Name: quantifying intermembrane distances with serial image dilations
Uploaded: 2018-09-28T13:30:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Intermembrane Distances with Serial Image Dilations at JoVE.com

De auteurs bedank Kathy Lowe op de Virginia-Maryland College voor diergeneeskunde voor het verwerken en kleuring TEM monsters. Financiering: National Institutes of Health R01-HL102298 Nationale instituten van gezondheid F31-HL140873-01

Opmerking: Software nodig zijn ImageJ (of vergelijkbare afbeelding-aanpassen software) en Matlab R2015. De gebruiker ondervinden problemen met de compatibiliteit met andere versies van Matlab.
1. voorbewerkend beelden
<ol><li>Voor elke afbeelding in grijswaarden, zorgen de waarde van de maximale intensiteit voor een bepaalde pixel is < 255. Dit wordt meestal gedaan door een waarde van 1 van de afbeelding in het aangepaste programma voor Matlab "ImageSub.m", opgenomen in de aanvullende bestand S1 af te trekken.</li>
</ol>2. overzicht van de Perinexus
<ol><li>Een overzicht van de perinexus in ImageJ of andere beeld-verwerkende software.</li>
	<li>Ervoor zorgen dat de omtrek één pixel dik is en is ingesteld op de hoogste intensiteitswaarde in een afbeelding (255 in een grijswaardenafbeelding van 0 tot 255).</li>
	<li>Identificeer de GJ door haar pentalaminar structuur11,12, en definiëren van het begin van de perinexus als het punt waar de twee tegengestelde celmembraan bilayers uiteenlopen, zoals aangegeven in Figuur 1A. Begin ~ 200 nm vanaf de rand van de GJ, langs het binnenste membraan van de eerste cel en terug langs het binnenste membraan van de tweede cel traceren. Laat de pen als automatisch wilt sluiten de omtrek in ImageJ. Deze kunstmatige sluiten zal later worden bijgesneden uit. Opmerking: Het is cruciaal voor een overzicht van de perinexus met grote zorgvuldigheid op zo hoog een vergroting mogelijk, want zelfs kleine mis toepassingen van het overzicht leiden verschillende nanometer van fout in de laatste meting tot kunnen.</li>
</ol>3. het opzetten van algoritme en selecteren Perinexus van belang
Opmerking: De vastloper algoritme vereist de handtekening, rand, grafiek, knooppunt en vastloper functies9 worden in dezelfde map als het MembraneSepDist m-bestand. Alle bestanden kunnen gevonden worden in aanvullende bestand S1.
<ol><li>Selecteer Opslaan locaties voor gegevens en cijfers. Deze zijn momenteel hard-coded in de m-bestand. Opmerking: De eerste regel van het programma is een functie moet duidelijk alle variabelen, sluit alle vensters en schakelt u het opdrachtvenster. Gewenste variabelen of cijfers vóór het uitvoeren van de m-bestand opslaat. Merk op: Screenshots van de Software zijn opgenomen in aanvullende bestand S2 voor alle hard-coded waarden.</li>
	<li>Voer het programma "MembraneSepDist.m".</li>
	<li>Parameters instellen. Opmerking: Een GUI zal opduiken met standaardparameters voor de kleurovergang drempel, de schaal, de regio van belang, en handmatig starten. De standaardwaarden in de m-bestand kunnen worden gewijzigd, of ze voor elke afzonderlijke afbeelding kunnen worden gewijzigd.<ol>
<li>Set ruimtelijke afgeleide kleurovergang drempel. Opmerking: Hogere waarden leiden tot meer punten geselecteerd in middellijn isolatie. Waarden die te hoog of te laag (buiten een bereik van ongeveer 3.0-7,9 zijn) kunnen resulteren in computationele inefficiëntie of een onduidelijke selectie van middellijn punten oplevert van onnauwkeurige middellijn isolatie (Zie Figuur 2A-C).</li>
		<li>Stel de schaal in pixels/schaaleenheden.</li>
		<li>Stel de ruimtelijke boven- en ondergrenzen voor de regio van belang. Opmerking: Door ons laboratorium van de Conventie, de gedefinieerde regio van belang is tussen 30 en 105 nm vanaf de rand van de GJ2,3,10.</li>
		<li>Stel automatische/handmatige start. In de meeste gevallen detecteert het algoritme nauwkeurig het beginpunt waar de kloof kruising eindigt en de perinexus begint. Echter in sommige gevallen van onregelmatig gevormde perinexi, moet de gebruiker identificeren het beginpunt handmatig. Deze waarde instelt op 0 voor automatische, 1 voor manual.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selecteer de gewenste afbeelding. Opmerking: De map voor het selecteren van bestand kan worden gewijzigd in het m-bestand.</li>
	<li>Gewas het beeld te selecteren van de perinexus van belang.<ol>
<li>Wanneer de afbeelding omhoog komt, verandert de cursor automatisch in een draadkruis. De afbeelding bijsnijden door te slepen een vak rond de perinexus van belang (Zie Figuur 3). Het uitsnijdvak kan worden aangepast met behulp van de vierkantjes op de hoeken en zijden groter of kleiner te maken.</li>
		<li>Wanneer bijsnijden, zorgen voor het "open" einde van de perinexus (die het verst van de GJ, Zie Figuur 3) wordt bijgesneden zodat de twee membraan contouren de rand van de bijgesneden afbeelding bereiken. Opmerking: Het wordt aanbevolen om het beeld volledig-scherm om gemakkelijker zien van de perinexus van belang en bijsnijden naar behoren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selecteer de laatste oogst door erop te dubbelklikken met de cursor tussen de tegengestelde randen te meten. Opmerking: Het is cruciaal dat het dubbelklikken worden uitgevoerd binnen de perinexus. Als het programma niet te identificeren van een middellijn, start het programma opnieuw en zorg ervoor dat de klik treedt op binnen de perinexus.</li>
	<li>Observeer de definitieve middellijn na alle dilations en erosies pop omhoog voor een eindgebruiker evaluatie van de doeltreffendheid van het programma. Opmerking: Een dialoogvenster verschijnt op het scherm terwijl het programma wordt uitgevoerd om te informeren van de gebruiker dat Matlab niet alle extra opdrachten verwerkt zullen totdat het programma is voltooid. Hoe lang dit proces duurt, hangt af van de matrixgrootte van de (afbeelding) en computer verwerkingskracht.</li>
	<li>Als handmatige startpunt is ingeschakeld, observeren het imago van de middellijn opduiken over de oorspronkelijke anatomische afbeelding, samen met een cross-hair cursor (Zie Figuur 2). Selecteer een punt buiten de perinexus in de buurt van het gewenste beginpunt. Opmerking: Het programma vindt de middellijn punt dichtst met de geselecteerde pixel en gebruik dat als het beginpunt.</li>
	<li>Recordgegevens. Opmerking: Zodra het programma klaar is, het programma zal terugkeren een toegewezen middellijn, perceel van perinexal breedte als een functie van de afstand vanaf de rand van de GJ. Bovendien, het programma geeft de breedte van de gemiddelde perinexal tot 150 nm vanaf de rand van de GJ, evenals het gemiddelde van binnen de gedefinieerde regio van belang op de opdrachtregel van Matlab. Wp -waarden en afstanden van de GJ worden opgeslagen in de variabele "WpList" of de gebruiker kunt handmatig vastleggen hen afzonderlijk.</li>
</ol>4. algoritme oplossen
<ol><li>Als de middellijn is niet goedgeïdentificeerde (Figuur 2),het cijfer "Gmag" open en de Index om te identificeren een juiste gradiënt drempel (Figuur 2C).</li>
	<li>Als het beginpunt niet behoorlijk is geïdentificeerd, het beginpunt handmatig instellen (Zie Protocol 3.8).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rhett, J. M., Gourdie, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+perinexus:+a+new+feature+of+Cx43+gap+junction+organization.">The perinexus: a new feature of Cx43 gap junction organization.</a> Heart Rhythm. 9 (4), 619-623 (2012).</li><li>Veeraraghavan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+channels+in+the+Cx43+gap+junction+perinexus+may+constitute+a+cardiac+ephapse:+an+experimental+and+modeling+study.">Sodium channels in the Cx43 gap junction perinexus may constitute a cardiac ephapse: an experimental and modeling study.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. , (2015).</li><li>George, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+sodium+dependence+of+the+conduction+velocity-calcium+relationship:+evidence+of+ephaptic+self-attenuation.">Extracellular sodium dependence of the conduction velocity-calcium relationship: evidence of ephaptic self-attenuation.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 310 (9), 1129-1139 (2016).</li><li>Veeraraghavan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+channels+in+the+Cx43+gap+junction+perinexus+modulate+ephaptic+coupling:+an+experimental+and+modeling+study.">Potassium channels in the Cx43 gap junction perinexus modulate ephaptic coupling: an experimental and modeling study.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. , (2016).</li><li>Rhett, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cx43+associates+with+Na(v)1.5+in+the+cardiomyocyte+perinexus.">Cx43 associates with Na(v)1.5 in the cardiomyocyte perinexus.</a> Journal of Membrane Biology. 245 (7), 411-422 (2012).</li><li>Raisch, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercalated+Disc+Extracellular+Nanodomain+Expansion+in+Patients+with+Atrial+Fibrillation.">Intercalated Disc Extracellular Nanodomain Expansion in Patients with Atrial Fibrillation.</a> Frontiers in Physiology. , (2018).</li><li>Yan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+methods+of+automated+quantification+of+gap+junction+distribution+and+interstitial+collagen+quantity+from+animal+and+human+atrial+tissue+sections.">Novel methods of automated quantification of gap junction distribution and interstitial collagen quantity from animal and human atrial tissue sections.</a> PLoS One. 9 (8), 104357 (2014).</li><li>Papari, G., Petkov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+pseudo+dilation+for+gestalt+edge+grouping+and+contour+detection.">Adaptive pseudo dilation for gestalt edge grouping and contour detection.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 17 (10), 1950-1962 (2008).</li><li>George, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+sodium+and+potassium+levels+modulate+cardiac+conduction+in+mice+heterozygous+null+for+the+Connexin43+gene.">Extracellular sodium and potassium levels modulate cardiac conduction in mice heterozygous null for the Connexin43 gene.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. , (2015).</li><li>Revel, J. P., Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hexagonal+array+of+subunits+in+intercellular+junctions+of+the+mouse+heart+and+liver.">Hexagonal array of subunits in intercellular junctions of the mouse heart and liver.</a> Journal of Cell Biology. 33 (3), 7-12 (1967).</li><li>Huttner, I., Boutet, M., More, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+in+arterial+endothelium.">Gap junctions in arterial endothelium.</a> Journal of Cell Biology. 57 (1), 247-252 (1973).</li><li>Makowski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junction+structures.+II.+Analysis+of+the+x-ray+diffraction+data.">Gap junction structures. II. Analysis of the x-ray diffraction data.</a> Journal of Cell Biology. 74 (2), 629-645 (1977).</li><li>Entz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+Rate+and+Extracellular+Sodium+and+Potassium+Modulation+of+Gap+Junction+Mediated+Conduction+in+Guinea+Pigs.">Heart Rate and Extracellular Sodium and Potassium Modulation of Gap Junction Mediated Conduction in Guinea Pigs.</a> Frontiers in Physiology. 7, 16 (2016).</li><li>Sild, M., Chatelain, R. P., Ruthazer, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+the+quantification+of+motility+in+glia+and+other+morphologically+complex+cells.">Improved method for the quantification of motility in glia and other morphologically complex cells.</a> Neural Plasticity. 2013, 853727 (2013).</li><li>Rhett, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+perinexus:+Sign-post+on+the+path+to+a+new+model+of+cardiac+conduction.">The perinexus: Sign-post on the path to a new model of cardiac conduction.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. , (2013).</li><li>Lang, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+cardiac+chamber+quantification+by+echocardiography+in+adults:+an+update+from+the+American+Society+of+Echocardiography+and+the+European+Association+of+Cardiovascular+Imaging.">Recommendations for cardiac chamber quantification by echocardiography in adults: an update from the American Society of Echocardiography and the European Association of Cardiovascular Imaging.</a> Journal of the American Society of Echocardiography. 28 (1), 1-39 (2015).</li><li>Kawai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left+ventricular+volume+and+ejection+fraction+by+the+axius+auto+ejection+fraction+method:+comparison+with+manual+trace+method+and+visual+assessment+of+ejection+fraction.">Left ventricular volume and ejection fraction by the axius auto ejection fraction method: comparison with manual trace method and visual assessment of ejection fraction.</a> Journal of Cardiology. 49 (3), 125-134 (2007).</li><li>Frederiksen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+utility+of+semi-automated+estimation+of+ejection+fraction+at+the+point-of-care.">Clinical utility of semi-automated estimation of ejection fraction at the point-of-care.</a> Heart, Lung and Vessels. 7 (3), 208-216 (2015).</li><li>Foster, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+ultrasound+instrument+for+in+vivo+microimaging+of+mice.">A new ultrasound instrument for in vivo microimaging of mice.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 28 (9), 1165-1172 (2002).</li><li>Moran, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+imaging+performance+of+high+resolution+ultrasound+scanners+for+preclinical+imaging.">A comparison of the imaging performance of high resolution ultrasound scanners for preclinical imaging.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 37 (3), 493-501 (2011).</li><li>Papademetris, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+3D+left+ventricular+deformation+from+echocardiography.">Estimation of 3D left ventricular deformation from echocardiography.</a> Medical Image Analysis. 5 (1), 17-28 (2001).</li><li>Hosny, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlocking+vendor-specific+tags:+Three-dimensional+printing+of+echocardiographic+data+sets.">Unlocking vendor-specific tags: Three-dimensional printing of echocardiographic data sets.</a> Journal of Thoracic Cardiovascular Surgery. 155 (1), 143-145 (2018).</li><li>Cretoiu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiac+telocytes:+3D+imaging+by+FIB-SEM+tomography.">Human cardiac telocytes: 3D imaging by FIB-SEM tomography.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (11), 2157-2164 (2014).</li><li>Risi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)-induced+movement+of+tropomyosin+on+native+cardiac+thin+filaments+revealed+by+cryoelectron+microscopy.">Ca(2+)-induced movement of tropomyosin on native cardiac thin filaments revealed by cryoelectron microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6782-6787 (2017).</li><li>Dhindwal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cryo-EM-based+model+of+phosphorylation-+and+FKBP12.6-mediated+allosterism+of+the+cardiac+ryanodine+receptor.">A cryo-EM-based model of phosphorylation- and FKBP12.6-mediated allosterism of the cardiac ryanodine receptor.</a> Science Signaling. 10 (480), (2017).</li><li>Reddy, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+cardiac+magnetic+resonance+imaging+with+three-dimensional+electroanatomic+mapping+to+guide+left+ventricular+catheter+manipulation:+feasibility+in+a+porcine+model+of+healed+myocardial+infarction.">Integration of cardiac magnetic resonance imaging with three-dimensional electroanatomic mapping to guide left ventricular catheter manipulation: feasibility in a porcine model of healed myocardial infarction.</a> Journal of the American College of Cardiology. 44 (11), 2202-2213 (2004).</li><li>van Heeswijk, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Self-Navigated+T2+Mapping+for+the+Detection+of+Acute+Cellular+Rejection+After+Orthotopic+Heart+Transplantation.">Three-Dimensional Self-Navigated T2 Mapping for the Detection of Acute Cellular Rejection After Orthotopic Heart Transplantation.</a> Transplant Direct. 3 (4), 149 (2017).</li><li>Valinoti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+patient-specific+models+for+left+atrium+characterization+to+support+ablation+in+atrial+fibrillation+patients.">3D patient-specific models for left atrium characterization to support ablation in atrial fibrillation patients.</a> Magnetic Resonance Imaging. 45, 51-57 (2018).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het algoritme gebruikt seriële afbeelding dilations om te tellen het aantal pixels tussen twee tegengestelde 2D randen in een binaire afbeelding, die in dit geval de scheiding tussen membraan van de perinexus2,3,14 is. Een ruimtelijke derivaat en een vastloper algoritme worden vervolgens gebruikt om te isoleren van de middellijn, gevolgd door een secundaire dilatatie en erosie reeks om hiaten in de middellijn, vergelijkbaar met wat er is gedaan vóór15te vullen. De middenlijn wordt dan gecombineerd met de afbeelding van de dilatatie-uiteindelijk te vertegenwoordigen perinexal breedte als een functie van de afstand vanaf het begin van de scheiding van de rand, in dit geval het einde van de GJ en het begin van de perinexus16.
Vier primaire parameters zijn gebruiker gedefinieerde in een GUI aan het begin van het programma:
<ol><li>Kleurovergang drempel</li>
	<li>Schaal</li>
	<li>Regio van belang bereik</li>
	<li>Start punt selectiemethode (automatisch of handmatig)</li>
</ol>De meest voorkomende mechanisme voor de mislukking van het algoritme is het falen van de middellijn tot de rand van het beeld, dat is hoe het eindpunt voor de vastloper algoritme wordt bepaald. Dergelijke een om kwestie te bevestigen, kan de gebruiker de kleurovergang drempel beschreven in stap 3.3.1, waardoor het programma te selecteren meer punten uit het ruimtelijke afgeleide beeld, waardoor de rekentijd die nodig zijn door de vastloper algoritme zal verhogen. Dit algoritme vereist daarom een compromis tussen snelheid en middenlijn integriteit van de berekening. Het is belangrijk op te merken dat zo lang als alle punten van de middellijn van de ruimtelijke afgeleide, samen met een passende beginpunt, worden geïdentificeerd de ruimtelijke afgeleide drempel geen effect op de rand scheiding meting hebben zal.
Afdrukstand van afbeelding verschijnt bij dilatatie waarden, omdat de kernel in stappen van 90 graden, die een fout voeren verwijdt kunnen als de meerderheid van de regio van belang onder een hoek van 45° met de assen van dilatatie matrices is. Daarom mogelijk de dilatatie telling altijd niet een accurate weergave van de ruimte tussen de randen. Deze beperking door een trigonometrische correctiefactor aan de orde heeft gesteld, maar kan mogelijk worden genegeerd als alle afbeeldingen in een dataset worden uitgelijnd op de dezelfde afdrukstand. Bovendien, voorzichtigheid moet worden gebruikt bij de interpretatie van de resultaten, zoals het is mogelijk dat de sectie vliegtuigen niet perfect loodrecht op de twee membranen zijn. In Figuur 9Bgebruiken we GSW om te suggereren dat de beelden van onze perinexus in-plane werden. Toch is het absoluut noodzakelijk dat steekproefgrootten voldoende groot om vectorafbeeldingsbestanden variaties tussen beelden voor hun rekening zijn. Bovendien, moeten onze perinexal breedte metingen niet worden geïnterpreteerd om te reflecteren in vivo ruimten, maar deze aanpak wordt gebruikt voor het meten van de gemiddelde verschillen in perinexal breedte ten opzichte van sommige interventie of ziekte staat.
De huidige algoritme vereist ook een handmatig getraceerd schets van de randen als input. Het is belangrijk op te merken dat, zolang de schaal correct is ingesteld, ruimtelijke resolutie geen invloed op het algoritme van de metingen heeft, zoals blijkt uit de verschillende resoluties van afbeeldingen in Figuur 6 en een extra met een lage resolutie afbeelding in aanvullende bestand S6. De volgende stap in de verbetering van het algoritme is het verwijderen van menselijke tussenkomst van overzicht generatie samen met een hulpmiddel dat het interessegebied kunt selecteren. Deze functies zou waarschijnlijk verbeteren van de precisie van de meting en beperken gebruiker bias.
Dit computationeel efficiënt algoritme biedt een snellere methode, waarbij ongeveer een vijfde de manuren, kwantificeren van de perinexus met geen detecteerbare sanctie reproduceerbaarheid in vergelijking met de segmentering van de handmatige proces. Bovendien, de segmentering van de handmatige proces maakt gebruik van een meting elke 15 nanometer om te kwantificeren perinexal breedte, die leiden kan tot onder de bemonstering als de scheiding van de membraan van de perinexus aanzienlijk binnen dat 15 nm-bereik veranderen kunt. In tegenstelling, heeft het geautomatiseerde programma een ruimtelijke resolutie gelijk aan die van de beeldvorming modaliteit, in dit geval 2.9 pixels per nanometer langs de lengte van de perinexus, daarom leveren een meer fijn opgelost gemiddelde breedte van de perinexal.
Terwijl de toepassingen op het gebied van cardiale structurele biologie veelbelovend en spannend zijn, zijn van dit algoritme gebruikt niet beperkt tot TEM beelden. Elk veld waarvoor een nauwkeurige, high-resolution meting van twee quasi-parallelle 2D randen kunt maken gebruik van dit algoritme. Het algoritme kan worden gebruikt voor het bijhouden van om het even wat van de rivieroever erosie en overstromingen patronen uit satellietbeelden aan vasculaire ontwikkeling met helderveld of fluorescent microscopie. Een van de meest beloftevolle potentiële toepassingen is op het gebied van cardiologie en het meten van ventriculaire ejectie fractie (EF) met point-of-care cardiale echocardiografie. Op dit moment is de standaard techniek de methode met dubbeldekker van schijven17, hoewel een nieuwere algoritme, AutoEF, momenteel de snijkant EF-kwantificeren methode18,19 is. Voor de methode van de dubbeldekker van schijven, de zaal in kwestie is handmatig getraceerd en gekwantificeerd aan de hand van een gemodificeerde Simpson's methode, waarbij totale volume wordt automatisch berekend door de sommatie van gestapelde elliptische schijven. De belangrijkste beperking met deze methode is dat het alleen de totale oppervlakte van de dwarsdoorsnede van de gewenste kamer, met geen enkele resolutie te identificeren specifieke regio's van belang, terugkeren en ook aanzienlijke menselijke inbreng en expertise kan vereist. De nieuwere methode, AutoEF, identificeert en schetst de rand van het ventrikel met behulp van een 2D speckling algoritme en dan berekent de ventriculaire oppervlakte van de dwarsdoorsnede. Dit proces, heeft terwijl nauwkeurig en efficiënt voor het meten van bruto ventriculaire gebied, ook een soortgelijke inherente beperking van alleen meten van de totale oppervlakte van de dwarsdoorsnede. Dit primaire nadeel beperkt clinici diagnose en de behandeling mogelijkheden. In tegenstelling, het algoritme gepresenteerd in dit manuscript herkent een middellijn en heeft een resolutie gelijk aan de resolutie van de beeldvorming modaliteit te lokaliseren specifieke regio's van belang. Dit is belangrijk omdat echografie scanners met micrometer ruimtelijke resolutie verkrijgbare20,21 zijn, hetgeen impliceert dat dit algoritme gelokaliseerde muur beweging afwijkingen op de resolutie van micrometers detecteren kon in plaats van centimeters. Hoewel deze toepassing experimenteel worden gevalideerd moet, is het een van de meest onmiddellijk veelbelovende toepassingen van dit algoritme. In feite, het kan gemakkelijk worden gecombineerd met de spikkel tracking mogelijkheden van AutoEF of de handmatige sporen gebruikt in handmatige platte grond om hogere resolutie informatie parallel met conventionele EF gegevens te verstrekken.
Zo veelzijdig en die van toepassing zijn als de huidige algoritme is, het werd ontwikkeld voor 2D-afbeeldingen. Zoals beeldtechnologieën verder te verbeteren, is er echter een toenemende vraag naar 3 en 4 D kwantificering technologieën. Daarom is de volgende iteratie van het algoritme te passen dezelfde aanpak, serieel leerstoornissen een binaire beeld, een 3-dimensionaal object, waar automatisch definiëren een middellijn momenteel buiten de mogelijkheden van de huidige beeldbewerkingsprogramma's is. Een dergelijk algoritme zou hebben brede toepassingen zowel klinisch en experimenteel in het cardiale veld alleen, met inbegrip van 3D cardiale echocardiograms22,23, 3D elektronenmicroscopie24,25, 26en 3D magnetische resonantie imaging27,28,29.

Het volgende algoritme werd ontwikkeld voor het meten van de intermembrane afstand tussen de twee structureel gekoppelde cardiomyocytes op het punt dat ze aan de rand van een kloof kruising plaque in een nanodomain genaamd de perinexus1, die van elkaar scheiden betrokken bij ephaptic2,3,4,5te koppelen. In het proces van het analyseren van honderden Transmissie Electronenmicroscopie (TEM) beelden van perinexi met behulp van een handmatige segmentatie methode in een eerdere studie6, was de noodzaak vastgesteld voor een hogere gegevensdoorvoer methode die bemonsterd perinexal breedte in hoger ruimtelijke resolutie met behoud van de nauwkeurigheid van het vorige proces van handmatige segmentatie tijdens handmatige segmentatie, lijnen worden getekend tussenpozen 15 nm, ongeveer loodrecht op de middellijn, om de breedte van de perinexal meten. Het nieuwe algoritme een dikke binaire omtrek van één pixel uit twee parallelle lijnen en seriële afbeelding dilations gebruikt om te tellen van het aantal pixels tussen de twee vliezen. Terwijl afbeelding dilations vaak in een horde van beeld processing toepassingen gebruikt zijn, met inbegrip van contour of rand detectie7,8, dit algoritme dilations gebruikt als een tellen mechanisme. De middellijn is dan vervolgens geïsoleerd met behulp van een vastloper algoritme9 en perinexal breedte is gemeten bij een resolutie over de lengte van de perinexus gelijk is aan de resolutie van de afbeelding. Het verschil in resolutie is in dit geval 1 meting per 15 nm voor handmatige segmentatie en 1 meting per 0.34 nm met de nieuwe algoritme, een 44-fold stijging van de ruimtelijke sampling-frequentie. Deze verhoogde bemonsteringsfrequentie gebeurt in ongeveer 1/5th verder, de tijd die nodig is voor handmatige segmentatie.
Dit algoritme zal worden gebruikt in zijn huidige vorm aan de breedte van de perinexal bij de conventionele 0-150 meten vanaf de rand van een kloof kruising plaque5 (GJ) alsmede binnen een bepaald gebied van belang, waar de perinexus randplateau tussen 30 en 105 nm2 nm , 3 , 10. de verhoogde controlefrequentie vermindert de variabiliteit in individuele perinexus metingen ten opzichte van handmatige segmentatie en aanzienlijk verkort analyse tijd, waardoor voor efficiënte verwerking van grote gegevenssets. Dit programma is echter niet beperkt tot de nanoschaal TEM beelden van cardiale tussenliggende schijven. Dezelfde aanpak kan worden gebruikt om het kwantificeren van vasculaire diameter, ventriculaire ejectie Fractie, of zelfs niet-biologische fenomenen zoals rivier erosie en overstromingen. Dit algoritme is geschikt voor het kwantificeren van de afstand tussen elke twee quasi-parallelle randen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:867px;" width="866">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Touchscreen Monitor</td>
			<td style="width:79px;">Dell</td>
			<td style="width:119px;">S2240T</td>
			<td style="width:453px;">Needs soft-tipped stylus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Desktop</td>
			<td style="width:79px;">Dell</td>
			<td style="width:119px;">Precision T1650</td>
			<td>8GB RAM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Operating System</td>
			<td style="width:79px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;">Windows 7 Enterprise</td>
			<td>64-bit OS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Program platform</td>
			<td style="width:79px;">Mathworks</td>
			<td style="width:119px;">Matlab R2015b</td>
			<td>Program may be incompatible with newer/older versions of Matlab</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying intermembrane distances with serial image dilations

Een onlangs beschreven extracellulaire nanodomain, aangeduid als de perinexus, heeft zijn betrokken bij ephaptic koppeling, die is een alternatief mechanisme voor elektrische geleiding tussen cardiomyocytes. De huidige methode voor de kwantificering van deze ruimte door handmatige segmentatie is traag en heeft lage ruimtelijke resolutie. We ontwikkelden een algoritme die gebruikmaakt van seriële beeld dilations van een binaire overzicht te tellen van het aantal pixels tussen twee tegengestelde 2 dimensionale randen. Dit algoritme minder manuren vereist en een hogere ruimtelijke resolutie heeft dan de handmatige methode met behoud van de reproduceerbaarheid van het handmatige proces. In feite, ervaren en beginnende onderzoekers konden de resultaten van een eerdere studie met dit nieuwe algoritme recapituleren. Het algoritme wordt beperkt door de menselijke input nodig om handmatig een overzicht van de perinexus en rekenkracht voornamelijk bezwaard met een reeds bestaande vastloper algoritme. Het algoritme van hoog-productie mogelijkheden, hoge ruimtelijke resolutie en reproduceerbaarheid maken echter het een veelzijdig en robuust meetgereedschap voor gebruik in een verscheidenheid van toepassingen waarbij de meting van de afstand tussen elke 2-dimensionale (2D ) randen.

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Intermembrane Distances with Serial Image Dilations at JoVE.com

Quantifying Intermembrane Distances with Serial Image Dilations

Kwantificeren van de Intermembrane afstanden met seriële afbeelding Dilations

Het doel van dit algoritme moet continu meet de afstand tussen twee 2-dimensionale randen met behulp van seriële afbeelding dilations en vastloper. Dit algoritme kan worden toegepast op allerlei gebieden zoals cardiale structurele biologie, vasculaire biologie en civiele techniek.

A recently-described extracellular nanodomain, termed the perinexus, has been implicated in ephaptic coupling, which is an alternative mechanism for ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het hart elektrofysiologische veld, over de structuur van de extracellulaire ruimte en cellulaire communicatiemechanismen. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het een hoge doorvoercapaciteit heeft en een verbeterde ruimtelijke bemonsteringsfrequentie. In wezen kunnen we sneller en met meer vertrouwen metingen krijgen dan voorheen.Perinexus identificatie en het oplossen van programma's zijn moeilijk te leren zonder visuele demonstratie, omdat de perinexus is een relatief nieuw gedefinieerde structuur, en het oplossen van problemen kan niet intuïtief zijn voor onderzoekers die niet vertrouwd zijn met MATLAB. Voor grijswaardenafbeeldingen wordt numerieke computersoftware gebruikt om ervoor te zorgen dat geen enkele pixel een intensiteit heeft van meer dan 255 pixels. Open vervolgens onze gekoppelde afbeelding in beeldverwerkingssoftware en zoom in op de perinexus.Het is van cruciaal belang om de perinexus goed te identificeren. De eerste stap is het identificeren van een gap junction plaque, die een gestreepte uitstraling heeft. Dan zoeken we naar twee tegengestelde membranen, in het vlak, tot ongeveer 200 nanometer.Identificeer de gap junction plaque van het pentylaminer structuur. Het begin van de perinexus, is het punt waarop de twee tegengestelde celmembraan bilayers uiteenlopen. Een schaalbalk weergeven in nanometers.De begin- en eindpunten van de perinexuscontour zijn 200 nanometer vanaf het begin van de perinexus. Selecteer vervolgens het gereedschap selectie uit de vrije hand. Klik en sleep, of gebruik een stylus om zorgvuldig te traceren langs het binnenste membraan van een cel, aan het begin van de perinexus, en terug langs het binnenste membraan van de tweede cel.Sluit het geselecteerde gebied door de muisknop los te laten of de stylus op te tillen. Stel vervolgens de lijnbreedte in op één pixel en de voorgrondkleur op de hoogste intensiteitswaarde voor het afbeeldingstype. Zoals wit, voor grijswaardenafbeelding.Maak een getraceerde omtrek uit de selectie en sla de resulterende afbeelding op als bestandstype dat compatibel is met de analysesoftware, zoals JPEG of TIFF. Open indien nodig de analysesoftware voor membraanscheidingsafstand en wijzig de opslaglocaties voor de gegevens en cijfers die moeten worden gegenereerd. Sla het bestand op en sluit het.Voer vervolgens het programma uit. Stel de drempelwaarde voor ruimtelijke afgeleide verloop op de juiste manier in voor de identificatie van de middellijn. Stel de schaal en pixels per lengte van de eenheid in.Stel de ruimtelijke onder- en bovengrenzen in voor het interessegebied, met betrekking tot de rand van de knooppunt van de kloof. Selecteer automatische of handmatige startpuntdetectie. Handmatige startpuntdetectie kan nodig zijn voor onregelmatig gevormde perinexi.Open vervolgens de afbeelding met de omlijning perinexus. Klik en sleep om een vak rond de perinexus te tekenen, met uitzondering van het gesloten uiteinde. Dubbelklik in de getraceerde perinexusomtrek om de afbeelding bij te snijden en de middellijn te identificeren.Als het beginpunt handmatig moet worden geselecteerd, worden een kruishaarcursor en middellijn boven de oorspronkelijke afbeelding weergegeven. Selecteer een punt buiten de perinexus dicht bij het gewenste startpunt om het proces voort te zetten. Zodra het proces is voltooid, bevestigt u dat de middellijn binnen de perinexus blijft en kruist u het beginpunt goed.Bekijk de gegenereerde gegevens en plot de perinexal breedte. Als de middenlijn niet goed is geïdentificeerd en geïsoleerd, opent u de g-mag-afbeeldingsarray om een geschikte verloopdrempel te bepalen. We gebruiken het indexgereedschap om rond de middellijn te klikken en de g-mag array om een idee te krijgen van welke pixel we willen dat het algoritme voor het vinden van de middellijn moet worden geselecteerd.De verloopdrempel moet vervolgens net boven de intensiteitswaarde van die pixels worden ingesteld. Selecteer het indexgereedschap en klik op en rond de middellijn om de indexwaarde weer te geven van de pixels die moeten worden geselecteerd. Stel de drempelwaarde voor ruimtelijke afgeleide verloop in op net boven de indexwaarde en voer het proces opnieuw uit.Als het beginpunt niet correct is gedetecteerd in het geautomatiseerde proces, voert u het programma opnieuw uit met handmatige startpuntdetectie. In dit proces worden handmatige contouren in één pixelstappen verwijd om het aantal pixels tussen de twee randen te tellen. Elke toename wordt toegevoegd aan een werkend beeld om een ruimtederivaat te genereren.De oorspronkelijke omtrek en de middellijn zijn discontinuïteiten in de omvang. Na het isoleren van de middellijn, wordt het verfijnd door dilatatie, erosie, en een pathfinding algoritme. Perinexal breedte wordt gepresenteerd als een functie van afstand tot het begin van de perinexus, of binnen een regio van belang, en als een gemiddelde van beide functies.Naarmate de perinexusoriëntatie veranderde, werden over- of onderschattingen in perinexusbreedte waargenomen, afhankelijk van het dilatatiepatroon. Trigonometrische correctie geproduceerd resultaten sterk gecorreleerd met beelden gedraaid om de perinexus horizontaal oriënteren. Het algoritme is gevalideerd voor verschillende ruimtelijke resoluties, referentie-eenheden en afbeeldingsformaten.Zowel ervaren als onervaren gebruikers traceerden de contouren sneller dan ze handmatig het beeld segmenteerden. En het geautomatiseerde proces had een aanzienlijk grotere ruimtelijke resolutie. Ervaren en onervaren waarnemers nauwkeurig geïdentificeerd significante verschillen in perinexal breedte tussen patiënten met en zonder reeds bestaande atriumfibrilleren.Deze waarnemers identificeerden ook nauwkeurig geen significant verschil tussen absolute breedtes van de hiaatverbinding in de zelfde bevolking. De perinexal en gap junction breedtes waren in overeenstemming met eerdere rapporten. Tijdens het proberen van deze procedure, vergeet niet om uw tijd te nemen met de omtrek, als zelfs kleine afwijkingen van het membraan kan aanzienlijke fouten op deze schaal te produceren.Over het algemeen worstelen personen die nieuw zijn bij deze methode omdat ze niet bekend zijn met de structuur die ze meten, of ze weten niet hoe problemen kunnen worden opgelost om puntidentificatie of middenlijnafwijking te starten. Het zien van deze beeldverwerkingsmethode uitgevoerd is van cruciaal belang. Zoals perinexus identificatie en algoritme het oplossen van problemen zijn moeilijk te leren zonder.En we willen ervoor zorgen dat we kwantificeren wat we zeggen dat we meten. Deze techniek maakt de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van hartgezondheid, om een hogere resolutie kwantificering van vele niveaus van cardiale functie te verkennen. Van nanoschaal, extracellulaire ruimten tot klinische bepaling van ventriculaire efficiëntie of disfunction.Hoewel deze methode werd aangetoond met elektromicroscopie beelden, kan het ook worden toegepast op andere beeldvormingstechnieken, zoals cardiale echocardiografie om de mechanische functie van het hart nauwkeuriger te kwantificeren. Deze methode kan toepassingen vinden in elk beeldvormingsveld omdat het programma de ruimte tussen twee gedefinieerde randen kan meten, als de schaal op de juiste manier is ingesteld en de randen bijna parallel zijn.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

Voorbereiding van de Klacht Matrices voor het kwantificeren van Cellular Contractie

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Het kwantificeren van de mechanische eigenschappen van de Endotheliale Kalende haarvaten met Atomic Force Microscopy

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

Observeren en kwantificeren van fibroblast-gemedieerde Fibrin Gel Compaction

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global ...

Manufacture of Concentrated, Lipid-based Oxygen Microbubble Emulsions by High Shear Homogenization and Serial Concentration

Bereiding van geconcentreerd, lipide-gebaseerde Oxygen Microbellen emulsies door High Shear homogenisering en Serial Concentratie

Gas-filled microbubbles have been developed as ultrasound contrast and drug delivery agents. Microbubbles can be produced by processing surfactants using ...

Hybrid &#181;CT-FMT imaging and image analysis

Hybrid Ãƒâ€šÃ‚ÂµCT-FMT imaging and image analysis

Hybride μCT-FMT beeldvorming en beeldanalyse

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to ...

Custom-designed Laser-based Heating Apparatus for Triggered Release of Cisplatin from Thermosensitive Liposomes with Magnetic Resonance Image Guidance

Maat ontworpen laser gebaseerde Verwarming Apparaten voor gestuurde release van cisplatine van temperatuurgevoelige liposomen met Magnetic Resonance Image Guidance

Liposomes have been employed as drug delivery systems to target solid tumors through exploitation of the enhanced permeability and retention (EPR) effect ...

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

Beeldgeleide, Laser-gebaseerde Fabrication of Vascular-afgeleide microfluïdische Networks

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM)

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy DHM

Kwantificeren van micro-organismen in lage concentraties, met behulp van digitale holografische microscopie (DHM)

Accurately detecting and counting sparse bacterial samples has many applications in the food, beverage, and pharmaceutical processing industries, in ...

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

Een snelle beeld-gebaseerde bacteriële virulentie Assay met behulp van Amoeba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro

Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro

Meso-schaal Particle Image Velocimetry Studies van neurovasculaire stroomt In Vitro

Particle image velocimetry (PIV) is used in a wide variety of fields, due to the opportunity it provides for precisely visualizing and quantifying flows ...