Name: quantifying intermembrane distances with serial image dilations
Uploaded: 2018-09-28T13:30:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Intermembrane Distances with Serial Image Dilations at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Kathy Lowe på Virginia-Maryland kollegium i Veterinary medicin til forarbejdning og farvning TEM prøver. Finansiering: Nationale kontorer i sundhed R01-HL102298 Nationale kontorer i sundhed F31-HL140873-01

Bemærk: Software kræves er ImageJ (eller lignende software, billede-redigering) og Matlab R2015. Brugeren kan støde på problemer med kompatibilitet med andre versioner af Matlab.
1. forbehandling billeder
<ol><li>For enhver gråtonebillede, sikre den maksimale intensitet værdi af enhver given pixel er < 255. Dette gøres typisk ved at trække værdien 1 fra billedet i den brugerdefinerede Matlab program "ImageSub.m", medtages i supplerende fil S1.</li>
</ol>2. skitserer Perinexus
<ol><li>Skitsere perinexus i ImageJ eller andre billedbehandling software.</li>
	<li>Sikre, at dispositionen er én pixel tyk og er indstillet til den højeste værdi i intensiteten i et billede (255 i et gråtonebillede fra 0 til 255).</li>
	<li>Identificere GJ ved sin pentalaminar struktur11,12, og definere begyndelsen af perinexus som det punkt, hvor de to modsatrettede cellemembranen dobbeltlag afviger, som vist i figur 1A. Begynd ~ 200 nm fra kanten af GJ, spore langs den indre membran i den første celle og tilbage langs den indre membran i den anden celle. I ImageJ, frigive pen for at automatisk lukke dispositionen. Denne kunstige lukning vil blive beskåret senere. Bemærk: Det er afgørende at skitsere perinexus med stor omhu ved så høj en forstørrelse som muligt, da selv små mis applikationer i dispositionen kan resultere i flere nanometer af fejl i den sidste måling.</li>
</ol>3. opsætning af algoritme og vælge Perinexus af interesse
Bemærk: Pathfinding algoritme kræver autograf, kant, graf, Node og Pathfinding funktioner9 at være i samme mappe som MembraneSepDist m-fil. Alle filer kan findes i supplerende fil S1.
<ol><li>Vælg Gem placering af data og tal. Disse er de i øjeblikket hard-kodet ind i m-filen. Bemærk: Den første linje i programmet er en funktion til at klare alle variabler, Luk alle vinduer og klare kommandovinduet. Gem alle ønskede variabler eller tal før du kører filen m. Bemærk: Software screenshots er inkluderet i supplerende fil S2 for alle hard-kodet værdier.</li>
	<li>Kør programmet "MembraneSepDist.m".</li>
	<li>Indstille parametre. Bemærk: En GUI vil affyre oppe hos standardparametre for gradient tærskel, skala, region af interesse, og manuel start. Standardværdierne kan ændres i filen m, eller de kan ændres for hver enkelt billede.<ol>
<li>Sæt rumlige afledte gradient tærskel. Bemærk: Højere værdier resulterer i flere punkter, der udvælges i midterlinjen isolation. Værdier, der er for høj eller for lav (uden for en række ca 3.0-7,9) kan resultere i computational ineffektivitet eller en upræcis udvælgelse af midterlinjen punkter giver upræcise midterlinjen isolation (Se figur 2A-C).</li>
		<li>Angive skala i pixels/skalaenheder.</li>
		<li>Angiv de rumlige nedre og øvre grænser for det pågældende område. Bemærk: Vores laboratorium konventionen, den definerede region af interesse er mellem 30 og 105 nm fra kanten af GJ2,3,10.</li>
		<li>Indstille automatisk/manuel start. I fleste tilfælde registrerer algoritmen præcist udgangspunkt hvor gap junction ender og perinexus begynder. Dog i nogle tilfælde af uregelmæssigt formet perinexi, skal brugeren identificere startpunktet manuelt. Indstil denne værdi til 0 for automatisk, 1 for manual.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vælg ønskede billede. Bemærk: Vælg filmappe kan ændres i filen m.</li>
	<li>Beskære billedet for at vælge perinexus af interesse.<ol>
<li>Når billedet kommer, ændres markøren automatisk til et trådkors. Beskære billedet ved at trække en boks omkring perinexus af interesse (Se figur 3). Beskæringsområdet kan justeres ved hjælp af kvadraterne på hjørnerne og siderne til at gøre den større eller mindre.</li>
		<li>Når beskæring, sikre den "åbne" ende af perinexus (længst væk fra GJ, se figur 3) er beskåret således at to membran konturer når kanten af det beskårne billede. Bemærk: Det anbefales at gøre billedet fuld skærm til lettere se perinexus af interesse og beskære korrekt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vælg den endelige beskæring ved at dobbeltklikke på med curser mellem modsatrettede kanterne skal måles. Bemærk: Det er afgørende, at Dobbeltklik udføres inde i perinexus. Hvis programmet ikke kan identificere en midterlinjen, genstarte programmet og sørg for at klikke sker inden for perinexus.</li>
	<li>Observere den endelige midterlinjen efter alle dilations og erosioner affyre oppe nemlig en slutbrugeren evaluering af programmets effektivitet. Bemærk: En dialogboks vil vises på skærmen, mens programmet kører for at informere brugeren Matlab er ude af stand til at behandle eventuelle yderligere kommandoer, indtil programmet er færdig. Hvor længe denne proces tager, afhænger af Arraystørrelsen (billedet) og computer processorkraft.</li>
	<li>Hvis manuel startpunktet er aktiveret, observere billedet af midterlinjen pop op over det oprindelige anatomiske billede, sammen med et kryds-hår markøren (Se figur 2E). Vælg et punkt uden for perinexus nær det ønskede startpunkt. Bemærk: Programmet vil finde midterlinjen punkt tættest til den markerede pixel og bruge det som startpunktet.</li>
	<li>Postdataene. Bemærk: Når programmet er afsluttet, programmet vil returnere en tilknyttet midterlinjen, plot af perinexal bredde som funktion af afstanden fra kanten af GJ. Derudover programmet vil returnere den gennemsnitlige perinexal bredde op til 150 nm fra kanten af GJ samt gennemsnit fra inden for de definerede region af interesse fra Matlab-kommandolinjen. WPedersen værdier og afstande fra GJ gemmes i variablen "WpList" eller brugeren kan manuelt registrere dem særskilt.</li>
</ol>4. algoritme fejlfinding
<ol><li>Hvis centerlinien ikke er korrekt identificeret (fig. 2A), åbne figur "Gmag" og bruge indekset til at identificere en passende gradient tærskel (figur 2C).</li>
	<li>Hvis startpunktet ikke er korrekt identificeret, indstille startpunktet manuelt (se protokollen 3.8).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rhett, J. M., Gourdie, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+perinexus:+a+new+feature+of+Cx43+gap+junction+organization.">The perinexus: a new feature of Cx43 gap junction organization.</a> Heart Rhythm. 9 (4), 619-623 (2012).</li><li>Veeraraghavan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+channels+in+the+Cx43+gap+junction+perinexus+may+constitute+a+cardiac+ephapse:+an+experimental+and+modeling+study.">Sodium channels in the Cx43 gap junction perinexus may constitute a cardiac ephapse: an experimental and modeling study.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. , (2015).</li><li>George, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+sodium+dependence+of+the+conduction+velocity-calcium+relationship:+evidence+of+ephaptic+self-attenuation.">Extracellular sodium dependence of the conduction velocity-calcium relationship: evidence of ephaptic self-attenuation.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 310 (9), 1129-1139 (2016).</li><li>Veeraraghavan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+channels+in+the+Cx43+gap+junction+perinexus+modulate+ephaptic+coupling:+an+experimental+and+modeling+study.">Potassium channels in the Cx43 gap junction perinexus modulate ephaptic coupling: an experimental and modeling study.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. , (2016).</li><li>Rhett, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cx43+associates+with+Na(v)1.5+in+the+cardiomyocyte+perinexus.">Cx43 associates with Na(v)1.5 in the cardiomyocyte perinexus.</a> Journal of Membrane Biology. 245 (7), 411-422 (2012).</li><li>Raisch, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercalated+Disc+Extracellular+Nanodomain+Expansion+in+Patients+with+Atrial+Fibrillation.">Intercalated Disc Extracellular Nanodomain Expansion in Patients with Atrial Fibrillation.</a> Frontiers in Physiology. , (2018).</li><li>Yan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+methods+of+automated+quantification+of+gap+junction+distribution+and+interstitial+collagen+quantity+from+animal+and+human+atrial+tissue+sections.">Novel methods of automated quantification of gap junction distribution and interstitial collagen quantity from animal and human atrial tissue sections.</a> PLoS One. 9 (8), 104357 (2014).</li><li>Papari, G., Petkov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+pseudo+dilation+for+gestalt+edge+grouping+and+contour+detection.">Adaptive pseudo dilation for gestalt edge grouping and contour detection.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 17 (10), 1950-1962 (2008).</li><li>George, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+sodium+and+potassium+levels+modulate+cardiac+conduction+in+mice+heterozygous+null+for+the+Connexin43+gene.">Extracellular sodium and potassium levels modulate cardiac conduction in mice heterozygous null for the Connexin43 gene.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. , (2015).</li><li>Revel, J. P., Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hexagonal+array+of+subunits+in+intercellular+junctions+of+the+mouse+heart+and+liver.">Hexagonal array of subunits in intercellular junctions of the mouse heart and liver.</a> Journal of Cell Biology. 33 (3), 7-12 (1967).</li><li>Huttner, I., Boutet, M., More, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+in+arterial+endothelium.">Gap junctions in arterial endothelium.</a> Journal of Cell Biology. 57 (1), 247-252 (1973).</li><li>Makowski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junction+structures.+II.+Analysis+of+the+x-ray+diffraction+data.">Gap junction structures. II. Analysis of the x-ray diffraction data.</a> Journal of Cell Biology. 74 (2), 629-645 (1977).</li><li>Entz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+Rate+and+Extracellular+Sodium+and+Potassium+Modulation+of+Gap+Junction+Mediated+Conduction+in+Guinea+Pigs.">Heart Rate and Extracellular Sodium and Potassium Modulation of Gap Junction Mediated Conduction in Guinea Pigs.</a> Frontiers in Physiology. 7, 16 (2016).</li><li>Sild, M., Chatelain, R. P., Ruthazer, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+the+quantification+of+motility+in+glia+and+other+morphologically+complex+cells.">Improved method for the quantification of motility in glia and other morphologically complex cells.</a> Neural Plasticity. 2013, 853727 (2013).</li><li>Rhett, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+perinexus:+Sign-post+on+the+path+to+a+new+model+of+cardiac+conduction.">The perinexus: Sign-post on the path to a new model of cardiac conduction.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. , (2013).</li><li>Lang, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+cardiac+chamber+quantification+by+echocardiography+in+adults:+an+update+from+the+American+Society+of+Echocardiography+and+the+European+Association+of+Cardiovascular+Imaging.">Recommendations for cardiac chamber quantification by echocardiography in adults: an update from the American Society of Echocardiography and the European Association of Cardiovascular Imaging.</a> Journal of the American Society of Echocardiography. 28 (1), 1-39 (2015).</li><li>Kawai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left+ventricular+volume+and+ejection+fraction+by+the+axius+auto+ejection+fraction+method:+comparison+with+manual+trace+method+and+visual+assessment+of+ejection+fraction.">Left ventricular volume and ejection fraction by the axius auto ejection fraction method: comparison with manual trace method and visual assessment of ejection fraction.</a> Journal of Cardiology. 49 (3), 125-134 (2007).</li><li>Frederiksen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+utility+of+semi-automated+estimation+of+ejection+fraction+at+the+point-of-care.">Clinical utility of semi-automated estimation of ejection fraction at the point-of-care.</a> Heart, Lung and Vessels. 7 (3), 208-216 (2015).</li><li>Foster, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+ultrasound+instrument+for+in+vivo+microimaging+of+mice.">A new ultrasound instrument for in vivo microimaging of mice.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 28 (9), 1165-1172 (2002).</li><li>Moran, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+imaging+performance+of+high+resolution+ultrasound+scanners+for+preclinical+imaging.">A comparison of the imaging performance of high resolution ultrasound scanners for preclinical imaging.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 37 (3), 493-501 (2011).</li><li>Papademetris, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+3D+left+ventricular+deformation+from+echocardiography.">Estimation of 3D left ventricular deformation from echocardiography.</a> Medical Image Analysis. 5 (1), 17-28 (2001).</li><li>Hosny, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlocking+vendor-specific+tags:+Three-dimensional+printing+of+echocardiographic+data+sets.">Unlocking vendor-specific tags: Three-dimensional printing of echocardiographic data sets.</a> Journal of Thoracic Cardiovascular Surgery. 155 (1), 143-145 (2018).</li><li>Cretoiu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiac+telocytes:+3D+imaging+by+FIB-SEM+tomography.">Human cardiac telocytes: 3D imaging by FIB-SEM tomography.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (11), 2157-2164 (2014).</li><li>Risi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)-induced+movement+of+tropomyosin+on+native+cardiac+thin+filaments+revealed+by+cryoelectron+microscopy.">Ca(2+)-induced movement of tropomyosin on native cardiac thin filaments revealed by cryoelectron microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6782-6787 (2017).</li><li>Dhindwal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cryo-EM-based+model+of+phosphorylation-+and+FKBP12.6-mediated+allosterism+of+the+cardiac+ryanodine+receptor.">A cryo-EM-based model of phosphorylation- and FKBP12.6-mediated allosterism of the cardiac ryanodine receptor.</a> Science Signaling. 10 (480), (2017).</li><li>Reddy, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+cardiac+magnetic+resonance+imaging+with+three-dimensional+electroanatomic+mapping+to+guide+left+ventricular+catheter+manipulation:+feasibility+in+a+porcine+model+of+healed+myocardial+infarction.">Integration of cardiac magnetic resonance imaging with three-dimensional electroanatomic mapping to guide left ventricular catheter manipulation: feasibility in a porcine model of healed myocardial infarction.</a> Journal of the American College of Cardiology. 44 (11), 2202-2213 (2004).</li><li>van Heeswijk, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Self-Navigated+T2+Mapping+for+the+Detection+of+Acute+Cellular+Rejection+After+Orthotopic+Heart+Transplantation.">Three-Dimensional Self-Navigated T2 Mapping for the Detection of Acute Cellular Rejection After Orthotopic Heart Transplantation.</a> Transplant Direct. 3 (4), 149 (2017).</li><li>Valinoti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+patient-specific+models+for+left+atrium+characterization+to+support+ablation+in+atrial+fibrillation+patients.">3D patient-specific models for left atrium characterization to support ablation in atrial fibrillation patients.</a> Magnetic Resonance Imaging. 45, 51-57 (2018).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Algoritmen bruger serielle billede dilations til at tælle antallet af pixels mellem to modsatrettede 2D kanter i et binært billede, som i dette tilfælde er indbyrdes membran magtens perinexus2,3,14. En rumlig derivat og en pathfinding algoritme bruges derefter til at isolere midterlinjen, efterfulgt af en sekundær dilatation og erosion sekvens til at udfylde hullerne i midterlinjen, svarende til hvad der er sket inden15. Midterlinjen kombineres derefter med den endelige dilatation-count billede til at repræsentere perinexal bredde som funktion af afstanden fra begyndelsen af kant adskillelse, i dette tilfælde i slutningen af GJ og begyndelsen af perinexus16.
Fire primære parametre er brugeren, der er defineret i en GUI i starten af programmet:
<ol><li>Gradient tærskel</li>
	<li>Skala</li>
	<li>Region af interesse vifte</li>
	<li>Start punkt udvælgelsesmetode (automatisk eller manuel)</li>
</ol>Den mest almindelige mekanisme for fiasko for algoritmen er svigt af midterlinjen at nå frem til kanten af det billede, som er hvordan slutpunktet bestemmes den pathfinding algoritme. For at lave sådan et problem, kan brugeren øge gradient tærsklen beskrevet i trin 3.3.1, som vil forårsage program til at vælge flere point ud af de rumlige afledte billede, hvilket vil øge beregningen tid kræves af pathfinding algoritme. Derfor, denne algoritme kræver et kompromis mellem beregning hastighed og midterlinjen integritet. Det er vigtigt at bemærke, at så længe alle punkter på centerlinien er identificeret fra den rumlige derivat, sammen med en passende startpunktet, den rumlige afledte tærskel vil have nogen effekt på kanten adskillelse måling.
Billede orientering synes at påvirke dilatation værdier, fordi kernen dilaterer i 90 graders trin, som kan indføre en fejl, hvis størstedelen af det pågældende område er i en vinkel 45° til akserne i dilatation matricer. Derfor dilatation tæller muligvis ikke en nøjagtig fremstilling af rum mellem kanterne. Denne begrænsning er blevet behandlet af en trigonometrisk korrektionsfaktor, men kunne potentielt blive ignoreret, hvis alle billeder i et datasæt er justeret på den samme retning. Desuden bør forsigtighed anvendes ved fortolkningen af resultaterne, som det er muligt, at afsnit planer ikke er helt vinkelret på de to membraner. I figur 9Bbruger vi GJW til at foreslå, at vores perinexus billeder var i flyet. Stadig, det er bydende nødvendigt, at stikprøvestørrelser vaere tilstraekkeligt store til konto for unøjagtigheder skæring mellem billeder. Vores perinexal bredde målinger bør derudover ikke fortolkes for at afspejle, i vivo rum, men denne fremgangsmåde bruges til at måle betyde forskelle i perinexal bredde i forhold til nogle indgreb eller sygdom stat.
Den nuværende algoritme kræver også en manuelt spore omridset af kanterne som input. Det er vigtigt at bemærke, at så længe skalaen er indstillet korrekt, rumlige opløsning har ingen effekt på den algoritme målinger, som det fremgår af de forskellige resolutioner af billeder i figur 6 og en ekstra lav opløsning billede i supplerende filen S6. Det næste skridt for at forbedre algoritmen er at fjerne menneskelig indgriben fra skitse generation sammen med et værktøj, der kan vælge området af interesse. Disse funktioner vil sandsynligvis forbedre præcisionen af målingen og reducere bruger bias.
Denne beregningsmæssigt effektiv algoritme giver en hurtigere metode, der kræver cirka en femtedel af mandetimer, af kvantificere perinexus med ingen påviselige straf at reproducerbarhed sammenlignet med den manuelle segmentering proces. Derudover udnytter manuel segmentering proces en måling hver 15 nanometer til at kvantificere perinexal bredde, hvilket kan føre til under prøvetagning som membran adskillelsen af perinexus kan ændre væsentligt inden for at 15 nm rækkevidde. Derimod har den automatiseret program en rumlig opløsning lig med imaging modalitet, i dette tilfælde 2,9 pixel pr. nanometer langs længden af perinexus, derfor levere et mere fint løst gennemsnit af perinexal bredde.
Mens anvendelsesmuligheder inden for hjerte strukturel biologi er lovende og spændende, er denne algoritme anvendelser ikke begrænset til TEM billeder. Ethvert felt, som kræver en præcis, høj opløsning måling af to næsten parallelle 2D kanter kan gøre brug af denne algoritme. Algoritmen, der kan bruges til at spore noget fra riverbank erosion og oversvømmelse mønstre fra satellitbilleder til vaskulær udvikling med brightfield eller fluorescerende mikroskopi. En af de mest lovende potentielle anvendelser er inden for kardiologi og måle ventrikulær uddrivningsfraktion (UDDRIVNINGSFRAKTION) med punkt af pleje hjerte ekkokardiografi. I øjeblikket, er den standard teknik metoden biplan diske17, om en nyere algoritme, AutoEF, er i øjeblikket forkant EF-kvantificering metode18,19. Biplan metode til diske, det pågældende kammer med røbestof manuelt og kvantificeres ved hjælp af en modificeret Simpson metode, hvorved samlede volumen beregnes automatisk ved summation af stablede elliptisk diske. Den største begrænsning med denne metode er, at det kun kan returnere de samlede tværsnitsareal af den ønskede afdeling, med ingen beslutning at identificere specifikke områder af interesse, og også kræver betydelige menneskelige input og ekspertise. Den nyere metode, AutoEF, identificerer og beskriver kanten af ventrikel ved hjælp af en 2D speckling algoritme og derefter beregner ventrikulær tværsnitsareal. Denne proces, har mens præcis og effektiv til at måle ventrikulær bruttoareal, også en lignende iboende begrænsning af kun måle samlet tværsnitsareal. Denne primære ulempe begrænser klinikere diagnostisk og behandling evner. Derimod den algoritme, der præsenteres i dette håndskrift kan identificere en midterlinjen og har en opløsning, der er lig med opløsning af imaging modalitet at udpege specifikke områder af interesse. Dette er vigtigt fordi ultralyd scannere med mikrometer rumlige opløsning er kommercielt tilgængelige20,21, hvilket indebærer, at denne algoritme kunne afsløre lokaliseret væg bevægelse abnormaliteter på løsningen af mikrometer i stedet for centimeter. Mens denne anvendelse skal valideres eksperimentelt, er det en af de mest umiddelbart lovende anvendelser af denne algoritme. Faktisk, det kan nemt kombineres med speckle sporing kapaciteter af AutoEF eller de manuelle spor udnyttet i manuel planimetry med højere opløsning oplysninger parallelt med konventionelle EF data.
Så alsidig og gældende som den nuværende algoritme er, blev det udviklet til 2D-billeder. Men som billeddannelsesteknologier fortsætter med at forbedre, der er en stigende efterspørgsel efter 3 og 4 D kvantificering teknologier. Den næste iteration af algoritmen er derfor at tilpasse den samme fremgangsmåde, seriefremstillede dilatere et binært billede til et 3-dimensionelt objekt, hvor automatisk definere en midterlinjen er i øjeblikket overgår nuværende billeddiagnostiske programmer-funktionerne. Sådan en algoritme ville har bredt programmer både klinisk og eksperimentelt i feltet hjerte alene, herunder 3D hjerte ekkokardiogrammer22,23, 3D elektronmikroskopi24,25, 26og 3D magnetisk resonans imaging27,28,29.

Følgende algoritme blev udviklet til at måle intermembrane afstanden mellem to strukturelt koblede cardiomyocytes på det punkt, de adskilt fra hinanden ved kanten af mindepladen gap junction i en nanodomain, kaldet den perinexus1, som har været impliceret i ephaptic kobling2,3,4,5. Ved at analysere hundredvis af transmissions Elektron Mikroskopi (TEM) billeder af perinexi ved hjælp af en manuel segmentering metode i en tidligere undersøgelse6, blev behovet identificeret for en højere overførselshastighed metode, der udtages perinexal bredde i højere rumlige opløsning samtidig bevare nøjagtigheden af den tidligere manuelle segmentering proces under manuel segmentering, linjer trækkes 15 nm mellemrum ca ortogonale i forhold til centerlinien, for at måle perinexal bredde. Den nye algoritme tager en én pixel tyk binære kontur af to parallelle linjer og bruger serielle billede dilations til at tælle antallet af pixels mellem to membraner. Mens billedet dilations er almindeligt brugt i et utal af image processing applikationer, bruger herunder kontur eller kant påvisning7,8, denne algoritme dilations som en optælling mekanisme. Centerlinien er så derefter isoleret ved hjælp af en pathfinding algoritme9 og perinexal bredde måles med en opløsning langs længden af perinexus lig med opløsning af billedet. Forskellen i opløsning i dette tilfælde er 1 måling pr. 15 nm for manuel segmentering og 1 måling pr. 0,34 nm med den nye algoritme, en 44-fold stigning i rumlige sampling hyppighed. Desuden, denne øgede samplingfrekvensen opnås i ca 1/5th den nødvendige tid til manuel segmentering.
Denne algoritme bruges i sin nuværende form til at måle perinexal bredde på de konventionelle 0-150 nm fra kanten af en gap junction plaque5 (GJ) samt inden for et bestemt område af interesse, hvor perinexus plateauer mellem 30 og 105 nm2 , 3 , 10. øget samplingfrekvensen reducerer variationen i individuelle perinexus målinger i forhold til manuel segmentering og betydeligt forkorter analyse tid, giver mulighed for effektiv behandling af store datamængder. Dog, dette program er ikke begrænset til nanoskala TEM billeder af cardiac indtrængere diske. Den samme tilgang kan bruges til at kvantificere vaskulære diameter, ventrikulær uddrivningsfraktion eller endog ikke-biologiske fænomener som floden erosion eller oversvømmelse. Denne algoritme er passende for kvantificering af afstanden mellem de to næsten parallelle kanter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:867px;" width="866">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Touchscreen Monitor</td>
			<td style="width:79px;">Dell</td>
			<td style="width:119px;">S2240T</td>
			<td style="width:453px;">Needs soft-tipped stylus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Desktop</td>
			<td style="width:79px;">Dell</td>
			<td style="width:119px;">Precision T1650</td>
			<td>8GB RAM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Operating System</td>
			<td style="width:79px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;">Windows 7 Enterprise</td>
			<td>64-bit OS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Program platform</td>
			<td style="width:79px;">Mathworks</td>
			<td style="width:119px;">Matlab R2015b</td>
			<td>Program may be incompatible with newer/older versions of Matlab</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying intermembrane distances with serial image dilations

En nylig beskrevet ekstracellulære nanodomain, betegnes perinexus, har været impliceret i ephaptic kobling, som er en alternativ mekanisme for elektriske overledning mellem cardiomyocytes. Den nuværende metode til kvantificering af dette rum af manuel segmentering er langsom og har lav rumlige opløsning. Vi udviklede en algoritme, der bruger serielle billede dilations af en binær disposition til at tælle antallet af pixels mellem to modsatrettede 2 dimensionelle kanter. Denne algoritme kræver færre mandetimer og har en højere spatial opløsning end den manuelle metode samtidig bevare reproducerbarhed af den manuelle proces. Faktisk oplevede og novice efterforskere var i stand til at sammenfatte resultaterne af en tidligere undersøgelse med denne nye algoritme. Algoritmen er begrænset af menneskelige input, der kræves til manuelt skitsere perinexus og datakraft hovedsagelig belastet af en allerede eksisterende pathfinding algoritme. Algoritmen høj overførselshastighed kapaciteter, høj rumlige opløsning og reproducerbarhed gør det dog et alsidigt og robust måling værktøj til brug på tværs af en bred vifte af applikationer, der kræver måling af afstanden mellem enhver 2-dimensional (2D ) kanter.

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Intermembrane Distances with Serial Image Dilations at JoVE.com

Quantifying Intermembrane Distances with Serial Image Dilations

Kvantificere Intermembrane afstande med seriel billede Dilations

Formålet med denne algoritme er at løbende måle afstanden mellem to 2-dimensionelle kanter ved hjælp af seriel billede dilations og pathfinding. Denne algoritme kan anvendes til en lang række felter såsom hjerte strukturbiologi, vaskulære biologi og Civilingeniør.

A recently-described extracellular nanodomain, termed the perinexus, has been implicated in ephaptic coupling, which is an alternative mechanism for ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i hjertet elektrofysiologiske område, om strukturen af den ekstracellulære rum og cellulære kommunikationsmekanismer. Denne teknik vigtigste fordele er, at det har høj gennemløb kapaciteter, og en forbedret rumlig prøveudtagning frekvens. I bund og grund kan vi opnå målinger hurtigere og med højere selvtillid end før.Perinexus identifikation og program fejlfinding er vanskelige at lære uden visuel demonstration, fordi perinexus er en relativt nydefineret struktur, og fejlfinding kan ikke være intuitiv for efterforskere, der ikke er bekendt med MATLAB. Til gråtonebilleder skal du bruge numerisk computersoftware for at sikre, at ingen pixel har en intensitet på mere end 255. Derefter åbne vores parrede billede i billedbehandling software, og zoome ind på perinexus.Det er afgørende at identificere perinexus korrekt. Det første skridt er at identificere et hul junction plaque, som har en stribet udseende. Så leder vi efter to modsatrettede membraner, i fly, ud til omkring 200 nanometer.Identificer mellemrum krydset plak fra det pentylaminer struktur. Begyndelsen af perinexus, er det punkt, hvor de to modsatrettede cellemembran tolags afviger. Vis en skalabar i nanometer.Start- og slutpunkterne for perinexus-dispositionen vil være 200 nanometer fra begyndelsen af perinexus. Vælg derefter værktøjet til frihåndsmarkering. Klik og træk, eller brug en pen til omhyggeligt at spore op langs den indre membran af en celle, til begyndelsen af perinexus, og tilbage langs den indre membran af den anden celle.Luk det markerede område ved at slippe museknappen eller løfte pennen. Angiv derefter linjebredden til én pixel og forgrundsfarven til den højeste intensitetsværdi for billedtypen. f.eks. hvid til gråtonebillede.Opret en sporet disposition ud fra markeringen, og gem det resulterende billede som en filtype, der er kompatibel med analysesoftwaren, f.eks. Hvis det er nødvendigt, skal du åbne membranseparationsafstandsanalysesoftwaren og ændre lagringsstederne for de data og tal, der skal genereres. Gem filen, og luk den.Kør derefter programmet. Angiv den geografiske afledte gradienttærskel passende for centerlinjeidentifikation. Indstil skalaen og pixel pr. enhedslængde.Angiv de rumlige lavere og øvre grænser for interesseområdet med hensyn til kanten af mellemrumskrydset. Vælg enten automatisk eller manuel registrering af startpunkt. Manuel startpunktsdetektering kan være nødvendig for uregelmæssigt formet perinexi.Åbn derefter billedet med den skitserede perinexus. Klik og træk for at tegne en boks rundt om perinexus, eksklusive den lukkede ende. Dobbeltklik inde i den sporede perinexus-kontur for at beskære billedet og identificere midterlinjen.Hvis startpunktet skal vælges manuelt, vises en trådkorsmarkør og midterlinje over det oprindelige billede. Vælg et punkt uden for perinexus tæt på det ønskede udgangspunkt for at fortsætte processen. Når processen er færdig, skal du bekræfte, at midterlinjen forbliver inden for perinexus, og skærer startpunktet korrekt.Gennemse de genererede data, og afbild den perinexale bredde. Hvis midterlinjen ikke er korrekt identificeret og isoleret, skal du åbne g-mag-billedarrayet for at bestemme en passende forløbstærskel. Vi bruger indeksværktøjet til at klikke rundt om midterlinjen og g-mag-arrayet for at få en ide om, hvilken pixel vi ønsker, at midterlinjens søgealgoritme skal vælge.Forløbstærsklen skal derefter angives lige over intensitetsværdien af disse pixel. Vælg indeksværktøjet, og klik på og rundt om midterlinjen for at få vist indeksværdien af de pixel, der skal vælges. Angiv den geografiske afledte gradienttærskel til lige over indeksværdien, og kør processen igen.Hvis startpunktet ikke blev registreret korrekt i den automatiserede proces, skal du køre programmet igen ved hjælp af manuel startpunktsregistrering. I denne proces udvides manuelle konturer i intervaller på én pixel for at tælle antallet af pixel mellem de to kanter. Hvert interval føjes til et arbejdsbillede for at generere et rumligt afledt.Den oprindelige kontur og midterlinjen er diskontinuiteter i dens størrelse. Efter isolering af midterlinjen raffineres den ved dilatation, erosion og en stifindingsalgoritme. Perinexal bredde præsenteres som en funktion af afstanden fra starten af perinexus, eller inden for en region af interesse, og som et gennemsnit af begge disse funktioner.Som perinexus orientering ændret, over-eller undervurderinger i perinexus bredde blev observeret, afhængigt af dilatation mønster. Trigonometrisk korrektion gav resultater stærkt korreleret med billeder roteret for at orientere perinexus vandret. Algoritmen blev valideret for forskellige rumlige opløsninger, referenceenheder og billedstørrelser.Både erfarne og uerfarne brugere sporede omridset hurtigere, end de manuelt segmenterede billedet. Og den automatiserede proces havde betydeligt større rumlig opløsning. Erfarne og uerfarne observatører præcist identificeret betydelige forskelle i perinexal bredde mellem patienter med og uden allerede eksisterende Atrieflimren.Disse observatører identificerede også præcist ingen signifikant forskel mellem de absolutte kløftkrydsbredder i samme population. De perinexale og gap junction bredder var i overensstemmelse med tidligere rapporter. Mens du forsøger denne procedure, skal du huske at tage din tid med omridset, da selv små afvigelser fra membranen kan forårsage betydelige fejl på denne skala.Generelt kæmper personer, der er nye i denne metode, fordi de ikke kender den struktur, de måler, eller de er usikre på, hvordan de skal foretage fejlfinding af problemer for at identificere startpunkter eller midterlinjeafvigelse. Det er vigtigt at se denne udførte billedbehandlingsmetode. Som perinexus identifikation og algoritme fejlfinding er vanskelige at lære uden.Og vi ønsker at sikre, at vi kvantificerer det, vi siger, vi måler. Denne teknik baner vejen for forskere inden for hjertesundhed, at udforske højere opløsning kvantificering af mange niveauer af hjertefunktion. Fra nanoskala, ekstracellulære rum til klinisk bestemmelse af ventrikeleffektivitet eller disfunction.Selv om denne metode blev demonstreret med elektromikroskopi billeder, det kan også anvendes til andre billeddannelse teknikker, såsom hjerte ekkokardiografi til mere præcist at kvantificere den mekaniske funktion af hjertet. Denne metode kan finde programmer i et billedfelt, fordi programmet kan måle mellemrummet mellem to definerede kanter, hvis skalaen er indstillet korrekt, og kanterne er næsten parallelle.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Kvantificering af mekaniske egenskaber af de Endothelial glycocalyx med Atomic Force Microscopy

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

Observation og kvantificering fibroblast-medieret Fibrin Gel Compaction

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global ...

Manufacture of Concentrated, Lipid-based Oxygen Microbubble Emulsions by High Shear Homogenization and Serial Concentration

Fremstilling af koncentreret, Lipid-baserede Oxygen Microbubble Emulsioner af High Shear Homogenisering og Serial Koncentration

Gas-filled microbubbles have been developed as ultrasound contrast and drug delivery agents. Microbubbles can be produced by processing surfactants using ...

Hybrid &#181;CT-FMT imaging and image analysis

Hybrid Ãƒâ€šÃ‚ÂµCT-FMT imaging and image analysis

Hybrid μCT-FMT billedbehandling og billedanalyse

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to ...

Custom-designed Laser-based Heating Apparatus for Triggered Release of Cisplatin from Thermosensitive Liposomes with Magnetic Resonance Image Guidance

Custom-designet laser-baserede Varme Apparater til Udløst Frigivelse af cisplatin fra varmefølsom Liposomer med magnetisk resonans billede Vejledning

Liposomes have been employed as drug delivery systems to target solid tumors through exploitation of the enhanced permeability and retention (EPR) effect ...

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

Image-styret, Laser-baserede Fremstilling af vaskulær-afledte Mikrofluid Networks

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM)

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy DHM

Kvantificering af mikroorganismer ved lave koncentrationer ved hjælp af digitale holografiske mikroskopi (DHM)

Accurately detecting and counting sparse bacterial samples has many applications in the food, beverage, and pharmaceutical processing industries, in ...

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

En hurtig Image-baserede bakteriel virulens analyse ved hjælp af Amoeba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro

Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro

Meso-skala partikel billede Velocimetri undersøgelser af neurovaskulære strømme In Vitro

Particle image velocimetry (PIV) is used in a wide variety of fields, due to the opportunity it provides for precisely visualizing and quantifying flows ...