Name: fabricating a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel
Uploaded: 2018-10-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel at JoVE.com

De auteurs wil erkennen de Lynn en Mike Garvey Imaging laboratorium op het Instituut voor regeneratieve geneeskunde, stamcel en LifeCenter NorthWest. Zij wil ook de financiële steun van de National Institutes of Health subsidies, UH2/UH3 TR000504 (naar J.H.) en DP2DK102258 (voor Y.Z.), NIH T32 opleiding subsidie DK0007467 (R.J.N.) en een onbeperkte geschenk van de Northwest nier centra aan de Nier onderzoek instituut.

Menselijke nieren waren geïsoleerd door LifeCenter Northwest na ethische richtsnoeren die door de vereniging van orgel aanbestedingen organisaties. Dit protocol volgt dierlijke zorg en cel cultuur richtsnoeren door de Universiteit van Washington.
1. bereiding van menselijke nierweefsel
<ol><li>Bereiding van de oplossing van de decellularization<ol>
<li>Steriliseren een 5000 mL-bekerglas en een roer-bar van 70 x 10 mm.</li>
		<li>Meng 1:1000 (gewicht: volume) natrium dodecyl sulfaat (SDS) in...

Matrices bieden belangrijke mechanische en chemische signalen die cel gedrag. Synthetische hydrogels kunnen ondersteunen complexe 3-dimensionale patronen, maar niet aan de uiteenlopende extracellulaire aanwijzingen gevonden in fysiologische matrix microenvironments geven. Hydrogels afgeleid van inheemse ECM zijn ideale materialen voor zowel in vivo en in vitro studies. Eerdere studies hebben gebruikt decellularized ECM hydrogels jas synthetische biomaterialen om te voorkomen dat de host immunologische r...

Extracellulaire matrix (ECM) biedt belangrijke biofysische en biochemische signalen te handhaven van de weefsel homeostase. De complexe moleculaire samenstelling regelt zowel structurele en functionele eigenschappen van weefsel. Structurele proteïnen cellen voorzien van ruimtelijke bewustzijn en zorgen voor de hechting en migratie1. Afhankelijke liganden interactie met cel oppervlakte receptoren waarmee cel gedrag2. Nier ECM bevat een overvloed aan moleculen waarvan de samenstelling en structuur hangt af van de anatomische locatie, ontwikkelingsstadium en ziekte staat3,4. De complexiteit van ECM Recapitulerend is een belangrijk aspect bij het bestuderen van de nier-afgeleide cellen in vitro.
Eerdere pogingen om het repliceren van de ECM microenvironments hebben gericht op decellularizing hele weefsel maken steigers staat recellularization. Decellularization is uitgevoerd met chemische schoonmaakmiddelen zoals natrium dodecyl sulfaat (SDS) of niet-ionogene schoonmaakmiddelen, en het maakt gebruik van beide hele orgel perfusie of onderdompeling en agitatie methoden5,6,7 ,8,9,10,11,12,13. De steigers die hier gepresenteerd behouden de signalen van het structurele en biochemische gevonden in native weefsel ECM; Bovendien, recellularization met donor-specifieke cellen heeft klinische relevantie van reconstructieve chirurgie14,15,16,17,18, 19. echter deze steigers ontbreken van structurele flexibiliteit en zijn daarom niet compatibel met vele huidige apparaten die worden gebruikt voor in vitro studies. Om deze beperking te overwinnen, hebben vele groepen decellularized ECM verder verwerkt tot hydrogels20,21,22,23,24. Deze hydrogels zijn compatibel met spuitgieten en bioink en micrometer schaal ruimtelijke beperkingen die decellularized steigers plaats op cellen te omzeilen. Bovendien zijn moleculaire samenstelling en ratio's gevonden in native ECM3,25bewaard. Hier tonen we een methode om een hydrogel afgeleid van nier cortex ECM (kECM).
Het doel van dit protocol is voor de productie van een hydrogel die de communicatie van de corticale nier-regio repliceert. Cortex nierweefsel is decellularized in een oplossing van de SDS 1% onder constante agitatie verwijderen van cellulaire zaak. SDS wordt vaak gebruikt voor decellularize weefsel vanwege de mogelijkheid om snel te verwijderen immunologische cellulaire materiële6,7,9,26. De kECM is vervolgens onderworpen aan mechanische homogenisering en lyofilisatie5,6,9,11,26. Solubilisatie in een sterk zuur met pepsine resulteert in een definitieve hydrogel stockoplossing20,27. Inheemse kECM eiwitten die belangrijk voor structurele zijn steun en signaal transductie3,25worden bewaard. De hydrogel kan ook worden gegeleerde naar binnen één orde van grootte van inheemse menselijke nieren cortex28,29,30. Deze matrix biedt een fysiologische omgeving die is gebruikt om de onbeweeglijkheid van nier-specifieke cellen in vergelijking met hydrogels van andere matrix-proteïnen. Bovendien, matrix samenstelling kan worden gemanipuleerd, bijvoorbeeld door de toevoeging van collageen-I model ziekte omgevingen voor de studie van de renale fibrose en andere nier ziekten31,32.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Preparation of Kidney Tissue</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5000 mL Beaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z740589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclaved DI H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Bar (70 x 10 mm)</td>
			<td>Fisher Science</td>
			<td>14-512-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Vacuum Filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97066-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS6795420D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Beaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS10031L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4642</td>
			<td>Any similar forceps may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor-Handle Hemostat Clamp</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z168866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z265977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle, No. 4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25859-000</td>
			<td>Any similar scalpel handle may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade, No. 20</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25860-020</td>
			<td>Any similar scalpel blade may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Bar (38.1 x 9.5 mm)</td>
			<td>Fisher Science</td>
			<td>14-513-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent Underpad</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82020-845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish (150 x 25 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclavable Biohazard Bag</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14220-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainer (40 um)</td>
			<td>Fisher Science</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30529.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL Freestanding Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89012-778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fabrication of ECM Gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Homogenizer Machine</td>
			<td>Polytron</td>
			<td>PCU-20110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze Dryer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7670520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL Glass Scintillation Vials and Cap</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V7130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Bar (15.9 x 8 mm)</td>
			<td>Fisher Science</td>
			<td>14-513-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from Porcine Gastric Mucosa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.01 N HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td>Dilute to 0.01 N HCl with cell culuture water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kidney ECM Gelation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 N NaOH (Sterile)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>415413</td>
			<td>Dilute to 1 N in cell culture grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tube</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11330.032</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Transferrin, Selenium, Sodium Pyruvate Solution (ITS-A) 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>51300-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z192325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspatula</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z193208</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabricating a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel

Extracellulaire matrix (ECM) biedt belangrijke biofysische en biochemische signalen te handhaven van de weefsel homeostase. Huidige synthetische hydrogels bieden robuuste mechanische ondersteuning voor in vitro cultuur van de cel, maar gebrek aan de nodige eiwitten en ligand samenstelling om te ontlokken fysiologische gedrag uit cellen. Dit manuscript wordt een fabricage methode voor een nier cortex ECM-afgeleide hydrogel beschreven met goede mechanische robuustheid en ondersteunende biochemische samenstelling. De hydrogel is vervaardigd door mechanisch homogenisatie en solubilizing decellularized menselijke nieren cortex ECM. De matrix behoudt inheemse nier cortex ECM eiwit ratio's, maar ook het inschakelen van gelering aan fysiologische mechanische stiffnesses. De hydrogel fungeert als een substraat op welke nier cortex-afgeleide cellen onder fysiologische omstandigheden kunnen worden gehandhaafd. Bovendien kan de hydrogel samenstelling worden gemanipuleerd om het model van een zieke omgeving waarmee de toekomstige studie van nierziekten.

De kECM hydrogel biedt een matrix voor cultuur van de cel van de nier met dezelfde chemische samenstelling als de inheemse nier-communicatie. Om de hydrogel, is cortex nierweefsel mechanisch geïsoleerd uit een hele nier orgel en in blokjes gesneden (Figuur 1). Decellularization met een chemische schoonmaakmiddel (figuur 2A.1-A.3) gevolgd door spoelen met water om detergent deeltjes (figuur 2...

Watch this Scientific Journal Video about Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel at JoVE.com

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Hier presenteren we een protocol om een nier cortex extracellulaire matrix afkomstige hydrogel te behouden van de inheemse nier extracellulaire matrix (ECM) structurele en biochemische samenstelling. Het fabricageprocédé en de toepassingen daarvan worden beschreven. Tot slot, een perspectief over het gebruik van deze hydrogel ter ondersteuning van de nier-specifieke cellulaire en weefsels regeneratie en bioengineering wordt besproken.

Fabriceren van een nier Cortex extracellulaire Matrix afkomstige Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van biomaterialen, zoals hoe celmatrix interacties van invloed zijn op sulfaat. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het genereert het eerste materiaal dat nauwkeurig weerspiegelt de inheemse nierschors biochemische micro-omgevingen. Lijn een weefselkweekkap met een onderstootkussen.Plaats een een liter beker met een roerstaaf, een 150 millimeter steriele weefsel cultuur schotel, en de hele nier in de kap. Vul het bekerglas met 500 milliliter van 1%SDS oplossing. Plaats de nier in de steriele weefselkweekschotel.Verwijder alle perirenal vet door licht scheren rond de niercapsule met een scalpel. Maak vervolgens een ondiepe incisie van acht tot tien centimeter over het superieure uiteinde van de nier, om de niercapsule open te breken zonder het onderliggende cortexweefsel te beschadigen. Gebruik twee hemostatklemmen om de niercapsule te verwijderen door deze weg te pellen van het cortexweefsel.Doorsnijd de nier langs het coronale vlak met behulp van de scalpel langs de zijkant van de nier. Isoleer cortexweefsel uit beide helften door het medullar-gebied uit te snijden met de scalpel. Vervolgens, dobbelstenen de cortex weefsel in 0,5 centimeter in blokjes gesneden stukken, en verwijder alle grote, zichtbare vaten.Om extracellulaire matrix van de nier te isoleren, plaatst u het in blokjes gesneden cortexweefsel in het bekerglas met SDS-oplossing. Bedek het bekerglas met autoclaved aluminiumfolie en plaats het op een roerplaat bij ongeveer 400 RPM, buiten de weefselkweekkap. Na 24 uur roeren, breng het bekerglas in een weefsel cultuur kap.Voeg een 40 micron steriele cel zeef gemaakt met nylon mesh. Vul dan een aparte bekerglas van 1000 milliliter met 200 milliliter bleekmiddel en plaats het in de weefselkweekkap. Gooi de SDS-oplossing via de celzeef in het bekerglas met bleekmiddel.Pipet uit de resterende SDS-oplossing, totdat alleen gedecellulariseerd weefsel en de celzeef blijven in het bekerglas. Laat de celzeef in het bekerglas en voeg 500 milliliter verse SDS-oplossing toe. Bedek het bekerglas met dezelfde aluminiumfolie en plaats op dezelfde snelheid als voorheen op een roerplaat.Na decellularisatie en wassen, breng het gedecellulariseerde weefsel, aangeduid als nier ECM vanaf dit punt, in een 30 milliliter zelfstandige conische buis. En vul het met water van celkweekkwaliteit, totdat al het weefsel onder water staat. Gebruik eerst een weefselhomogenisator om de nier-ECM gedurende twee minuten in de conische buis te homogeniseren, totdat een ondoorzichtige oplossing zonder zichtbare stukjes ECM is verkregen.Vervolgens dompel de conische buis met de nier ECM in vloeibare stikstof onder totdat het koken rond de buis niet langer aanhoudt. Bewaar de nier ECM op min vier graden Celsius 's nachts. Om het bevroren gedecellulariseerde weefsel te lyofiliëren, maak u de conische buisdop iets los om gasuitwisseling mogelijk te maken en plaats de buis in een lyofielisatiemachine.Lyophilize de nier ECM voor drie dagen, of totdat het lijkt op een fijne, witte poeder. Om de gel chemisch te verteren en op te solubiliseren, voeg je zorgvuldig gewogen varkenszuur pepsine en 0,01 normaal zoutzuur toe aan een scintillatie vilebel met een roerstaaf. Roer bij ongeveer 500 RPM, totdat alle pepsine is opgelost.Breng vervolgens de lyophilized kidney ECM over naar de scintillatie vileine en laat de oplossing op een roerplaat op ongeveer 500 RPM gedurende drie dagen om de voorraadnier ECM hydrogel te maken. In een weefsel cultuur kap, pipet de vereiste volumes van celcultuur media, een normale natriumhydroxide en M199 supplement, in een steriele 30 milliliter zelfstaande conische buis. Meng de neutraliserende reagensoplossing met een microspatel.Gebruik een steriele spuit van één milliliter om het juiste volume van de voorraadnier ECM hydrogel over te brengen naar de neutraliserende reagensoplossing. Gebruik een microspatel om de oplossing voorzichtig te mengen tot een homogene in kleur, hydrogel oplossing wordt verkregen. Vermijd de invoering van luchtbellen door langzaam en voorzichtig roeren.Om cellen op te nemen in de nier ECM hydrogel, resuspend driehonderdduizend cellen in 10 microliter van medium voor elke hydrogel. Pipet 10 microliters van celsuspensie in de uiteindelijke nier ECM gel. Roer de oplossing met een microspatel tot de cellen gelijkmatig verdeeld zijn.Gebruik een spuit van één milliliter om het gewenste celkweekapparaat te vullen met de nier ECM hydrogel. Laat de gel een uur lang op 37 graden Celsius instellen voordat u de cellen op de nier-ECM in het celkweekapparaat overzet of plating. Analyse van gedecellulariseerd cortexweefsel door massaspectrometrie, bleek de aanwezigheid van eiwitten geassocieerd met de basilicum lamina, met Collagen-IV en Collageen-I wordt de meest vertegenwoordigd.Collageen-IV, A1 en A2 ketens, alomtegenwoordig in alle keldermembranen werden bewaard. Collageen-IV, A3 en A5 ketens, alleen aanwezig in keldermembranen van de glomerulus, werden ook gedetecteerd. Gemeenschappelijke iso vormen van Lamininen en Collageen-Ik werden ook ontdekt.Menselijke nierperitubulaire microvasculaire endotheelcellen, of HKMECs, gekweekt op Collageen-I, nier ECM, en een 1:1 mengsel gel, toonde verschillen in fenotype. HKMECs gekweekt op Collagen-I, weergegeven uniforme CD31 uitdrukking, gezien in het rood. Terwijl HKMECs gekweekt op de twee gels met nier ECM, weergegeven verminderde CD31 expressie in ongelijke distributies.Matrix type leek niet van invloed vwf expressie, weergegeven in het groen. Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om volledig homogeniseren de gedecellulariseerde nierschors weefsel. Bovendien, bij het mengen van de gel met het neutraliseren van reagentia, vermijd de invoering van luchtbellen.Microfysiologische systemen maken de studie van de orgaanfunctie in een gecontroleerde laboratoriumomgeving mogelijk. De creatie van dergelijke systemen vereist de implementatie van cellen, matrices en stimuli. De kECM hydrogel hier vervaardigd, zal ons toelaten om dergelijke systemen die de nier micro-omgevingen recapituleren studie.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Inkapseling van hartspiercellen in een fibrine Hydrogel voor Cardiac Tissue Engineering

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

Teelt van menselijke neurale progenitorcellen in een 3-dimensionale Zelf-assemblage Peptide Hydrogel

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation

Het vervaardigen van een dubbellagige Hydrogel om ASC differentiatie Controle

Natural polymers over the years have gained more importance because of their host biocompatibility and ability to interact with cells in vitro and in ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

Synthese van een inteïne gemedieerde Kunstmatige Protein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Hydrogel Nanoparticle Oogsten van plasma of urine voor het opsporen van Low Overvloed Eiwitten

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

Een injecteerbare en-Drug geladen Supramoleculaire Hydrogel voor Local Catheter injectie in de Pig Heart

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Fabriceren superhydrophobic polymere materialen voor biomedische toepassingen

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Fabricating Cotton Analytical Devices

Fabriceren Cotton Analytical Devices

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting Cellularized Construeert met een tissue-specifieke Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Fabricage van extracellulaire matrix-afgeleide schuimen en microdragers Weefsel-specifieke Cell Cultuur en Delivery Platforms

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...