Name: fabricating a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel
Uploaded: 2018-10-13T14:30:00
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저자 린 마이크가 비 이미징 연구실 줄기 세포 및 재생 의학 및 LifeCenter 북 서 연구소에서 인정 하 고 싶습니다. 그들은 또한 건강의 국가 학회 교부 금, UH2/UH3 TR000504 (재 혁)에 (Y.Z.)에 DP2DK102258, NIH T32 훈련 부여 DK0007467 (R.J.N.), 북 서 신장 센터를에서 제한 없는 선물의 금융 지원을 인정 하 고 싶습니다는 신장 연구소입니다.

인간의 신장 LifeCenter 북 서 윤리 지침을 장기 조달 단체의 협회에 의해 설정에 의해 고립 되었다. 이 프로토콜은 워싱턴 대학에 의해 제시 된 동물 관심과 셀 문화 지침을 따릅니다.
1입니다. 인간 신장 조직 준비
<ol><li>Decellularization 솔루션의 준비<ol>
<li>소독 5000 mL 비 커와 70 x 10 m m 저 어 바.</li>
		<li>1:1000 (무게: 볼륨) 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 비 커에 압력가 이온된 수에 ?...

행렬 셀 동작을 제어 하는 중요 한 기계 및 화학 신호를 제공 합니다. 합성 hydrogels 복잡 한 3 차원 패턴을 지원 하지만 생리 매트릭스 microenvironments에서 다양 한 세포 외 신호를 제공 하지 못하는 수 있습니다. Hydrogels 네이티브 ECM에서 파생 된는 vivo에서 그리고 생체 외에서 연구를 위한 이상적인 물자 이다. 이전 연구를 사용 하 고 decellularized ECM hydrogels 호스트 면역학 응답<sup class="xref"...

세포 외 기질 (ECM) 조직의 항상성 유지에 중요 한 생물 및 생 화 확 적인 신호를 제공 합니다. 복잡 한 분자 구성 조직의 구조 및 기능 속성을 조정합니다. 구조 단백질 셀 공간 인식 수 있으며 접착 및 마이그레이션1있습니다. 바운드 ligands 제어 셀 동작2세포 표면 수용 체 상호 작용. 신장 ECM 분자의 조성과 구조에 따라 해부학 적 위치, 발달 단계, 및 질병 상태3,4의 과다를 한 포함 되어 있습니다. ECM의 복잡성을 업과 신장 파생 셀 체 외공부에서 핵심 요소 이다.
ECM microenvironments 복제에 이전 시도 recellularization의 건설 기계를 만드는 decellularizing 전체 조직에 집중 했다. Decellularization 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 등 화학 세제 또는 비 이온 세제, 수행 하 고 중 전체 장기 관류 또는 침수와 교 반 방법5,6,7 활용 ,,89,10,11,,1213. 여기에 제시 된 건설 기계 구조 및 생 화 확 적인 신호 기본 조직 ECM;에 보존 또한, 기증자-특정 셀과 recellularization에 임상 관련성 재건 수술14,15,,1617,18, 그러나 19., 이러한 건설 기계 구조 유연성 부족 하 고 따라서 생체 외에서 연구를 위해 사용 하는 많은 현재 장치와 호환 되지 않습니다. 이 한계를 극복, 많은 그룹이 추가 처리 decellularized ECM hydrogels20,,2122,,2324에. 이러한 hydrogels 사출 성형 및 bioink와 호환 되며 decellularized 세포에 건설 기계 장소 마이크로미터 스케일 공간 제약을 우회. 또한, 분자 구성 및 네이티브 ECM에서 발견 비율3,25유지 됩니다. 여기 신장 피 질 ECM (kECM)에서 파생 된 하이드로 겔을 조작 하는 방법을 설명 합니다.
이 프로토콜의 목적은 신장 피 질 영역의 microenvironment 복제 하는 하이드로 겔을 생산 하는 것입니다. 신장 피 질 조직 세포 문제를 제거 하려면 지속적인 동요에서 1 %SDS 솔루션에서 decellularized입니다. SDS 면역 세포 소재6,7,,926를 신속 하 게 제거 하는 기능 조직 decellularize에 일반적으로 사용 됩니다. kECM는 다음 기계적 균질 및 동결은5,,69,,1126. 펩 신으로 강한 산에 가용 화 최종 히드로 재고 솔루션20,27에 발생합니다. 기본 kECM 단백질 구조에 대 한 중요 한 지원 및 신호 변환3,25유지 됩니다. 또한 네이티브 인간의 신장 피 질28,,2930의 한 차수 내는 히드로에 gelled 수 있습니다. 이 매트릭스는 다른 매트릭스 단백질에서 hydrogels에 비해 신장 특정 셀의 정지를 유지 하기 위해 사용 된 생리 적 환경의 제공 합니다. 또한, 매트릭스 구성을 조작할 수 있습니다, 예를 들어 콜라겐의 추가 통해-나, 신장 섬유 증 및 다른 신장 질환31,32의 연구에 대 한 모델 질병 환경.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Preparation of Kidney Tissue</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5000 mL Beaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z740589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclaved DI H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Bar (70 x 10 mm)</td>
			<td>Fisher Science</td>
			<td>14-512-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Vacuum Filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97066-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS6795420D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Beaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS10031L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4642</td>
			<td>Any similar forceps may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor-Handle Hemostat Clamp</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z168866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z265977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle, No. 4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25859-000</td>
			<td>Any similar scalpel handle may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade, No. 20</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25860-020</td>
			<td>Any similar scalpel blade may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Bar (38.1 x 9.5 mm)</td>
			<td>Fisher Science</td>
			<td>14-513-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent Underpad</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82020-845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish (150 x 25 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclavable Biohazard Bag</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14220-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainer (40 um)</td>
			<td>Fisher Science</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30529.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL Freestanding Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89012-778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fabrication of ECM Gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Homogenizer Machine</td>
			<td>Polytron</td>
			<td>PCU-20110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze Dryer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7670520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL Glass Scintillation Vials and Cap</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V7130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Bar (15.9 x 8 mm)</td>
			<td>Fisher Science</td>
			<td>14-513-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from Porcine Gastric Mucosa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.01 N HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td>Dilute to 0.01 N HCl with cell culuture water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kidney ECM Gelation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 N NaOH (Sterile)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>415413</td>
			<td>Dilute to 1 N in cell culture grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tube</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11330.032</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Transferrin, Selenium, Sodium Pyruvate Solution (ITS-A) 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>51300-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z192325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspatula</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z193208</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabricating a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel

세포 외 기질 (ECM) 조직의 항상성 유지에 중요 한 생물 및 생 화 확 적인 신호를 제공 합니다. 현재 합성 hydrogels 체 외에서 세포 배양 하지만 부족 필요한 단백질과 리간드 컴포지션 셀에서 생리 적 행동을 이끌어내는 강력한 기계적인 지원을 제공 합니다. 이 원고는 적절 한 기계적 견고성 및 지원 생 화 확 적인 구성으로 신장 피 질 ECM 파생 된 하이드로 겔의 제조 방법을 설명합니다. 히드로 기계적 조직 및 decellularized 인간 신장 피 질 ECM solubilizing 조작 이다. 매트릭스도 생리 적인 기계 stiffnesses 겔 화 하면서 네이티브 신장 피 질 ECM 단백질 비율을 유지 합니다. 히드로 신장에 따라 피 질에서 파생 된 세포 생리 적인 조건 하에서 유지 될 수 있다 기질 역할을 합니다. 또한, 하이드로 겔 조성 장병의 미래 연구를 가능 하 게 병 환경을 모델링을 조작할 수 있습니다.

KECM 히드로 네이티브 신장 microenvironment로 유사한 화학 성분과 신장 세포 배양에 대 한 매트릭스를 제공합니다. 조작 된 하이드로 겔, 하 신장 피 질 조직 전체 신장 기관 및 절단된 (그림 1)에서 기계적으로 격리 됩니다. 화학 세제 (그림 2A.1 A.3) 세제 입자 (그림 2A.4 A.6)를 제거 하는 ...

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Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

여기 우리는 신장 피 질 세포 외 매트릭스 파생 히드로 네이티브 신장 세포 외 기질 (ECM) 구조 및 생 화 확 적인 구성 유지를 조작 하는 프로토콜을 제시. 제조 프로세스와 응용 프로그램을 설명 합니다. 마지막으로, 신장 관련 세포 및 조직 재생 및 생명 공학 지원 하기 위해이 하이드로 겔을 사용 하 여에 대 한 관점을 설명 합니다.

날조는 신장 피 질 세포 외 매트릭스 파생 하이드로 겔

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

이 방법은 세포 매트릭스 상호 작용이 황산염에 미치는 영향과 같은 생체 재료 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 토착 신장 피질 생화학 미생물 환경을 정확하게 반영하는 첫 번째 물질을 생성한다는 것입니다. 언더 패드와 조직 배양 후드를 라인.교반 바, 150mm 멸균 조직 배양 접시, 신장 전체를 후드에 넣습니다. 1% SDS 솔루션의 500 밀리리터로 비커를 채웁니다. 멸균 조직 배양 접시에 신장을 놓습니다.메스로 신장 캡슐 주위를 가볍게 면도하여 모든 페리신 지방을 제거합니다. 그런 다음, 신장의 우수한 끝에 걸쳐 얕은 8 ~10 센티미터 절개를, 기본 피질 조직을 손상시키지 않고 신장 캡슐을 열어 깰. 두 개의 혈우염 클램프를 사용하여 피질 조직에서 벗겨내어 신장 캡슐을 제거하십시오.신장의 측면을 따라 메스를 사용하여 관상 평면을 따라 신장을 양분하십시오. 메스와 함께 수질 부위를 조각하여 두 반쪽에서 피질 조직을 분리합니다. 그런 다음 피질 조직을 0.5 센티미터 큐브 조각으로 주사위와 크고 보이는 혈관을 제거하십시오.신장에서 세포외 매트릭스를 격리하려면, SDS 용액을 포함하는 비커에 다진 피질 조직을 배치합니다. 비커를 오토클레이브 알루미늄 호일로 덮고 조직 배양 후드 바깥쪽에 있는 약 400RPM의 교반판에 놓습니다. 24 시간 의 교반 후, 조직 배양 후드에 비커를 가져.나일론 메쉬로 만든 40 마이크론 멸균 셀 스트레이너를 추가합니다. 그리고, 표백제 200 밀리리터와 별도의 1000 밀리리터 비커를 채우고, 조직 배양 후드에 놓습니다. 세포 스트레이너를 통해 SDS 용액을 표백제가 들어있는 비커에 넣습니다.남은 SDS 용액을 제거하면 세포 변형 조직과 세포 스트레이너만 비커에 남아 있을 때까지 피펫합니다. 비커에 셀 스트레이너를 두고 500 밀리리터의 신선한 SDS 솔루션을 추가합니다. 비커를 동일한 알루미늄 호일로 덮고 이전과 같은 속도로 저어줍니다.탈세포화 및 세척 후, 이 시점부터 신장 ECM이라고 불리는 탈세포화된 조직을 30밀리리터 자가형 원내 튜브로 옮킨다. 그리고 모든 조직이 물에 잠길 때까지 세포 배양 등급의 물로 채웁니다. 먼저, 조직 균질화제를 사용하여 원문 관내 신장 ECM을 2분 동안 균질화하고, 눈에 보이는 ECM 조각이 없는 불투명한 용액을 얻을 수 있다.이어서, 액체 질소에 신장 ECM을 함유하는 원내관을 침수하여 튜브를 둘러싼 끓는 것이 더 이상 지속되지 않습니다. 신장 ECM을 하룻밤 동안 영하 4도에 보관하십시오. 동결 된 탈세포 조직을 lyophilize하려면, 약간 가스 교환을 허용하기 위해 원문 튜브 캡을 느슨하게하고, lyophilization 기계에 튜브를 배치합니다.3 일 동안 신장 ECM을 lyophilize, 또는 그것은 미세, 흰색 분말을 닮은 때까지. 젤을 화학적으로 소화하고 용해시키기 위해 조심스럽게 계량된 돼지 위 펩신과 0.01 일반 염산에 교반 바를 함유한 신경에 첨가합니다. 약 500 RPM에서 저어주면 모든 펩신이 용해될 때까지 저어줍니다.이어서, 리오필화된 신장 ECM을 신설성멸으로 옮기고 약 500RPM에서 3일 동안 용액을 교반판에 남겨두고 혈중 신장 ECM 하이드로겔을 만든다. 조직 배양 후드에서, 세포 배양 매체의 필요한 볼륨, 하나의 정상적인 수산화 나트륨 및 M199 보충, 멸균 30 밀리 리터 자체 서 원뿔 튜브로 파이프. 중화 시약 용액을 마이크로 주걱과 혼합합니다.멸균 1 밀리리터 주사기를 사용하여 적절한 양의 스톡 신장 ECM 하이드로겔을 중화 시약 용액으로 이송합니다. 마이크로 주걱을 사용하여 균일한 색상, 하이드로겔 용액이 얻어질 때까지 용액을 부드럽게 혼합합니다. 천천히 부드럽게 저어서 기포를 도입하지 마십시오.신장 ECM 하이드로겔에 세포를 통합하기 위해, 각 하이드로겔에 대한 배지의 10 마이크로 리터에 삼십만 세포를 다시 중단. 최종 신장 ECM 젤로 세포 현탁액의 파이프 10 마이크로 리터. 세포가 균등하게 분포될 때까지 마이크로 주걱으로 용액을 저어줍니다.1 밀리리터 주사기를 사용하여 원하는 세포 배양 장치를 신장 ECM 하이드로겔로 채웁니다. 젤이 세포 배양 장치에서 신장 ECM에 세포를 옮기거나 도금하기 전에 1 시간 동안 섭씨 37도에서 설정되도록 하십시오. 질량 분석법에 의한 탈세포 피질 조직의 분석은, 콜라겐-IV와 콜라겐-I가 가장 높게 표현되는 바질 라미나와 관련되었던 단백질의 존재를 밝혔습니다.콜라겐-IV, A1 및 A2 체인, 모든 지하 막에 유비쿼터스 보존 되었다. 콜로메루스의 지하 막에만 존재하는 콜라겐-IV, A3 및 A5 체인도 검출되었다. 라민과 콜라겐-I의 일반적인 이소 형태도 검출되었습니다.인간 신장 관피 미생물 세포, 또는 HKMECs, 콜라겐-I, 신장 ECM 및 1:1 혼합물 젤에 배양, 표현형에 있는 다름을 보였다. 콜라겐-I에서 배양된 HKMECs는 빨간색으로 보이는 균일한 CD31 표현을 표시했습니다. HKMEC는 신장 ECM을 포함하는 2개의 젤에 배양하는 동안, 고르지 않은 분포에서 감소된 CD31 발현을 표시했습니다.매트릭스 유형은 녹색으로 표시된 VWF 식에 영향을 미치지 않았습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 완전히 탈세포 신장 피질 조직을 균질화하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 또한, 중화 시약과 젤을 혼합 할 때, 기포의 도입을 피하십시오.마이크로 생리 시스템은 통제 된 실험실 환경에서 장기 기능의 연구를 허용합니다. 이러한 시스템의 생성은 세포, 행렬 및 자극의 구현이 필요합니다. 여기서 제작된 kECM 하이드로겔은 신장 마이크로 환경을 재구성하는 시스템을 연구할 수 있게 해줍니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

심장 조직 공학을위한 섬유소 히드로겔에 Cardiomyocytes의 캡슐

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

연구

생체공학

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

3 차원 자기 조립 펩티드 히드로겔에서 인간 신경 전구 세포의 배양

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

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ASC의 분화를 제어하는​​ Bilayered 히드로겔 꾸민

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테인 매개 인공 단백질 히드로 겔의 합성

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조직 특이 적 세포 배양 및 전달 플랫폼과 같은 세포 외 기질 유래 거품과 마이크로 담체의 제조

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