Name: quantifying intermembrane distances with serial image dilations
Uploaded: 2018-09-28T13:30:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Intermembrane Distances with Serial Image Dilations at JoVE.com

Författarna vill tacka Kathy Lowe på Virginia-Maryland College av Veterinary Medicin för beredning och färgning TEM prover. Finansiering: National Institutes of Health R01-HL102298 National Institutes of Health F31-HL140873-01

Obs: Programvaran krävs ImageJ (eller liknande bild-ändra programvara) och Matlab R2015. Användaren kan uppstå kompatibilitetsproblem med andra versioner av Matlab.
1. förbehandling bilder
<ol><li>För alla gråskalebilder, säkerställa maximal intensitetsvärdet från en given bildpunkt är < 255. Detta görs vanligtvis genom att subtrahera värdet 1 från bilden i det anpassade Matlab programmet ”ImageSub.m”, ingår i kompletterande fil S1.</li>
</ol>2. disposition av Perinexus
<ol><li>Beskriva perinexus i ImageJ eller andra bildbehandling programvara.</li>
	<li>Säkerställa att skissera en pixel tjock och är inställd på intensitetsvärdet högsta i en bild (255 i en gråskalebild från 0 till 255).</li>
	<li>Identifiera GJ genom dess pentalaminar struktur11,12, och definiera början av perinexus som den punkt där de två motsatta cellmembranet lipidmonolager avvika, som visas i figur 1A. BEGIN ~ 200 nm från kanten av den GJ, spåra längs det inre membranet av den första cellen och tillbaka längs det inre membranet av den andra cellen. I ImageJ, släppa pennan för att automatiskt stänga dispositionen. Denna konstgjorda avslutande beskärs senare. Obs: Det är viktigt att beskriva perinexus med stor omsorg vid så hög förstoring som möjligt, eftersom även små mis applikationer av dispositionen kan resultera i flera nanometer för fel i den slutliga mätningen.</li>
</ol>3. ställa in algoritm och välja Perinexus av intresse
Obs: Den pathfinding algoritmen kräver autograf, Edge, Graf, nod och Pathfinding funktioner9 att vara i samma katalog som den MembraneSepDist m-fil. Alla filer kan hittas i kompletterande fil S1.
<ol><li>Välj Spara platser för data och diagram. Detta är för närvarande hårdkodade i m-filen. Obs: Den första raden i programmet är en funktion för att rensa alla variabler, Stäng alla fönster och rensa kommandofönstret. Spara alla önskade variabler eller siffror innan du kör m-filen. Obs: Programvaran skärmdumpar ingår i kompletterande fil S2 för alla hårdkodade värden.</li>
	<li>Kör programmet ”MembraneSepDist.m”.</li>
	<li>Ställa in parametrar. Obs: En GUI kommer att dyka upp med standardparametrar för gradient tröskel, skala, regionen av intresse och manuell start. Standardvärdena kan ändras i m-filen, eller de kan ändras för varje enskild bild.<ol>
<li>Inställd rumsliga härledda gradient tröskel. Notera: Högre värden resultera i fler punkter markerade mittlinjen isolerat. Värden som är för högt eller för lågt (utanför en rad cirka 3,0-7,9) kan resultera i computational ineffektivitet eller en oprecis urval av mittlinjen punkter ger oprecisa mittlinjen isolering (se figur 2A-C).</li>
		<li>Ange skala i pixlar/skala enheter.</li>
		<li>Ange de rumsliga lägsta och övre gränserna för regionen av intresse. Obs: Våra laboratoriets konventionen, regionen definierad av intresse är mellan 30 och 105 nm från kanten av GJ2,3,10.</li>
		<li>Ange automatisk/manuell start. I flesta fall upptäcker algoritmen korrekt utgångspunkt var det gap junction slutar och perinexus börjar. Dock i vissa fall av oregelbundet formade perinexi, måste användaren identifiera startpunkten manuellt. Ange värdet 0 för automatisk, 1 för manuella.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Välj önskad bild. Obs: Mappen Välj kan ändras i m-filen.</li>
	<li>Beskära bilden för att välja perinexus av intresse.<ol>
<li>När bilden kommer upp, ändras markören automatiskt till ett hårkors. Beskär bilden genom att dra en ruta runt perinexus av intresse (se figur 3). Beskärningsrutan kan justeras med hjälp av kvadraterna på i hörnen och på sidorna gör den större eller mindre.</li>
		<li>Vid beskärning, säkerställa den ”öppna” änden av perinexus (längst bort från GJ, se figur 3) är beskuren så att två membran konturerna når kanten av den beskurna bilden. Obs: Det rekommenderas att göra bilden full-skärm att lättare se perinexus av intresse och beskära på lämpligt sätt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Välj den slutliga skörden genom att dubbelklicka med markören mellan motsatta kanter skall mätas. Obs: Det är viktigt att dubbelklicka utföras inuti perinexus. Om programmet inte identifierar en mittlinje, starta om programmet och se till att klicka uppstår inom perinexus.</li>
	<li>Observera sista mittlinjen efter alla utspädningar och erosioner pop upp för en slutanvändaren bedömning av programmets effektivitet. Obs: En dialogruta visas på skärmen medan programmet är igång för att informera användaren att Matlab kommer att inte behandla någon ytterligare kommandon tills programmet har avslutats. Hur lång tid detta tar beror på array (bild) storlek och dator processorkraft.</li>
	<li>Om manuell startpunkt är aktiverad, Observera bilden av mittlinjen dyka upp över den ursprungliga anatomiska bilden, tillsammans med ett hårkors markören (se figur 2E). Välj en punkt utanför perinexus nära önskad startpunkt. Obs: Programmet kommer att hitta mittlinjen punkten närmast den valda pixel och använda den som startpunkt.</li>
	<li>Registrera data. Obs: När programmet är klar, programmet kommer tillbaka en mappad mittlinjen, tomt på perinexal bredd som en funktion av avståndet från kanten av GJ. Dessutom, programmet kommer att returnera genomsnittliga perinexal bredd upp till 150 nm från kanten av GJ samt genomsnittliga från inom regionen definierad av intresse på Matlab kommandoraden. Wp värden och avstånd från GJ lagras i variabeln ”WpList” eller användaren kan manuellt registrera dem separat.</li>
</ol>4. algoritm felsökning
<ol><li>Om mittlinjen inte är korrekt identifierade (figur 2A), öppna siffran ”Gmag” och använder Index för att identifiera en lämplig lutning tröskel (figur 2C).</li>
	<li>Om startpunkten inte identifieras korrekt, ange startpunkten manuellt (se protokollet 3.8).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rhett, J. M., Gourdie, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+perinexus:+a+new+feature+of+Cx43+gap+junction+organization.">The perinexus: a new feature of Cx43 gap junction organization.</a> Heart Rhythm. 9 (4), 619-623 (2012).</li><li>Veeraraghavan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+channels+in+the+Cx43+gap+junction+perinexus+may+constitute+a+cardiac+ephapse:+an+experimental+and+modeling+study.">Sodium channels in the Cx43 gap junction perinexus may constitute a cardiac ephapse: an experimental and modeling study.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. , (2015).</li><li>George, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+sodium+dependence+of+the+conduction+velocity-calcium+relationship:+evidence+of+ephaptic+self-attenuation.">Extracellular sodium dependence of the conduction velocity-calcium relationship: evidence of ephaptic self-attenuation.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 310 (9), 1129-1139 (2016).</li><li>Veeraraghavan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+channels+in+the+Cx43+gap+junction+perinexus+modulate+ephaptic+coupling:+an+experimental+and+modeling+study.">Potassium channels in the Cx43 gap junction perinexus modulate ephaptic coupling: an experimental and modeling study.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. , (2016).</li><li>Rhett, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cx43+associates+with+Na(v)1.5+in+the+cardiomyocyte+perinexus.">Cx43 associates with Na(v)1.5 in the cardiomyocyte perinexus.</a> Journal of Membrane Biology. 245 (7), 411-422 (2012).</li><li>Raisch, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercalated+Disc+Extracellular+Nanodomain+Expansion+in+Patients+with+Atrial+Fibrillation.">Intercalated Disc Extracellular Nanodomain Expansion in Patients with Atrial Fibrillation.</a> Frontiers in Physiology. , (2018).</li><li>Yan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+methods+of+automated+quantification+of+gap+junction+distribution+and+interstitial+collagen+quantity+from+animal+and+human+atrial+tissue+sections.">Novel methods of automated quantification of gap junction distribution and interstitial collagen quantity from animal and human atrial tissue sections.</a> PLoS One. 9 (8), 104357 (2014).</li><li>Papari, G., Petkov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+pseudo+dilation+for+gestalt+edge+grouping+and+contour+detection.">Adaptive pseudo dilation for gestalt edge grouping and contour detection.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 17 (10), 1950-1962 (2008).</li><li>George, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+sodium+and+potassium+levels+modulate+cardiac+conduction+in+mice+heterozygous+null+for+the+Connexin43+gene.">Extracellular sodium and potassium levels modulate cardiac conduction in mice heterozygous null for the Connexin43 gene.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. , (2015).</li><li>Revel, J. P., Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hexagonal+array+of+subunits+in+intercellular+junctions+of+the+mouse+heart+and+liver.">Hexagonal array of subunits in intercellular junctions of the mouse heart and liver.</a> Journal of Cell Biology. 33 (3), 7-12 (1967).</li><li>Huttner, I., Boutet, M., More, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+in+arterial+endothelium.">Gap junctions in arterial endothelium.</a> Journal of Cell Biology. 57 (1), 247-252 (1973).</li><li>Makowski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junction+structures.+II.+Analysis+of+the+x-ray+diffraction+data.">Gap junction structures. II. Analysis of the x-ray diffraction data.</a> Journal of Cell Biology. 74 (2), 629-645 (1977).</li><li>Entz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+Rate+and+Extracellular+Sodium+and+Potassium+Modulation+of+Gap+Junction+Mediated+Conduction+in+Guinea+Pigs.">Heart Rate and Extracellular Sodium and Potassium Modulation of Gap Junction Mediated Conduction in Guinea Pigs.</a> Frontiers in Physiology. 7, 16 (2016).</li><li>Sild, M., Chatelain, R. P., Ruthazer, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+the+quantification+of+motility+in+glia+and+other+morphologically+complex+cells.">Improved method for the quantification of motility in glia and other morphologically complex cells.</a> Neural Plasticity. 2013, 853727 (2013).</li><li>Rhett, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+perinexus:+Sign-post+on+the+path+to+a+new+model+of+cardiac+conduction.">The perinexus: Sign-post on the path to a new model of cardiac conduction.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. , (2013).</li><li>Lang, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+cardiac+chamber+quantification+by+echocardiography+in+adults:+an+update+from+the+American+Society+of+Echocardiography+and+the+European+Association+of+Cardiovascular+Imaging.">Recommendations for cardiac chamber quantification by echocardiography in adults: an update from the American Society of Echocardiography and the European Association of Cardiovascular Imaging.</a> Journal of the American Society of Echocardiography. 28 (1), 1-39 (2015).</li><li>Kawai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left+ventricular+volume+and+ejection+fraction+by+the+axius+auto+ejection+fraction+method:+comparison+with+manual+trace+method+and+visual+assessment+of+ejection+fraction.">Left ventricular volume and ejection fraction by the axius auto ejection fraction method: comparison with manual trace method and visual assessment of ejection fraction.</a> Journal of Cardiology. 49 (3), 125-134 (2007).</li><li>Frederiksen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+utility+of+semi-automated+estimation+of+ejection+fraction+at+the+point-of-care.">Clinical utility of semi-automated estimation of ejection fraction at the point-of-care.</a> Heart, Lung and Vessels. 7 (3), 208-216 (2015).</li><li>Foster, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+ultrasound+instrument+for+in+vivo+microimaging+of+mice.">A new ultrasound instrument for in vivo microimaging of mice.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 28 (9), 1165-1172 (2002).</li><li>Moran, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+imaging+performance+of+high+resolution+ultrasound+scanners+for+preclinical+imaging.">A comparison of the imaging performance of high resolution ultrasound scanners for preclinical imaging.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 37 (3), 493-501 (2011).</li><li>Papademetris, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+3D+left+ventricular+deformation+from+echocardiography.">Estimation of 3D left ventricular deformation from echocardiography.</a> Medical Image Analysis. 5 (1), 17-28 (2001).</li><li>Hosny, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlocking+vendor-specific+tags:+Three-dimensional+printing+of+echocardiographic+data+sets.">Unlocking vendor-specific tags: Three-dimensional printing of echocardiographic data sets.</a> Journal of Thoracic Cardiovascular Surgery. 155 (1), 143-145 (2018).</li><li>Cretoiu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiac+telocytes:+3D+imaging+by+FIB-SEM+tomography.">Human cardiac telocytes: 3D imaging by FIB-SEM tomography.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (11), 2157-2164 (2014).</li><li>Risi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)-induced+movement+of+tropomyosin+on+native+cardiac+thin+filaments+revealed+by+cryoelectron+microscopy.">Ca(2+)-induced movement of tropomyosin on native cardiac thin filaments revealed by cryoelectron microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6782-6787 (2017).</li><li>Dhindwal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cryo-EM-based+model+of+phosphorylation-+and+FKBP12.6-mediated+allosterism+of+the+cardiac+ryanodine+receptor.">A cryo-EM-based model of phosphorylation- and FKBP12.6-mediated allosterism of the cardiac ryanodine receptor.</a> Science Signaling. 10 (480), (2017).</li><li>Reddy, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+cardiac+magnetic+resonance+imaging+with+three-dimensional+electroanatomic+mapping+to+guide+left+ventricular+catheter+manipulation:+feasibility+in+a+porcine+model+of+healed+myocardial+infarction.">Integration of cardiac magnetic resonance imaging with three-dimensional electroanatomic mapping to guide left ventricular catheter manipulation: feasibility in a porcine model of healed myocardial infarction.</a> Journal of the American College of Cardiology. 44 (11), 2202-2213 (2004).</li><li>van Heeswijk, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Self-Navigated+T2+Mapping+for+the+Detection+of+Acute+Cellular+Rejection+After+Orthotopic+Heart+Transplantation.">Three-Dimensional Self-Navigated T2 Mapping for the Detection of Acute Cellular Rejection After Orthotopic Heart Transplantation.</a> Transplant Direct. 3 (4), 149 (2017).</li><li>Valinoti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+patient-specific+models+for+left+atrium+characterization+to+support+ablation+in+atrial+fibrillation+patients.">3D patient-specific models for left atrium characterization to support ablation in atrial fibrillation patients.</a> Magnetic Resonance Imaging. 45, 51-57 (2018).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

Algoritmen använder seriell bild utspädningar för att räkna antalet pixlar mellan två motsatta 2D kanter i en binär bild, som i detta fall är mellan membran avskiljandet av perinexus2,3,14. En rumslig derivat och en pathfinding algoritm används sedan för att isolera mittlinjen, följt av en sekundär dilatation och erosion sekvens att fylla luckorna i mittlinjen, liknar vad har gjorts innan15. Mittlinjen kombineras sedan med slutliga dilatation-räkna bilden representera perinexal bredd som en funktion av avståndet från början av kanten separation, i detta fall slutet av GJ och början av perinexus16.
Fyra primära parametrar är användardefinierade i en GUI i början av programmet:
<ol><li>Gradient tröskel</li>
	<li>Skala</li>
	<li>Intresse utbud regionen</li>
	<li>Start punkt urvalsmetod (automatisk eller manuell)</li>
</ol>Den vanligaste mekanismen av misslyckande för algoritmen är mittlinjen misslyckande att nå kanten av bilden, vilket är hur slutpunkten bestäms den pathfinding-algoritmen. För att åtgärda en sådan fråga, kan användaren öka lutningen tröskelvärdet beskrivs i steg 3.3.1, som kommer att orsaka att välja fler punkter ur den rumsliga härledda bild, vilket ökar beräkningstiden krävs av pathfinding algoritmen. Denna algoritm kräver därför en kompromiss mellan uträkningen hastighet och mittlinjen integritet. Det är viktigt att notera att så länge alla punkter i mittlinjen identifieras från rumsliga derivatan, tillsammans med en lämplig startpunkt, rumsliga härledda tröskelvärdet får ingen effekt på kanten separation mätning.
Bildriktning verkar påverka dilatation värden, eftersom kärnan vidgar i 90 graders steg, som kan införa ett fel om majoriteten av regionen av intresse är i vinkel 45° mot axlarna för dilatation matriser. Antalet dilatation kanske därför inte alltid en korrekt representation av utrymmet mellan kanterna. Denna begränsning har behandlats av en trigonometriska korrektionsfaktor, men kunde potentiellt ignoreras om alla bilder i en datamängd är inriktade på samma orientering. Dessutom bör försiktighet användas vid tolkningen av resultaten, eftersom det är möjligt att avsnitt plan inte är helt vinkelrät mot två membran. I figur 9Banvänder vi GJW som tyder på att våra perinexus bilder var i-plan. Ändå är det absolut nödvändigt att urvalsstorlekarna vara tillräckligt stora för snittning variationer mellan bilderna. Våra perinexal bredd mätningar bör dessutom inte tolkas för att återspegla i vivo utrymmen, men detta tillvägagångssätt används för att mäta genomsnittliga skillnader i perinexal bredd i förhållande till vissa ingripande eller sjukdom tillstånd.
Den nuvarande algoritmen kräver också ett manuellt spåra konturerna av kanterna som indata. Det är viktigt att notera att så länge skalan är korrekt inställd, rumslig upplösning har ingen effekt på algoritmens mätningar, vilket framgår av de olika resolutionerna av bilder i figur 6 och en ytterligare lågupplöst bild i kompletterande fil S6. Nästa steg i att förbättra algoritmen är att ta bort mänskligt ingripande från disposition generation tillsammans med ett verktyg som kan välja området av intresse. Dessa funktioner skulle sannolikt förbättra precisionen i mätningen och minska användaren bias.
Detta beräkningsmässigt effektiv algoritm ger en snabbare metod, som kräver cirka en femtedel av mantimmar, att kvantifiera perinexus utan påvisbara påföljd att reproducerbarhet jämfört med manuell segmentering processen. Dessutom manuell segmentering processen använder tredjeparts en mätning varje 15 nanometer för att kvantifiera perinexal bredd, vilket kan leda till under provtagning som membran separation av perinexus kan förändras avsevärt inom 15 nm intervallet. Automatiska programmet har däremot en rumslig upplösning som är lika med bildgivande modalitet, i detta fall 2.9 pixlar per nanometer längs längden av den perinexus, därför att leverera ett mer fint löst genomsnitt av perinexal bredd.
Medan tillämpningarna i fältet av hjärt strukturbiologi är lovande och spännande, är denna algoritm använder inte begränsade till TEM bilder. Alla fält som kräver en exakt, högupplösta mätning av två nästan parallella 2D kanter kan göra användning av denna algoritm. Algoritmen kan användas för att spåra allt från riverbank erosion och översvämning mönster från satellitbilder till kärlbildningsprocessen med brightfield eller fluorescerande mikroskopi. En av de mest lovande användningsmöjligheterna är inom kardiologi och mäta ejektionsfraktion (EF) med point-of-care hjärt ekokardiografi. För närvarande är standardteknik biplan metoden för diskar17, men en nyare algoritm, AutoEF, är för närvarande framkant EF-kvantifiera metod18,19. Biplan metod för diskar, kammaren i fråga spåras manuellt och kvantifieras med en modifierad Simpsons metod, whereby totala volym beräknas automatiskt av summeringen av staplade elliptiska diskar. Den största begränsningen med denna metod är att det kan bara returnera den total tvärsnittsarean på önskad avdelningen, med ingen lösning att identifiera specifika områden av intresse, och kräver också betydande mänskliga input och expertis. Den nya metoden, AutoEF, identifierar och beskriver kanten av ventrikeln med en 2D fläckar algoritm och sedan beräknar ventrikulära tvärsnittsarea. Denna process, har medan exakt och effektiv för att mäta brutto ventrikulära område, också en liknande inneboende begränsning att endast mäta total tvärsnittsarea. Denna primära nackdel begränsar kliniker diagnostik och behandling förmågor. Däremot den algoritm som presenteras i detta manuskript kan identifiera en mittlinjen och har en upplösning som motsvarar upplösningen av bildgivande modalitet att peka ut specifika regioner av intresse. Detta är viktigt eftersom ultraljud skannrar med mikrometer rumslig upplösning är kommersiellt tillgängliga20,21, vilket innebär att denna algoritm kunde upptäcka lokaliserade vägg rörelse avvikelser med upplösning av mikrometrar i stället för centimeter. Medan denna ansökan måste verifieras experimentellt, är det en av de mest lovande tillämpningarna av denna algoritm. I själva verket det kan enkelt kombineras med speckle spårning kapacitet av AutoEF eller manuell tracesna utnyttjas i manuell PLANIMETRI att ge högre upplösning information parallellt med konventionella EF data.
Så mångsidig och tillämpligt eftersom den nuvarande algoritmen är, den utvecklades för 2D-bilder. Dock avbildningstekniker fortsätter att förbättra, finns det en ökande efterfrågan på 3- och 4 D kvantifiering teknik. Nästa iteration av algoritmen är därför att anpassa samma tillvägagångssätt, seriellt dilating en binär bild, till en 3-dimensionella objekt, där automatiskt definiera en mittlinjen är för närvarande utöver funktionerna i nuvarande bildbehandlingsprogram. En sådan algoritm skulle ha brett program både kliniskt och experimentellt i fältet hjärt ensam, inklusive 3D hjärt ekokardiogram22,23, 3D elektronmikroskopi24,25, 26och 3D magnetisk resonanstomografi27,28,29.

Följande algoritm har utvecklats för att mäta intermembrane avståndet mellan två strukturellt kopplade hjärtmuskelcellerna vid den punkt som de separata från varandra vid kanten av en gap junction plack i en nanodomain som kallas perinexus-1, som har varit inblandade i ephaptic koppling2,3,4,5. Håller på att analysera hundratals överföring elektronmikroskopi (TEM) bilder av perinexi med en manuell segmentering metod i en tidigare studie6, identifierades behovet för en högre genomströmning metod som provtas perinexal bredd i högre rumslig upplösning samtidigt bevara riktigheten av den tidigare manuella segmentering processen under manuell segmentering, linjer dras mellanrum 15 nm, ungefärligt ortogonal mot mittlinjen, för att mäta perinexal bredd. Den nya algoritmen tar en en bildpunkt tjock binära skissera av två parallella linjer och använder seriell bild utspädningar för att räkna antalet pixlar mellan de två membran. Medan bilden utspädningar har vanligen använts i en myriad av bild bearbetning applikationer, använder inklusive kontur eller edge detection7,8, denna algoritm utspädningar som en räknande mekanism. Mittlinjen är isolerade med en pathfinding algoritm9 och perinexal bredd mäts sedan med upplösning längs längden av perinexus motsvarar upplösningen på bilden. Skillnaden i upplösning i detta fall är 1 mätning per 15 nm för manuell segmentering och 1 mätning per 0,34 nm med den nya algoritmen, en 44-fold ökning av rumsliga samplingsfrekvens. Dessutom sker detta ökad samplingsfrekvens i ungefär 1/5th den tid som behövs för manuell segmentering.
Denna algoritm används i dess nuvarande form för att mäta perinexal bredd på den konventionella 0-150 nm från kanten av en gap junction plack5 (GJ) samt inom ett specificerat område av intresse, där perinexus platåer mellan 30 och 105 nm2 , 3 , 10. ökad samplingsfrekvensen minskar variabiliteten i enskilda perinexus mätningar jämfört med manuell segmentering och kraftigt förkortar analys tid, vilket möjliggör effektiv hantering av stora datamängder. Detta program är dock inte begränsad till nanoskala TEM bilder av hjärt ortodoxas diskar. Samma tillvägagångssätt kan användas för att kvantifiera vaskulär diameter, ejektionsfraktion eller ens icke-biologiska fenomen som floden erosion eller översvämningar. Denna algoritm är lämpligt för kvantifiering av avståndet mellan två nästan parallella kanter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:867px;" width="866">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Touchscreen Monitor</td>
			<td style="width:79px;">Dell</td>
			<td style="width:119px;">S2240T</td>
			<td style="width:453px;">Needs soft-tipped stylus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Desktop</td>
			<td style="width:79px;">Dell</td>
			<td style="width:119px;">Precision T1650</td>
			<td>8GB RAM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Operating System</td>
			<td style="width:79px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;">Windows 7 Enterprise</td>
			<td>64-bit OS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Program platform</td>
			<td style="width:79px;">Mathworks</td>
			<td style="width:119px;">Matlab R2015b</td>
			<td>Program may be incompatible with newer/older versions of Matlab</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying intermembrane distances with serial image dilations

En nyligen beskrivna extracellulära nanodomain, kallas perinexus, har varit inblandad i ephaptic koppling, som är en alternativ mekanism för elektrisk överledning mellan hjärtmuskelcellerna. Den nuvarande metoden för att kvantifiera detta utrymme genom manuell segmentering är långsam och har låg spatial upplösning. Vi utvecklade en algoritm som använder seriell bild utspädningar av ett binärt disposition för att räkna antalet pixlar mellan två motsatta 2 dimensionell kanter. Denna algoritm kräver färre mantimmar och har en högre spatial upplösning än den manuella metoden samtidigt som den manuella processen reproducerbarhet. I själva verket, erfarna och nybörjare utredare kunde sammanfatta resultaten av en tidigare studie med denna nya algoritm. Algoritmen är begränsad av den mänskliga indata som behövs till manuell disposition i perinexus och beräkningskraft främst översköljas av en redan existerande pathfinding-algoritm. Dock gör algoritmens hög genomströmning kapacitet, hög rumslig upplösning och reproducerbarhet det en mångsidig och robust mätverktyg för användning i en mängd olika tillämpningar som kräver mätning av avståndet mellan någon 2-dimensionell (2D ) kanter.

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Intermembrane Distances with Serial Image Dilations at JoVE.com

Quantifying Intermembrane Distances with Serial Image Dilations

Kvantifiera Intermembrane avstånd med seriell bild utspädningar

Syftet med denna algoritm är att kontinuerligt mäta avståndet mellan två 2-dimensionella kanter använder seriell bild utspädningar och pathfinding. Denna algoritm kan tillämpas på olika områden såsom hjärt strukturbiologi, vaskulär biologi och anläggningsverksamhet.

A recently-described extracellular nanodomain, termed the perinexus, has been implicated in ephaptic coupling, which is an alternative mechanism for ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor i hjärt elektrofysiologfältet, om strukturen hos det extracellulära utrymmet och cellulära kommunikationsmekanismer. Denna teknik främsta fördelar är att den har hög genomströmning kapacitet, och en förbättrad rumslig provtagning frekvens. I huvudsak kan vi få mätningar snabbare och med högre förtroende än tidigare.Perinexus identifiering och felsökning av program är svåra att lära sig utan visuell demonstration, eftersom perinexus är en relativt nyligen definierad struktur, och felsökning kanske inte är intuitivt för utredare som är obekanta med MATLAB. För gråskalebilder använder numeriska datorprogram för att säkerställa att ingen pixel har en intensitet som är större än 255. Öppna sedan upp vår parade bild i bildbehandlingsprogram och zooma in på perinexus.Det är avgörande att korrekt identifiera perinexus. Det första steget är att identifiera en gap junction plakett, som har ett randigt utseende. Sedan letar vi efter två motsatta membran, i plan, ut till cirka 200 nanometer.Identifiera gapet korsningen plakett från det är pentylaminer struktur. Början av perinexus, är den punkt där de två motsatta cellmembran bilayers divergerar. Visa en skalstång i nanometer.Start- och slutpunkterna för perinexus-dispositionen kommer att vara 200 nanometer från början av perinexus. Därefter väljer du markeringsverktyget för frihand. Klicka och dra, eller använd en penna för att noggrant spåra upp längs det inre membranet i en cell, till början av perinexus, och tillbaka längs den inre membranet i den andra cellen.Stäng det markerade området genom att släppa musknappen eller lyfta tangenten. Ställ sedan in linjebredden på en bildpunkt, och förgrundsfärgen till det högsta intensitetsvärdet för bildtypen. Såsom vit, för gråskalebild.Skapa en spårad disposition från markeringen, och spara den resulterande bilden som en filtyp som är kompatibel med analysprogramvaran, till exempel JPEG eller TIFF. Om det behövs, öppna programvaran för analys av membranavskiljningsavstånd, och ändra sparplatserna för de data och siffror som ska genereras. Spara filen och stäng den.Kör sedan programmet. Ange den rumsliga derivatlutningströskeln på lämpligt sätt för centerlinjeidentifiering. Ange skalan och pixlar per enhetslängd.Ställ in de rumsliga nedre och övre gränserna för regionen av intresse, med avseende på kanten av gapet korsningen. Välj antingen automatisk eller manuell identifiering av startpunkt. Manuell detektering av startpunkten kan vara nödvändig för oregelbundet formad perinexi.Öppna sedan bilden med den skisserade perinexus. Klicka och dra för att rita en ruta runt perinexus, exklusive den stängda änden. Dubbelklicka inuti den spårade perinexus konturen för att beskära bilden och identifiera mittlinjen.Om startpunkten ska väljas manuellt en hårkors markör och mittlinje kommer att visas över den ursprungliga bilden. Välj en punkt utanför perinexus nära önskad utgångspunkt för att fortsätta processen. När processen är klar, bekräfta att mittlinjen stannar inom perinexus, och korrekt skär startpunkten.Granska de genererade data och rita perinexal bredd. Om mittlinjen inte identifierades och isolerades på rätt sätt öppnar du avbildningsarrayen g-mag för att fastställa ett lämpligt tröskelvärde för övertoning. Vi använder indexverktyget för att klicka runt mittlinjen, och g-mag-arrayen för att få en uppfattning om vilken pixel vi vill att centerlinjen hitta algoritm för att välja.Övertoningströskeln bör då ställas in precis ovanför intensitetsvärdet för dessa pixlar. Välj indexverktyget, och klicka på och runt mittlinjen för att visa indexvärdet för de pixlar som ska väljas. Ställ in tröskelvärdet för spatial derivatlutning till strax över indexvärdet, och kör processen igen.Om startpunkten inte upptäcktes korrekt i den automatiserade processen kör du programmet igen med hjälp av manuell identifiering av startpunkt. I den här processen är manuella konturer vidgade i en bildpunktssteg för att antalet pixlar ska räknas mellan de två kanterna. Varje ökning läggs till en fungerande bild för att generera ett spatialt derivat.Den ursprungliga konturen och mittlinjen är diskontinuiteter i sin storleksordning. Efter att ha isolerat mittlinjen förfinas den genom dilation, erosion och en pathfinding-algoritm. Perinexal bredd presenteras som en funktion av avstånd från början av perinexus, eller inom en region av intresse, och som ett genomsnitt av båda dessa funktioner.Som perinexus orientering förändrats, över-eller underskattningar i perinexus bredd observerades, beroende på dilation mönster. Trigonometric korrigering gav resultat starkt korrelerade med bilder roteras för att orientera perinexus horisontellt. Algoritmen validerades för olika rumsliga upplösningar, referensenheter och bildstorlekar.Både erfarna och oerfarna användare spårade konturen snabbare än de manuellt segmenterade bilden. Och den automatiserade processen hade betydligt större rumslig upplösning. Erfarna och oerfarna observatörer identifierade exakt signifikanta skillnader i perinexal bredd mellan patienter med och utan befintligt förmaksflimmer.Dessa observatörer identifierade också exakt ingen signifikant skillnad mellan absoluta mellanrumspunktbredder i samma population. Den perinexal och gap junction bredder var förenligt med tidigare rapporter. Medan du försöker detta förfarande, kom ihåg att ta din tid med konturerna, som även små avvikelser från membranet kan producera betydande fel i denna skala.Generellt individer som är nya för denna metod kamp eftersom de är obekanta med den struktur de mäter, eller de är osäkra på hur man felsöker problem för att starta punkt identifiering eller centrum linje avvikelse. Att se den här bildbehandlingsmetoden som utförs är avgörande. Som perinexus identifiering och algoritm felsökning är svårt att lära sig utan den.Och vi vill se till att vi kvantifierar vad vi säger att vi mäter. Denna teknik banar väg för forskare inom hjärthälsa, att utforska högre upplösning kvantifiering av många nivåer av hjärtfunktion. Från nanoskala, extracellulära utrymmen till klinisk bestämning av ventrikulär effektivitet eller disfunction.Även om denna metod har visats med elektromikrososkopi bilder, kan det också tillämpas på andra bildframställning tekniker, såsom hjärt ekokardiografi för att mer exakt kvantifiera den mekaniska funktionen av hjärtat. Den här metoden kan hitta program i alla bildfält eftersom programmet kan mäta utrymmet mellan två definierade kanter, om vågen är inställd på lämpligt sätt och kanterna är nästan parallella.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

Beredning av Klagomål Matriser för kvantifiering Cellular Sammandragning

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Kvantifiering De mekaniska egenskaperna hos den endoteliala glykokalyx med atomkraftsmikroskopi

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

Observera och kvantifiera Fibroblastmedierad Fibrin Gel Compaction

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global ...

Manufacture of Concentrated, Lipid-based Oxygen Microbubble Emulsions by High Shear Homogenization and Serial Concentration

Tillverkning av Koncentrerad, Lipid-baserade Oxygen mikrobubblor Emulsioner av hög Shear Homogenisering och Serial Koncentration

Gas-filled microbubbles have been developed as ultrasound contrast and drug delivery agents. Microbubbles can be produced by processing surfactants using ...

Hybrid &#181;CT-FMT imaging and image analysis

Hybrid Ãƒâ€šÃ‚ÂµCT-FMT imaging and image analysis

Hybrid μCT-FMT bildbehandling och bildanalys

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to ...

Custom-designed Laser-based Heating Apparatus for Triggered Release of Cisplatin from Thermosensitive Liposomes with Magnetic Resonance Image Guidance

Skräddarsydda laserbaserade uppvärmningsanordning för utlöst Release av cisplatin från värmekänsliga liposomer med magnetresonanstomografi Vägledning

Liposomes have been employed as drug delivery systems to target solid tumors through exploitation of the enhanced permeability and retention (EPR) effect ...

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

Bildstyrd, laserbaserade Tillverkning av Vascular-härledda Mikroflödes Networks

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM)

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy DHM

Kvantifiera mikroorganismer vid låga koncentrationer använder digitala holografisk mikroskopi (DHM)

Accurately detecting and counting sparse bacterial samples has many applications in the food, beverage, and pharmaceutical processing industries, in ...

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

En snabb Image-baserad bakteriell virulens analys med hjälp av amöba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro

Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro

Meso-Scale Particle Image Velocimetry studier av neurovaskulära flödar In Vitro

Particle image velocimetry (PIV) is used in a wide variety of fields, due to the opportunity it provides for precisely visualizing and quantifying flows ...