vid 15 000 gånger G vid fyra grader celsius i 10 minuter.Samla sedan supernatanten och fortsätt genast till EV-isoleringsstegen. Först filtrera super natant genom en 0,2 mikrometer steril spruta filter. Efter detta, jämvikt centrifugalfilter enheten med sterila DPBS i 10 minuter.Sedan centrifug centrifugalenheten vid 15, 000 gånger G i 10 minuter vid fyra grader celsius. Fyll filtret med 15 milliliter BAL-vätska. Och centrifug det vid 3, 000 G: s i 30 minuter vid fyra grader celsius.Efter detta, tvätta retentate med 14 milliliter sterila DPBS genom att försiktigt pipettering upprepade gånger. Centrifugera filterenheten vid 3, 000 G vid fyra grader celsius i 30 minuter för att avlägsna DPBS och koncentrera retentatet. För att samla in den koncentrerade BAL-vätskan som härleds EV:s, sätt in en pipetter i botten av filterenheten, och dra tillbaka provet med hjälp av en sida till sida svepande rörelse.Sedan aliquot BAL vätska härrör EV: s och lagra dem på minus 80 grader celsius. Alternativt, börja med att överföra den tidigare förvärvade supernatanten till ett ultracentrifugrör. Och centrifug det på 10, 000 G: s i 30 minuter vid fyra grader celsius.Samla sedan supernatanten och centrifugen. Kassera supernatanten och dra upp EV-pelleten på 200 mikroliter av DPBS. Efter detta, blanda EV suspension med 300 mikroliter av 50%iodixanol arbetslösning.Och för över det till ett 15 milliliter ultracentrifugrör. Lägg sedan till buffertlösning enligt textprotokollet för att skapa en flytande densitetsgradient, och centrifugera den vid 100, 000 G:ar i tre timmar och 50 minuter. Samla ihop 15%och 25%iodixanol fraktioner, och späd dem i DPBS för att få volymen upp till 15 milliliter.Överför fraktionerna till ett nytt ultracentrifugrör och centrifug vid 100, 000 G vid fyra grader celsius i 60 minuter. Kassera supernatanten och dra upp EV-pelletsen på ny lydnad i 50 mikroliter av sterila DPBS. För att påbörja nano partikelspårningsanalys, späd EV-provet i en milliliter av DPBS.Och ladda provet i en insulinspruta. Efter detta, fäst sprutan på en spruta pump, och mäta partikeln antal och storlek. Ställ in kameranivån på 14 och detekteringströskeln till en.Därefter använder en tallrik läsare för att kvantifiera mängden protein i EV provet via kolorimetrisk detektion. Lös upp en lika stor mängd EV-protein från varje prov med en blotting lastningsbuffert och DTT. Värm sedan proverna vid 70 grader celsius i 10 minuter.Ladda proverna i en Bis-Tris Plus akrylamidgel och kör elektrofores i 35 minuter. Överför sedan proteinerna till ett nitrocellulosamembran med en torr överföringsmetod. Efter detta, blockera membranet med fem procent skummjölk i 60 minuter med mild gunga.Inkubera membranet med en antikropp mot en EV ytproteinmarkör vid fyra grader celsius med skonsam gungning över natten. Utveckla membranet genom att inkubera membranet med HRP länkantikropp i 60 minuter vid rumstemperatur. Tvätta membranet i 10 minuter med TBST buffert tre gånger.Slutligen, utveckla membranet med chemiluminescent HRP antikropp detektionsreagens innan du fortsätter till bildbehandling. För att börja flöde cytometri, spädas BAL vätska härlett EV: s i 49 mikroliter av PEB färgning buffert. Tillsätt sedan tre antikroppar till vart och ett av proverna, innan du inkuberar proverna vid fyra grader celsius med gungande i 60 minuter i mörker.Slutligen späd proverna med 40 mikroliter av membran filtrerad PEB-infärgningsbuffert och utför flödescytometrianalys. I detta protokoll, EV: s var isolerade från mus BAL vätska med hjälp av en UFC och UC-DGC metoder. BAL vätska härrör EV: s från normala möss isolerade av UFC-metoden visas mindre storlekar och mer enhetlig storleksfördelning än UC-DGC-EV's.UFC-tekniken hade också betydligt högre totala partikelantal jämfört med UC-DGC-tekniken. Den totala proteinåterhämtningen mätt i milligram av UFC-EV: s var också högre än för UC-DGC-EV: s, vilket tyder på att UFC tekniken är mer tid och ansträngning effektiv. Slutligen, BAL vätska härledd EV: s var också ytterligare karakteriseras via flöde cytometry.UFC-EV:s och UC-DGC-EV:s båda uttryckta CD63, CD9 och CD81. Medan du försöker detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg att rehydrera ultrafiltrering enhet membran med DPBS. När membranet är hydratiserad, måste enheten hållas våt hela tiden tills den används.Att hämta extracellulärt vesikelretentate från filterenheten kan vara utmanande. Se till att pipettens spets är svept från sida till sida för att återvinna de flesta av EV:na från filterenheten. Efter dess utveckling, denna teknik banade väg för forskare inom området extracellulära vesikelisoler att utforska de biologiska funktionerna i bronchoalveolar lavage härrör extracellulära vesicles i både normala eller patologiska förhållanden hos små djur.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

Isolering av kortikal Mikroglia med Konserverade immunofenotyp och funktionalitet från Murina Nyfödda

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

Utnyttjandet av orofaryngeal Intratracheal PAMP Administration och lungsköljning för att utvärdera värdimmunsvar hos möss

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Isolering av murint Lymph Node stromaceller

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Isolering och intravenös injektion av murin benmärg härledda Monocyter

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Isolering av leukocyter från Murina vävnader på Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

Isolering och aktivering av murina lymfocyter

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Flöde Virometry Analysera Antigen Spectra virioner och extracellulär Blåsor

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Lungsköljning av murina lungor Analysera infiltration av inflammatoriska celler

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolering och karakterisering av extracellulära blåsor från Adult Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment

Behandling av bronkoalveolär lavage vätska och matchade blod för alveolära Makrofage och CD4+ T-cell Immunophenotyping och hiv Reservoir Assessment