Name: fabricating a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel
Uploaded: 2018-10-13T14:30:00
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作者希望在干细胞与再生医学研究所和西北贝洛奥里藏特的加维成像实验室获得认可。他们还要承认国家卫生补助金研究所、UH2/UH3 TR000504 (h·) 和 DP2DK102258 (Y.Z.)、NIH T32 培训补助金 DK0007467 (R.J.N.) 的财政支助, 以及西北肾脏中心不受限制的礼物。肾脏研究所。

在器官采购组织协会制定的道德准则的指导下, 贝洛奥里藏特西北隔离了人类肾脏。本议定书遵循华盛顿大学所概述的动物保育和细胞培养指南。
1. 人体肾脏组织的制备
<ol><li>去细胞溶液的制备<ol>
<li>消毒5000毫升烧杯和 70 x 10 毫米搅拌棒。</li>
		<li>混合 1:1000 (重量: 体积) 烷基硫酸钠 (SDS) 在蒸压去离子水在烧杯中。将溶液放在搅拌板上, 大约 200 rpm, 24 h 或直到 SDS 完全溶解。...

矩阵提供了控制细胞行为的重要机械和化学线索。合成水凝胶能够支持复杂的3维图形, 但未能提供生理基质微环境中发现的各种细胞外线索。源自原生 ECM 的水凝胶是体内和体外研究的理想材料。以前的研究使用脱细胞 ECM 水凝胶涂层合成生物材料, 以防止宿主免疫反应33,34, 区分干细胞35,36,</s...

细胞外基质 (ECM) 提供重要的生物物理和生化线索, 以维持组织稳态。复杂的分子组成调节组织的结构和功能性质。结构蛋白为细胞提供了空间意识, 并允许粘附和迁移1。束缚配体与细胞表面受体相互作用以控制细胞行为2。肾脏 ECM 含有大量的分子, 其组成和结构根据解剖位置、发育阶段和疾病状态3,4而变化。综述的复杂性是研究肾源性细胞体外的一个关键方面。
以往复制 ECM 微环境的尝试都专注于 decellularizing 整个组织, 以创建能够 recellularization 的支架。去细胞已使用化学洗涤剂, 如烷基硫酸钠 (SDS) 或非离子洗涤剂进行, 它利用整个器官灌注或浸泡和搅拌方法5,6,7 ,8,9,10,11,12,13。这里提供的支架保存在本组织 ECM 中发现的结构和生化线索;此外, 与捐助者特定细胞的 recellularization 在重建手术中具有临床意义14、15、16、17、18、 19. 然而, 这些脚手架缺乏结构灵活性, 因此与用于体外研究的许多现有设备不相容。为了克服这一局限性, 许多集团已进一步处理脱细胞 ECM 到水凝胶20,21,22,23,24。这些水凝胶与注射成型和 bioink 兼容, 可绕过脱细胞支架放置在细胞上的微米尺度空间约束。此外, 在原生 ECM 中发现的分子组成和比值保持3,25。在这里, 我们演示了一种制备从肾脏皮层 ECM (kECM) 的水凝胶的方法。
本议定书的目的是产生一个水凝胶, 复制肾脏皮质区的微环境。肾皮质组织在 1% SDS 溶液中脱细胞, 在恒定搅动下去除细胞物质。SDS 通常用于 decellularize 组织, 因为它能够快速去除免疫细胞材料6,7,9,26。然后 kECM 的机械均质化和冻干5、6、9、11、26。在强酸与胃蛋白酶的增溶导致最终的水凝胶库存溶液20,27。对结构支持和信号传导非常重要的原生 kECM 蛋白保留3、25。水凝胶也可以在原生人肾皮质28、29、30的一级范围内胶体。该基质提供了一种生理环境, 用于维持肾脏特定细胞的平静与其他基质蛋白的水凝胶相比。此外 , 矩阵组合物可以纵 , 例如 , 通过添加胶原 I , 模型疾病环境的研究肾脏纤维化和其他肾脏疾病31,32。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Preparation of Kidney Tissue</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5000 mL Beaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z740589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclaved DI H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Bar (70 x 10 mm)</td>
			<td>Fisher Science</td>
			<td>14-512-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Vacuum Filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97066-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS6795420D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Beaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS10031L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4642</td>
			<td>Any similar forceps may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor-Handle Hemostat Clamp</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z168866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z265977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle, No. 4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25859-000</td>
			<td>Any similar scalpel handle may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade, No. 20</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25860-020</td>
			<td>Any similar scalpel blade may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Bar (38.1 x 9.5 mm)</td>
			<td>Fisher Science</td>
			<td>14-513-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent Underpad</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82020-845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish (150 x 25 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclavable Biohazard Bag</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14220-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainer (40 um)</td>
			<td>Fisher Science</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30529.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL Freestanding Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89012-778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fabrication of ECM Gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Homogenizer Machine</td>
			<td>Polytron</td>
			<td>PCU-20110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze Dryer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7670520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL Glass Scintillation Vials and Cap</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V7130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Bar (15.9 x 8 mm)</td>
			<td>Fisher Science</td>
			<td>14-513-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from Porcine Gastric Mucosa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.01 N HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td>Dilute to 0.01 N HCl with cell culuture water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kidney ECM Gelation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 N NaOH (Sterile)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>415413</td>
			<td>Dilute to 1 N in cell culture grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tube</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11330.032</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Transferrin, Selenium, Sodium Pyruvate Solution (ITS-A) 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>51300-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z192325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspatula</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z193208</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabricating a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel

细胞外基质 (ECM) 提供重要的生物物理和生化线索, 以维持组织稳态。目前的合成水凝胶为体外细胞培养提供了强有力的机械支撑, 但缺乏必要的蛋白质和配体成分, 从而引起细胞的生理行为。本手稿描述了一种肾脏皮质 ECM 衍生的水凝胶的制备方法, 具有适当的机械鲁棒性和辅助生化成分。水凝胶是由机械均匀化和增溶脱细胞人肾皮质 ECM 制备而成。基质保留了原生肾皮质 ECM 蛋白比值, 同时也使凝胶化对生理机械刚度。水凝胶作为基质, 可在生理条件下维持肾脏皮层衍生细胞。此外 , 水凝胶的组成可以纵 , 以建立一个病态的环境 , 使未来的肾脏疾病的研究。

kECM 水凝胶为肾脏细胞培养提供了基质, 其化学成分与原生肾脏微环境相似。为了制造水凝胶, 肾脏皮层组织与整个肾脏器官和切块 (图 1) 机械隔离。去细胞使用化学洗涤剂 (图 2A1-3), 然后用水冲洗去除洗涤剂颗粒 (图 2A. 4-6) 产生孤立的肾脏皮质 ECM。组织学评估证实了典型的基底层...

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Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

在这里, 我们提出一个协议, 制造一个肾脏皮层胞外基质衍生的水凝胶保留原生肾脏细胞外基质 (ECM) 结构和生化成分。介绍了制造工艺及其应用。最后, 讨论了利用该水凝胶支持肾脏特异细胞和组织再生和生物工程的观点。

肾皮质细胞外基质衍生水凝胶的制备

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

此方法可以帮助回答生物材料领域的关键问题，例如细胞基质相互作用如何影响硫酸盐。该技术的主要优点是，它产生第一种材料，准确反映原生肾皮层生化微环境。用垫下线组织培养罩。将一升烧杯内有搅拌棒、150毫米无菌组织培养皿，以及整个肾脏放入护罩中。用 500 毫升 1%SDS 溶液填充烧杯。将肾脏放在无菌组织培养皿中。用手术刀在肾胶囊周围轻轻剃须，去除所有脂肪。然后，在肾脏的上端做一个8到10厘米的浅切口，在不损害底层皮层组织的情况下打破开肾胶囊。使用两个下夹去除肾胶囊，将其从皮层组织剥离。使用手术刀沿着肾脏的侧侧沿冠面切除肾脏。用手术刀雕刻出乳腺区域，将皮层组织从两半分离出来。然后，将皮层组织切成0.5厘米的立方体，并去除任何大而可见的血管。要将细胞外基质与肾脏分离，请将切碎的皮层组织放入含有 SDS 溶液的烧杯中。用自 <3>克拉德铝箔盖住烧杯，并在组织培养罩外以大约 400 RPM 的转速将烧杯放在搅拌板上。搅拌24小时后，将烧杯放入组织培养罩中。加入一个40微米无菌细胞过滤器，用尼龙网制成。然后，用200毫升漂白剂填充单独的1000毫升烧杯，并放在组织培养罩中。通过细胞过滤器将 SDS 溶液放入含有漂白剂的烧杯中。移出任何剩余的SDS溶液，直到只有脱细胞组织和细胞过滤器留在烧杯中。将细胞过滤器留在烧杯中，加入 500 毫升的新鲜 SDS 溶液。用相同的铝箔盖住烧杯，以与以前相同的速度放在搅拌板上。去细胞化和洗涤后，将脱细胞组织（称为肾脏 ECM）从这一点转移到 30 毫升自立锥形管中。并填充细胞培养等级的水，直到所有的组织被淹没。首先，使用组织均质器在锥形管中均匀化肾脏 ECM 两分钟，直到获得不透明溶液，且未获得可见的 ECM 片段。然后，将含有肾脏 ECM 的锥形管淹没在液氮中，直到管周围沸腾不再持续。将肾脏 ECM 在零下 4 摄氏度过夜。要冻干冷冻的去细胞组织，稍微松开锥形管盖，以允许气体交换，并放置管到冻干机。使肾脏 ECM 发干三天，或直到它像一个精细的白色粉末。要对凝胶进行化学消化和溶解，请将仔细称量的猪胃肽和0.01普通盐酸加入含有搅拌棒的闪烁中。在大约 500 RPM 时搅拌，直到所有辣椒溶解。然后，将冻干肾 ECM 转移到闪烁的卑鄙中，以大约 500 RPM 的搅拌板将溶液留在搅拌板上三天，使库存的肾 ECM 水凝胶。在组织培养罩中，将所需的细胞培养基，一个正常的氢氧化钠和M199补充剂，放入无菌的30毫升自立锥形管中。将中和试剂溶液与微铲混合。使用无菌的一毫升注射器将适当体积的库存肾 ECM 水凝胶转移到中和试剂溶液中。使用微铲轻轻混合溶液，直到获得均匀的颜色、水凝胶溶液。通过缓慢而轻柔地搅拌，避免引入气泡。为了将细胞整合到肾脏 ECM 水凝胶中，请将 30 万个细胞重新用于 10 微升介质中，用于每个水凝胶。将10微升细胞悬浮液放入最终肾 ECM 凝胶中。用微铲搅拌溶液，直到细胞均匀分布。使用一毫升注射器用肾脏 ECM 水凝胶填充所需的细胞培养装置。在将细胞转移到细胞培养装置中的肾脏 ECM 之前，让凝胶在 37 摄氏度下设置一小时。通过质谱法对去细胞化皮层组织进行分析，揭示了与罗勒-IVina相关的蛋白质的存在，其中胶原蛋白-IV和胶原蛋白-I是代表最多的。胶原蛋白-IV、A1和 A2链，在所有地下室膜中随处可见，都得到保护。胶原蛋白-IV、A3和 A5链也只存在于球状的地下室膜中。还检测到拉米宁和胶原蛋白-I的常见异构形式。人类肾脏肾膜内皮细胞，或HKMECs，培养在胶原蛋白-I，肾脏ECM和1：1混合物凝胶，显示表型的差异。HKMEC 在胶原蛋白 I 上培养，显示统一的 CD31 表情，以红色显示。虽然香港MEC在两种含有肾脏 ECM 的凝胶上培养，但分布不均时显示的 CD31 表达减少。矩阵类型似乎不会影响 VWF 表达式，以绿色显示。在尝试此程序时，重要的是要记住完全均匀化的肾皮层组织。此外，当将凝胶与中和试剂混合时，避免引入气泡。微生理系统允许在受控的实验室环境中研究器官功能。创建此类系统需要实现细胞、矩阵和刺激。这里制造的凯美金水凝胶，将使我们能够研究这种系统，重新概括肾脏微环境。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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科研

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