Name: fabricating a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel
Uploaded: 2018-10-13T14:30:00
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著者は、リンと幹細胞と再生医療 LifeCenter 北西の研究所のマイク ガービー イメージング研究室を確認したいと思います。彼らはまたへ北西腎臓の中心から制限されていないギフトと NIH T32 のトレーニングの許可 DK0007467 (R.J.N.) に DP2DK102258 (Y.Z.) に UH2/UH3 TR000504 (公団) に国立衛生研究所の助成金の助成を受けたい、腎臓研究所

人間の腎臓は臓器調達機関の協会が定めた倫理的なガイドラインに従う LifeCenter 北西で隔離されました。このプロトコル ワシントン大学で動物のケアと細胞文化のガイドラインに従います。
1. ひと腎臓組織の準備
<ol><li>Decellularization 溶液の調製<ol>
<li>5000 mL ビーカー、70 × 10 mm 攪拌棒を滅菌します。</li>
		<li>1: 1000 (重量: ボリューム) ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) ビー?...

マトリックスは、細胞の挙動を支配する重要な機械および化学の手がかりを提供します。合成ハイドロゲルは、複雑な 3 次元パターンをサポートしますが、微小生体マトリックスは、多様な細胞の手がかりを提供するために失敗することができます。ネイティブの ECM から派生したゲルは、体内と体外の研究のための理想的な材料です。以前の研究はホスト免疫応答<sup class="xref"...

細胞外マトリックス (ECM) は、組織の恒常性を維持するために重要な生物物理学的・生化学的手がかりを提供します。複雑な分子の構成は、組織の構造と機能の両方のプロパティを調節します。構造タンパク質空間認識を細胞に提供し、の接着や移動の1を可能にします。バインドされた配位子は、2セルの動作を制御する細胞表面の受容体と対話します。腎臓 ECM 分子の組成と構造の解剖学的位置、発達段階と疾患状態3,4によって異なりますの茄多が含まれます。腎臓由来細胞で培養の研究に重要な側面は、ECM の複雑さをさたします。
ECM 微小をレプリケートする以前の試みは、recellularization のできる足場を作成する decellularizing の全体の組織に焦点を当てています。ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) など化学洗剤または非イオン性洗剤で decellularization を実行し、それはどちらか全体の臓器灌流または液浸と撹拌方法5,6,7 を利用して ,8,9,10、11,12,13。ここに示す足場ネイティブ組織 ECM; は、構造および生化学的手がかりを保持します。さらに、ドナー固有のセルと recellularization は、臨床外科14,15,16,17,18, 19です。 ただし、これらの足場の構造の柔軟性を欠いているとの in vitro研究のため多くの現在のデバイスと互換性がありません。この制限を克服するために、多くのグループはさらにゲル20,21,22,23,24に脱 ECM を処理しています。これらのゲルは、射出成形、bioink と互換性のあるおよび細胞足場場所を脱マイクロ メートル スケールの空間的制約を回避します。さらに、分子組成とネイティブの ECM の比は、3、25が保持されます。ここで我々 は腎皮質 ECM (kECM) から派生したゲルを作製する方法を示します。
このプロトコルの目的は、腎臓の皮質領域の微小環境を複製するゲルを生成することです。腎臓皮質組織は、細胞内容物質を削除する定数撹拌下で 1 %sds の溶液で脱です。SDS は、免疫学的細胞材料6,7,9,26をすばやく削除する能力のための組織を decellularize に使用されます。KECM、機械の均質化と凍結乾燥5,6,9,11,26対象になります。ペプシンと強い酸で可溶化は、最終的なハイドロゲル原液20,27の結果します。ネイティブ kECM 蛋白質構造の重要なサポートし、信号の伝達3,25は保持されます。ヒドロゲルは、ネイティブのひと腎臓皮質28,29,30の一桁内にゲルことができます。この行列は、他のマトリックス蛋白質のゲルに比べて腎臓固有の細胞の活動の静穏化を維持するために使用されている生理学的な環境を提供します。さらに、マトリックス組成を通じて操作できます、たとえば、コラーゲン添加-私は、腎線維化およびその他の腎疾患31,32の研究モデル疾患環境に。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Preparation of Kidney Tissue</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5000 mL Beaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z740589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclaved DI H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Bar (70 x 10 mm)</td>
			<td>Fisher Science</td>
			<td>14-512-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Vacuum Filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97066-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS6795420D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Beaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS10031L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4642</td>
			<td>Any similar forceps may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor-Handle Hemostat Clamp</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z168866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z265977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle, No. 4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25859-000</td>
			<td>Any similar scalpel handle may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade, No. 20</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25860-020</td>
			<td>Any similar scalpel blade may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Bar (38.1 x 9.5 mm)</td>
			<td>Fisher Science</td>
			<td>14-513-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent Underpad</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82020-845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish (150 x 25 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclavable Biohazard Bag</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14220-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainer (40 um)</td>
			<td>Fisher Science</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30529.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL Freestanding Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89012-778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fabrication of ECM Gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Homogenizer Machine</td>
			<td>Polytron</td>
			<td>PCU-20110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze Dryer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7670520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL Glass Scintillation Vials and Cap</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V7130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Bar (15.9 x 8 mm)</td>
			<td>Fisher Science</td>
			<td>14-513-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from Porcine Gastric Mucosa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.01 N HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td>Dilute to 0.01 N HCl with cell culuture water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kidney ECM Gelation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 N NaOH (Sterile)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>415413</td>
			<td>Dilute to 1 N in cell culture grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tube</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11330.032</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Transferrin, Selenium, Sodium Pyruvate Solution (ITS-A) 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>51300-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z192325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspatula</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z193208</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabricating a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel

細胞外マトリックス (ECM) は、組織の恒常性を維持するために重要な生物物理学的・生化学的手がかりを提供します。現在合成ハイドロゲルは、体外で細胞培養、細胞からの生理学的な行動を引き出すために必要なタンパク質とリガンド組成を欠いている機械の堅牢なサポートを提供しています。この原稿は、適切な機械的な堅牢性と支持の生化学的組成腎臓皮質 ECM から派生したハイドロゲルの作製方法をについて説明します。ヒドロゲルを作製するには、機械的に均質化と脱ひと腎臓皮質 ECM を可します。マトリックスも生理的機械剛性にゲル化を有効にするネイティブ腎臓皮質 ECM タンパク質比を維持します。ヒドロゲルは、生理的条件下で維持できる皮質細胞が腎臓に基板として機能します。さらに、腎臓病の今後の研究を可能にする病的環境をモデル化するゲル組成を操作できます。

KECM ハイドロゲルは、ネイティブ腎臓の微小環境と類似の化学構造を持つ腎臓細胞培養のためのマトリックスを提供します。ヒドロゲルを作製するには、腎臓皮質組織は全体腎臓器官とさいの目に切った (図 1) から機械的に分離されます。洗剤粒子 (図 2 a.4 A.6) を除去する水でリンスが続く化学洗剤 (<strong class=...

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Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

ここで腎臓皮質細胞外マトリックス由来ハイドロゲル ネイティブ腎臓の細胞外マトリックス (ECM) 構造および生化学的組成を保持するを作製するためのプロトコルを提案する.作製プロセスとその応用を説明します。最後に、このゲルを使用して腎臓固有の細胞およびティッシュの再生とバイオ エンジニア リングをサポートする視点を説明します。

腎臓皮質細胞外マトリックス由来ハイドロゲルを製造

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

この方法は、細胞マトリックス相互作用が硫酸塩にどのような影響を与えるかなど、生体材料の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、それが正確にネイティブ腎臓皮質生化学的マイクロ環境を反映する最初の材料を生成することです.下パッドで組織培養フードを並べてください。攪拌棒、150ミリメートルの滅菌組織培養皿、および腎臓全体を含む1リットルのビーカーをフードに入れます。ビーカーに500ミリリットルの1%SDS溶液を充填します。無菌組織培養皿に腎臓を入れます。頭皮で腎カプセルの周りを軽く剃ることによって、すべての周皮脂肪を除去します。次いで、腎臓の上端を横切って浅い8〜10センチメートルの切開を行い、下皮組織を損傷することなく腎カプセルを開き破る。皮質組織から剥がして腎カプセルを取り除くために2つの止止めクランプを使用してください。腎臓の側面に沿ってメスを使用して、コロナ平面に沿って腎臓を二分する。メスで髄質領域を切り開くことによって、両方の半分から皮質組織を分離する。その後、皮質組織を0.5センチメートルの立方体にサイコロし、大きな目に見える血管を取り除きます。腎臓から細胞外マトリックスを分離するには、SDS溶液を含むビーカーにダイシング皮質組織を入れる。ビーカーをオートクレーブアルミニウムホイルで覆い、ティッシュ培養フードの外側の約400 RPMの攪拌板に置きます。24時間撹拌した後、ビーカーを組織培養フードに入れます。ナイロンメッシュで作られた40ミクロンの無菌電池ストレーナーを追加します。そして、別の1000ミリリットルビーカーに200ミリリットルの漂白剤を充填し、組織培養フードに入れる。SDS溶液を細胞ストレーナーを通して、漂白剤を含むビーカーに処分する。残りのSDS溶液をパイプアウトし、脱細胞化した組織と細胞ストレーナーだけがビーカーに残るまで。ビーカーに細胞ストレーナーを残し、新鮮なSDS溶液の500ミリリットルを追加します。ビーカーを同じアルミホイルで覆い、以前と同じ速度で攪拌板に置きます。脱細胞化および洗浄後、この時点から腎臓ECMと呼ばれる脱細胞化組織を30ミリリットルの自立型円錐形チューブに移す。そして、すべての組織が水没するまで、細胞培養グレードの水でそれを満たす。まず、組織ホモジナイザーを使用して、視錐状のチューブ内の腎臓ECMを2分間均質化し、ECMの目に見えない部分を有する不透明な溶液が得られるまで使用する。次いで、腎臓ECMを含む円錐形のチューブを液体窒素に沈め、チューブ周囲の沸騰が持続しなくなるまで沈下する。腎臓ECMをマイナス4度で一晩保管してください。凍結した脱細胞化組織を凍結乾燥するには、円錐形のチューブキャップを少し緩めてガス交換を可能にし、チューブを凍結乾燥機に入れる。腎臓ECMを3日間、または細かい白い粉末に似るまで凍結乾燥します。ゲルを化学的に消化して可溶化するには、慎重に計量したブタ胃ペプシンを加え、0.01通常の塩酸を攪拌棒を含むシンチレーション下品に加えます。すべてのペプシンが溶解するまで、約500 RPMで攪拌します。次いで、凍結乾燥した腎臓ECMをシンチレーション下品に移し、約500RPMの攪拌板に溶液を残して、ストック腎臓ECMヒドロゲルを作る。組織培養フードにおいて、細胞培養培地の必要量を、通常の水酸化ナトリウムおよびM199サプリメントに、無菌30ミリリットル自立型円錐形チューブにピペトする。中和試薬溶液をマイクロヘラと混ぜます。滅菌1ミリリットルシリンジを使用して、適切な量のストック腎臓ECMヒドロゲルを中和試薬溶液に移します。マイクロスパチュラを用いて、均質な色になるまで溶液を穏やかに混合し、ヒドロゲル溶液が得られる。ゆっくりとやさしくかき混ぜて気泡を導入しないようにしてください。腎臓ECMヒドロゲルに細胞を組み込むために、各ヒドロゲルに対して10マイクロリットルの培地で30万個の細胞を再懸濁する。最終的な腎臓ECMゲルに細胞懸濁液の10マイクロリットルをピレット。細胞が均等に分配されるまで、マイクロヘラで溶液をかき混ぜます。腎臓ECMヒドロゲルで所望の細胞培養装置を充填するために1ミリリットルのシリンジを使用してください。細胞培養装置の腎臓ECMに細胞を移すかめっきする前に、ゲルを摂氏37度に1時間セットします。質量分析による脱細胞化皮質組織の分析は、バジル層に関連するタンパク質の存在を明らかにし、コラーゲンIVおよびコラーゲン-Iが最も高く表現されている。コラーゲンIV、A1およびA2鎖は、全ての原膜において遍在し、保存された。コラーゲンIV、A3およびA5鎖は、糸球体の地下膜にのみ存在し、また検出された。ラミニンとコラーゲン-Iの一般的なアイソ形態も検出された。ヒト腎臓内膜細血管内皮細胞、またはHKMICは、コラーゲン-I上で培養し、腎臓ECM、および1:1混合物ゲルを、表現型の違いを示した。コラーゲンI上で培養したHKMICは、均一なCD31発現を示し、赤色で見た。HKMICは腎臓ECMを含む2つのゲル上で培養する一方で、不均一な分布でCD31発現を減少させた。行列タイプは、緑で示されたVWF式に影響を与えるようには見えませんでした。この手順を試みている間、脱細胞化された腎臓皮質組織を完全に均質化することを覚えておくことが重要です。さらに、ゲルを中和試薬と混合する場合は、気泡の導入を避ける。マイクロ生理学的システムは制御された実験室の設定の器官機能の研究を可能にする。このようなシステムの作成には、細胞、マトリックス、および刺激の実装が必要です。ここで製造されたkECMヒドロゲルは、腎臓マイクロ環境を再現するようなシステムを研究することを可能にする。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

心臓組織工学のためのフィブリンゲルにおける心筋細胞のカプセル化

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

3次元自己組織化ペプチドハイドロゲル中のヒト神経前駆細胞の栽培

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation

ASCの分化を制御するための二層ゲルをエンジニアリング

Natural polymers over the years have gained more importance because of their host biocompatibility and ability to interact with cells in vitro and in ...

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インテイン媒介人工タンパク質ヒドロゲルの合成

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

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Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

豚の心臓にローカルカテーテルを注入するための注射や薬物を装填した超分子ヒドロゲル

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

バイオメディカル応用のための超疎水性高分子材料を製造します

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Fabricating Cotton Analytical Devices

コットン分析デバイスを製造します

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting細胞化は、組織特異的ヒドロゲルBioinkを使用して構築します

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

組織特異的細胞培養および配信プラットフォームとして、細胞外マトリックス由来のフォームおよびマイクロキャリアの作製

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...