Name: fabricating a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel
Uploaded: 2018-10-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel at JoVE.com

Forfatterne ønsker å erkjenne Lynn og Mike Garvey Imaging Laboratory ved Institutt for Stem Cell og regenerativ medisin og LifeCenter nordvest. De ønsker også å erkjenne økonomisk støtte av National Institutes of Health tilskudd, UH2/UH3 TR000504 (å J.H.) og DP2DK102258 (til Y.Z.), NIH T32 trening grant DK0007467 (til R.J.N.) og en ubegrenset gave fra nordvest nyre sentrene til den Nyre Research Institute.

Menneskets nyrer ble isolert av LifeCenter nordvest etter etiske retningslinjer satt av foreningen for orgel innkjøp organisasjoner. Denne protokollen følger dyr omsorg og celle kultur retningslinjene skissert av University of Washington.
1. forberedelse av menneskelig nyre vev
<ol><li>Utarbeidelse av decellularization løsning<ol>
<li>Sterilisere en 5000 mL kanne og 70 x 10 mm rør bar.</li>
		<li>Bland 1:1000 (vekt: volum) natrium dodecyl sulfate (SDS) i autoklaveres deionisert vann bege...

Matriser gir viktig mekaniske og kjemiske signaler som regulerer celle atferd. Syntetisk hydrogels er i stand til å støtte komplekse 3-dimensjonale mønster men ikke klarer å gi ulike ekstracellulære signaler i fysiologiske matrise microenvironments. Hydrogels fra innfødte ECM er ideelle materialer for både i vivo og vitro studier. Tidligere studier har brukt decellularized ECM hydrogels til coat syntetiske biologisk materiale for å hindre vert immunologiske svar33,</...

Ekstracellulær matrix (EFM) gir viktig Biofysiske og biokjemiske signaler for å opprettholde vev homeostase. Komplekse molekylær sammensetningen regulerer både strukturelle og funksjonelle egenskaper av vev. Strukturelle proteiner gi celler med romlig bevissthet og muliggjøre vedheft og migrasjon1. Bundet ligander samhandle med celleoverflaten reseptorer å kontrollere celle oppførsel2. Nyre ECM inneholder en mengde molekyler som komposisjon og struktur varierer avhengig av anatomiske plasseringen, utviklingsstadiet og sykdom staten3,4. Recapitulating kompleksiteten av ECM er en sentral del i å studere nyre-avledet celler i vitro.
Tidligere forsøk på å replikere ECM microenvironments har fokusert på decellularizing hele vev lage stillaser i stand til å recellularization. Decellularization er utført med kjemiske rengjøringsmidler som natrium dodecyl sulfate (SDS) eller ikke-ioniske vaskemidler, og det utnytter enten hele organ perfusjon eller nedsenking og agitasjon metoder5,6,7 ,8,9,10,11,12,13. Stillasene presenteres her bevare strukturelle og biokjemiske signaler i eget vev ECM; Videre recellularization med donor-spesifikke celler har klinisk relevans i rekonstruktiv kirurgi14,15,16,17,18, 19. imidlertid disse stillaser mangler strukturelle fleksibilitet og er derfor ikke kompatible med mange gjeldende enheter for i vitro studier. For å overkomme denne begrensningen, har mange grupper ytterligere behandlet decellularized ECM i hydrogels,20,,21,,22,,23,,24. Disse hydrogels er kompatible med injeksjon molding og bioink og omgå mikrometer skala romlige begrensninger som decellularized stillaser sted på celler. Videre beholdes molekylær sammensetning og prosenter i native ECM3,25. Her viser vi en metode for å dikte et hydrogel avledet fra nyre cortex ECM (kECM).
Formålet med denne protokollen er å produsere en hydrogel som reproduserer microenvironment av nyre kortikale området. Nyre cortex vev er decellularized i en 1% SDS løsning under konstant agitasjon fjerne cellulære saken. SDS brukes vanligvis til decellularize vev på grunn av sin evne til å raskt fjerne immunologiske mobilnettet materiale6,7,9,26. KECM er da mekanisk homogenisering og lyophilization,5,,6,,9,,11,,26. Solubilization i en sterk syre med pepsin resulterer i en siste hydrogel lagerløsning20,27. Native kECM proteiner som er viktig for strukturell støtte og signalisere signaltransduksjon beholdes3,25. Hydrogel kan også være gelled til innenfor en størrelsesorden innfødt menneskelige nyre cortex28,29,30. Denne matrisen gir en fysiologisk miljø som er brukt til å opprettholde gågaten i nyre-spesifikke celler i forhold til hydrogels fra andre matrix proteiner. Videre matrix komposisjon kan manipuleres, for eksempel gjennom tillegg av kollagen-jeg, til modellen sykdom miljøer for studiet av nyre fibrose og andre nyre sykdommer31,32.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Preparation of Kidney Tissue</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5000 mL Beaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z740589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclaved DI H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Bar (70 x 10 mm)</td>
			<td>Fisher Science</td>
			<td>14-512-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Vacuum Filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97066-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS6795420D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Beaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS10031L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4642</td>
			<td>Any similar forceps may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor-Handle Hemostat Clamp</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z168866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z265977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle, No. 4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25859-000</td>
			<td>Any similar scalpel handle may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade, No. 20</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25860-020</td>
			<td>Any similar scalpel blade may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Bar (38.1 x 9.5 mm)</td>
			<td>Fisher Science</td>
			<td>14-513-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent Underpad</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82020-845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish (150 x 25 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclavable Biohazard Bag</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14220-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainer (40 um)</td>
			<td>Fisher Science</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30529.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL Freestanding Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89012-778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fabrication of ECM Gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Homogenizer Machine</td>
			<td>Polytron</td>
			<td>PCU-20110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze Dryer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7670520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL Glass Scintillation Vials and Cap</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V7130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Bar (15.9 x 8 mm)</td>
			<td>Fisher Science</td>
			<td>14-513-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from Porcine Gastric Mucosa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.01 N HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td>Dilute to 0.01 N HCl with cell culuture water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kidney ECM Gelation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 N NaOH (Sterile)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>415413</td>
			<td>Dilute to 1 N in cell culture grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tube</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11330.032</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Transferrin, Selenium, Sodium Pyruvate Solution (ITS-A) 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>51300-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z192325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspatula</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z193208</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabricating a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel

Ekstracellulær matrix (EFM) gir viktig Biofysiske og biokjemiske signaler for å opprettholde vev homeostase. Gjeldende syntetisk hydrogels tilbyr robust mekanisk støtte for i vitro celle kultur, men mangler nødvendig protein og ligand sammensetningen for å vekke fysiologiske oppførsel fra celler. Dette manuskriptet beskriver en fabrikasjon metode for en nyre cortex ECM-avledet hydrogel med riktig mekanisk robusthet og støttende biokjemisk komposisjon. Hydrogel er fabrikkert av mekanisk homogenisere og solubilizing decellularized menneskelige nyre cortex ECM. Matrix bevarer opprinnelig nyre cortex ECM protein prosenter mens også gelation til fysiologiske mekaniske stiffnesses. Hydrogel fungerer som et substrat på hvilke nyre cortex-avledet celler kan opprettholdes under fysiologiske forhold. Videre kan hydrogel sammensetningen manipuleres for å modellere et sykt miljø som gjør at fremtidige studiet av nyre sykdommer.

KECM-hydrogel gir en matrise for nyre cellekultur liknende kjemisk sammensetning som den opprinnelige nyre microenvironment. For å utvikle hydrogel, er nyre cortex vev mekanisk isolert fra en hel nyre orgel og terninger (figur 1). Decellularization med kjemiske vaskemiddel (figur 2A.1-A.3) etterfulgt av skyller med vann for å fjerne vaskemiddel partikler (figur 2A.4-A.6</st...

Watch this Scientific Journal Video about Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel at JoVE.com

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Her presenterer vi en protokoll for å dikte en nyre cortex ekstracellulær matrix-avledet hydrogel for å beholde opprinnelige nyre ekstracellulær matrix (EFM) strukturelle og biokjemiske sammensetningen. Fabrikasjon prosessen og tilhørende programmer er beskrevet. Til slutt, et perspektiv på bruker denne hydrogel støtte nyre-spesifikke cellular og vev gjenfødelse og bioteknologi er diskutert.

Fabrikere en nyre Cortex ekstracellulær Matrix-avledet Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål innen biomaterialer, for eksempel hvordan cellematriseinteraksjoner påvirker sulfat. Den største fordelen med denne teknikken er at den genererer det første materialet som nøyaktig gjenspeiler de innfødte nyrecortex biokjemiske mikromiljøene. Linje en vev kultur hette med en under pute.Legg et en liters beger som inneholder en rørebar, en 150 millimeter steril vevskulturrett og hele nyren i panseret. Fyll begeret med 500 milliliter 1% SDS-løsning. Legg nyrene i den sterile vevskulturfatet.Fjern alt perirenal fett ved lett barbering rundt nyrekapselen med en skalpell. Deretter gjør du et grunt åtte til 10 centimeter snitt over den overlegne enden av nyrene, for å bryte opp nyrekapselen uten å skade det underliggende cortexvevet. Bruk to hemostatklemmer for å fjerne nyrekapselen ved å skrelle den bort fra cortexvevet.Bisect nyrene langs koronarplanet ved hjelp av skalpell langs sidesiden av nyrene. Isoler cortex vev fra begge halvdeler ved å skjære ut medullar-regionen med skalpell. Deretter terninger cortex vevet i 0, 5 centimeter cubed stykker, og fjerne eventuelle store, synlige fartøy.For å isolere ekstracellulær matrise fra nyrene, legg terninger cortex vev i begeret som inneholder SDS løsning. Dekk begeret med autoklavet aluminiumsfolie og legg det på en røreplate på ca. 400 RPM, utenfor vevskulturhetten. Etter 24 timers omrøring, ta begeret inn i en vevskulturhette.Tilsett en 40 mikron steril celle sil laget med nylon mesh. Og fyll deretter et separat 1000 milliliter beger med 200 milliliter blekemiddel, og legg det i vevskulturhetten. Kast SDS-oppløsningen gjennom cellesilen, inn i begeret som inneholder blekemiddel.Pipet ut eventuelle gjenværende SDS-løsning, til bare decellularisert vev og cellesilen forblir i begeret. La cellesilet stå i begeret, og tilsett 500 milliliter frisk SDS-løsning. Dekk begeret med samme aluminiumsfolie, og legg det på en røreplate med samme hastighet som før.Etter decellularisering og vasking, overfør det decellulæriserte vevet, referert til som nyre ECM fra dette punktet av, til et 30 milliliter selvstående konisk rør. Og fyll det med cellekulturgrad vann, til alt vevet er nedsenket. Bruk først en vevhomogenisator til å homogenisere nyrene ECM i det koniske røret i to minutter, til en ugjennomsiktig løsning uten synlige stykker ECM oppnås.Deretter senker du det koniske røret som inneholder nyrene ECM i flytende nitrogen til koking rundt røret ikke lenger vedvarer. Oppbevar nyrene ECM ved minus fire grader Celsius over natten. For å lyofilisere det frosne decellulariserte vevet løsner du forsiktig den koniske rørhetten for å tillate gassutveksling, og plasserer røret i en lyofiliseringsmaskin.Lyofilisere nyre ECM i tre dager, eller til den ligner et fint, hvitt pulver. For å kjemisk fordøye og løse gelen, tilsett nøye veid svinepstrisk pepsin, og 0,01 normal saltsyre til en scintillation sjofel som inneholder en rørestang. Rør ved ca. 500 o/min, til hele pepsin er oppløst.Deretter overfører lyofilisert nyre ECM til scintillation sjofel og la løsningen stå på en røreplate på ca 500 RPM i tre dager for å gjøre lager nyre ECM hydrogel. I en vevskulturhette, pipet de nødvendige volumene av cellekulturmedier, en normal natriumhydroksid og M199 supplement, inn i et sterilt 30 milliliter selvstående konisk rør. Bland nøytraliserende reagensløsning med en mikrospatel.Bruk en steril en milliliter sprøyte til å overføre riktig volum av lager nyre ECM hydrogel til nøytraliserende reagensløsning. Bruk en mikrospatel til å blande oppløsningen forsiktig til en homogen farge, hydrogeloppløsning oppnås. Unngå å innføre luftbobler ved å røre sakte og forsiktig.For å innlemme celler i nyrene ECM hydrogel, resuspend tre hundre tusen celler i 10 mikroliter av medium for hver hydrogel. Pipet 10 mikroliter celle suspensjon i den endelige nyre ECM gel. Rør løsningen med en mikrospatel til cellene er jevnt fordelt.Bruk en en milliliter sprøyte for å fylle ønsket cellekulturenhet med nyrene ECM hydrogel. La gelen settes til 37 grader Celsius i en time før du overfører eller plating cellene til nyre ECM i cellekulturenheten. Analyse av decellularisert cortex vev ved massespektrometri, avslørte tilstedeværelsen av proteiner forbundet med basilikum lamina, med Kollagen-IV og Kollagen-I som den mest representerte.Kollagen-IV, A1 og A2 kjeder, allestedsnærværende i alle kjellermembraner ble bevart. Kollagen-IV, A3 og A5 kjeder, som bare finnes i kjellermembraner av glomerulus, ble også oppdaget. Vanlige iso former for Laminins og Kollagen-Jeg ble også oppdaget.Human nyreperitubular mikrovaskulære endotelceller, eller HKMECs, dyrket på kollagen-I, nyre ECM, og en 1:1 blanding gel, viste forskjeller i fenotype. HKMECs kultivert på Kollagen-I, viste ensartet CD31 uttrykk, sett i rødt. Mens HKMECs kultivert på de to gelene som inneholder nyre ECM, viste redusert CD31 uttrykk i ujevne distribusjoner.Matrisetypen så ikke ut til å påvirke VWF-uttrykket, vist i grønt. Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske å fullstendig homogenisere decellularisert nyre cortex vev. Videre, når du blander gelen med nøytraliserende reagenser, unngå innføring av luftbobler.Mikrofysiologiske systemer tillater studiet av organfunksjon i en kontrollert laboratorieinnstilling. Opprettelsen av slike systemer krever implementering av celler, matriser og stimuli. KECM hydrogel fabrikkert her, vil tillate oss å studere slike systemer som rekapulerer nyre mikro miljøer.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

Dyrking av Human Neural stamceller i en 3-dimensjonal Self-montering Peptid Hydrogel

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation

Engineering A Bilayered Hydrogel å kontrollere ASC differensiering

Natural polymers over the years have gained more importance because of their host biocompatibility and ability to interact with cells in vitro and in ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

Syntese av en Intein-mediert Kunstig Protein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Hydrogel Nanoparticle Høsting av plasma eller urin for å påvise lav overflod Proteiner

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

En injeksjon and Drug lastet Supramolecular hydrogel for Lokal kateter Injeksjon i Pig Hjerte

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Fabrikere superhydrophobic polymere materialer for Biomedical Applications

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Fabricating Cotton Analytical Devices

Fabrikere Bomull Analytiske Devices

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting Cellularized Konstruerer Ved hjelp av en Tissue-spesifikke hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Fabrikasjon av ekstracellulære matrise-avledet Skum og Mikrocarriers som Tissue-spesifikke cellekultur og Delivery plattformer

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...