Name: fabricating a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel
Uploaded: 2018-10-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel at JoVE.com

Författarna vill erkänna Lynn och Mike Garvey Imaging Laboratory vid Institutet för stamceller och regenerativ medicin och LifeCenter nordväst. De skulle också vilja erkänna finansiella stöd av National Institutes of Health bidrag, UH2/UH3 TR000504 (att J.H.) och DP2DK102258 (till Y.Z.), NIH T32 utbildning grant DK0007467 (till R.J.N.) och en obegränsad gåva från Northwest njure centrerar till den Njure Research Institute.

Mänskliga njurar isolerades av LifeCenter nordväst efter etiska riktlinjer som fastställs av de Association av orgel upphandling organisationer. Detta protokoll följer djurens vård och cell-kultur riktlinjer beskrivs av University of Washington.
1. beredning av människans njure vävnad
<ol><li>Beredning av decellularization lösning<ol>
<li>Sterilisera en 5000 mL bägare och en 70 x 10 mm rör bar.</li>
		<li>Blanda 1: 1000 (vikt: volym) sodium dodecyl sulfate (SDS) Ånghärdad avjonis...

Matriser ger viktiga mekaniska och kemiska signaler som styr cellen beteende. Syntetiska hydrogels kan stödja komplexa 3-dimensionella mönster men misslyckas med att tillhandahålla olika extracellulära ledtrådar finns i fysiologiska matrix mikromiljö. Hydrogeler härrör från infödda ECM är perfekt material för både i vivo och in vitro- studier. Tidigare studier har använt cell-lösa ECM hydrogeler för att bestryka syntetiskt biomaterial för att förhindra värd immunologiska svar<sup clas...

Extracellulär matrix (ECM) ger viktiga biofysiska och biokemiska signaler för att upprätthålla vävnad homeostas. Den komplexa molekylära sammansättningen reglerar både strukturella och funktionella egenskaper av vävnad. Strukturella proteiner förse cellerna med rumsuppfattning och möjliggöra adhesion och migration1. Destinerade ligands interagera med surface cellreceptorer att styra cell beteende2. Njure ECM innehåller en uppsjö av molekyler vars sammansättning och struktur varierar beroende på anatomiska läge, utvecklingsstadier och sjukdom stat3,4. Går igenom komplexiteten i ECM är en viktig aspekt i att studera njure-derived celler in vitro.
Tidigare försök att replikera ECM mikromiljö har fokuserat på decellularizing hela vävnad för att skapa ställningar kan recellularization. Decellularization har utförts med kemiska rengöringsmedel såsom natriumsulfat natriumdodecylsulfat (SDS) eller icke-joniskt rengöringsmedel, och det använder antingen hela orgel perfusion eller nedsänkning och agitation metoder5,6,7 ,8,9,10,11,12,13. De ställningar som presenteras här bevara de strukturella och biokemiska signaler Funna i native vävnad ECM; Dessutom recellularization med givare-specifika celler har klinisk relevans i rekonstruktiv kirurgi14,15,16,17,18, 19. dock dessa ställningar saknar strukturella flexibilitet och därför är inkompatibla med många aktuella enheter som används för in vitro- studier. För att kringgå den här begränsningen har många grupper bearbetas vidare cell-lösa ECM till hydrogels20,21,22,23,24. Dessa hydrogeler är kompatibla med formsprutning och bioink och kringgå mikrometer skala rumsliga begränsningar som cell-lösa ställningar plats på celler. Dessutom bevaras molekylära sammansättning och nyckeltal i native ECM3,25. Här visar vi en metod för att fabricera en hydrogel som härrör från njure cortex ECM (kECM).
Syftet med detta protokoll är att producera en hydrogel som replikerar närmiljön i regionen njure kortikala. Njure cortex vävnad är cell-lösa i en 1% SDS lösning under ständig agitation ta bort cellulära fråga. SDS används ofta till decellularize vävnad på grund av dess förmåga att snabbt ta bort immunologiska cellulära material6,7,9,26. KECM är då föremål för mekanisk homogenisering och frystorka den5,6,9,11,26. Lösbarhet i en stark syra med pepsin resulterar i en slutlig hydrogel stamlösning20,27. Infödda kECM proteiner som är viktiga för strukturellt stöd och signal transduktion bevaras3,25. Hydrogel kan också vara geléartad till inom en beställa av storlek av infödda mänskliga njurar cortex28,29,30. Denna matris ger en fysiologisk miljö som har använts för att bibehålla rofylld av njure-specifika celler jämfört hydrogels från andra matrix proteiner. Dessutom matrix sammansättning kan manipuleras, exempelvis genom tillägg av kollagen-I, till modell sjukdom miljöer för studien av nedsatt fibros och andra njur sjukdomar31,32.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Preparation of Kidney Tissue</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5000 mL Beaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z740589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclaved DI H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Bar (70 x 10 mm)</td>
			<td>Fisher Science</td>
			<td>14-512-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Vacuum Filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97066-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS6795420D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Beaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS10031L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4642</td>
			<td>Any similar forceps may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor-Handle Hemostat Clamp</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z168866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z265977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle, No. 4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25859-000</td>
			<td>Any similar scalpel handle may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade, No. 20</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25860-020</td>
			<td>Any similar scalpel blade may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Bar (38.1 x 9.5 mm)</td>
			<td>Fisher Science</td>
			<td>14-513-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent Underpad</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82020-845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish (150 x 25 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclavable Biohazard Bag</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14220-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainer (40 um)</td>
			<td>Fisher Science</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30529.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL Freestanding Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89012-778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fabrication of ECM Gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Homogenizer Machine</td>
			<td>Polytron</td>
			<td>PCU-20110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze Dryer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7670520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL Glass Scintillation Vials and Cap</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V7130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Bar (15.9 x 8 mm)</td>
			<td>Fisher Science</td>
			<td>14-513-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from Porcine Gastric Mucosa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.01 N HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td>Dilute to 0.01 N HCl with cell culuture water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kidney ECM Gelation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 N NaOH (Sterile)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>415413</td>
			<td>Dilute to 1 N in cell culture grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tube</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11330.032</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Transferrin, Selenium, Sodium Pyruvate Solution (ITS-A) 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>51300-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z192325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspatula</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z193208</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabricating a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel

Extracellulär matrix (ECM) ger viktiga biofysiska och biokemiska signaler för att upprätthålla vävnad homeostas. Nuvarande syntetiska hydrogels erbjuder robust mekanisk stöd för cellodling in vitro- men saknar den nödvändiga protein och ligand sammansättningen för att framkalla fysiologisk beteende från celler. Detta manuskript beskriver en fabrication metod för en njure cortex ECM-derived hydrogel med ordentlig mekanisk robusthet och stödjande biokemiska sammansättning. Hydrogel är tillverkad av mekaniskt homogenisering och solubilizing cell-lösa mänskliga njurar cortex ECM. Matrisen bevarar infödda njure cortex ECM protein nyckeltal och även möjliggöra gelation till fysiologiska mekaniska stiffnesses. Hydrogel serverar som substrat vid vilken njure cortex-derived celler kan upprätthållas under fysiologiska betingelser. Dessutom kan hydrogel sammansättning manipuleras för att modellera en diseased miljö som möjliggör framtida studier av njursjukdomar.

Den kECM hydrogel erbjuder en matris för njure cellodling med liknande kemiska sammansättning som den infödda njure mikromiljö. För att fabricera hydrogel, är njure cortex vävnad mekaniskt isolerad från en hela njuren orgel och tärnade (figur 1). Decellularization med kemiska tvättmedel (figur 2A.1-A.3) följt av sköljning med vatten för att avlägsna rengöringsmedlet partiklar (...

Watch this Scientific Journal Video about Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel at JoVE.com

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Här presenterar vi ett protokoll för att fabricera en njure cortex extracellulära matrix-derived hydrogel för att behålla den infödda njure extracellulära matrix (ECM) strukturella och biokemiska sammansättningen. Tillverkningsprocessen och dess tillämpningar beskrivs. Slutligen diskuteras ett perspektiv på använda denna hydrogel för att stödja njure-specifik cellulär och vävnad förnyelse och bioteknik.

Fabricera en njure Cortex extracellulära Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom biomaterialområdet, till exempel hur cellmatrisinteraktioner påverkar sulfat. Den största fördelen med denna teknik är att den genererar det första materialet som exakt återspeglar de inhemska njurbarkens biokemiska mikromiljöer. Linje en vävnad kultur huva med en under pad.Placera en en liters bägare som innehåller en rör bar, en 150 millimeter steril vävnad kultur maträtt, och hela njuren i huven. Fyll bägaren med 500 milliliter 1%SDS-lösning. Placera njuren i den sterila vävnadskulturskålen.Ta bort allt perirenalt fett genom att lätt raka runt njurkapseln med en skalpell. Sedan, gör en grund åtta till 10 centimeter snitt över den överlägsna änden av njuren, att bryta öppna njurkapseln utan att skada den underliggande hjärnbarken vävnad. Använd två hemostat klämmor för att ta bort njurkapseln genom att skala bort den från cortexvävnaden.Bisect njuren längs koronaplanet genom att använda skalpell längs den laterala sidan av njuren. Isolera cortexvävnad från båda halvorna genom att snida ut medullarregionen med skalpell. Sedan, tärna cortex vävnaden i 0,5 centimeter kubik bitar, och ta bort alla stora, synliga kärl.För att isolera extracellulär matris från njuren, placera den tärnade cortexvävnaden i bägaren som innehåller SDS-lösning. Täck bägaren med autoklaverad aluminiumfolie och placera den på en omrörningsplatta vid ungefär 400 RPM, utanför vävnadskulturens huva. Efter 24 timmars omrörning, ta in bägaren i en vävnadskulturhuva.Lägg till en 40 micron steril cell sil gjord med nylon mesh. Och sedan, fyll en separat 1000 milliliter bägare med 200 milliliter blekmedel, och placera den i vävnadskultur huva. Kassera SDS-lösningen genom cellsilen, i bägaren som innehåller blekmedel.Pipet ut eventuella återstående SDS lösning, tills endast decellularized vävnad och cellen silen kvar i bägaren. Låt cellsilen ligga kvar i bägaren och tillsätt 500 milliliter färsk SDS-lösning. Täck bägaren med samma aluminiumfolie, och placera på en omrörningsplatta med samma hastighet som tidigare.Efter decellularization och tvättning, överföra decellularized vävnad, kallad njure ECM från denna punkt, i en 30 milliliter självstående koniska röret. Och fyll den med cellkultur grade vatten, tills alla vävnaden är nedsänkt. Använd först en vävnadshomogenator för att homogenisera njuren ECM i koniska röret i två minuter, tills en ogenomskinlig lösning utan synliga bitar av ECM erhålls.Därefter, sänk det koniska röret som innehåller njure ECM i flytande kväve tills kokning som omger röret inte längre kvarstår. Förvara njuren ECM på minus fyra grader Celsius över natten. För att lyophilize den frysta decellularized vävnaden, lätt lossa koniska rör locket för att möjliggöra gasutbyte, och placera röret i en lyophilization maskin.Lyophilize njure ECM i tre dagar, eller tills det liknar en fin, vitt pulver. För att kemiskt smälta och solubilisera gelen, tillsätt noggrant vägd svin mag pepsin, och 0,01 normal saltsyra till en scintillation avskyvärde som innehåller en rör bar. Rör om vid ungefär 500 RPM, tills all pepsin har löst sig.Sedan överföra lyophilized njure ECM till scintillation avsky och lämna lösningen på en rörplatta vid cirka 500 RPM i tre dagar för att göra beståndet njure ECM hydrogel. I en vävnadskultur huva, pipet de nödvändiga volymerna av cellkultur media, en normal natriumhydroxid och M199 tillägg, till en steril 30 milliliter självstående koniska röret. Blanda neutraliserande reagenslösning med en mikrospatel.Använd en steril en milliliterspruta för att överföra lämplig volym av stock kidney ECM hydrogel till neutraliserande reagenslösningen. Använd en mikrospatel för att försiktigt blanda lösningen tills en homogen i färg, hydrogellösning erhålls. Undvik att införa luftbubblor genom att röra långsamt och försiktigt.Att införliva celler i njure ECM hydrogel, resuspend tre hundra tusen celler i 10 mikroliter medium för varje hydrogel. Pipet 10 mikroliter av cell suspension i den slutliga njure ECM gel. Rör om lösningen med en mikrospatel tills cellerna är jämnt fördelade.Använd en milliliter spruta för att fylla önskad cellodling enhet med njure ECM hydrogel. Låt gelen ställas in på 37 grader Celsius i en timme innan cellerna överförs eller pläterades på njure ECM i cellodlingsanordningen. Analys av decellularized cortex vävnad genom massa spectrometry, avslöjade förekomsten av proteiner som är associerade med basilika lamina, med Kollagen-IV och Kollagen-I är den mest representerade.Kollagen-IV, A1 och A2 kedjor, allestädes närvarande i alla källare membran bevarades. Kollagen-IV, A3 och A5 kedjor, som endast finns i källaren membran i glomerulus, upptäcktes också. Vanliga iso former av Laminins och Kollagen-I upptäcktes också.Mänskliga njure peritubular microvascular endotelceller, eller HKMECs, odlade på Kollagen-I, njure ECM och en 1:1 blandning gel, visade skillnader i fenotyp. HKMECs odlade på Kollagen-I, visas enhetlig CD31 uttryck, sett i rött. Medan HKMECs odlade på de två geler som innehåller njure ECM, visas nedsatt CD31 uttryck i ojämna fördelningar.Matristyp verkade inte påverka VWF uttryck, visas i grönt. Samtidigt som man försöker detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg att helt homogenisera decellularized njur cortex vävnad. Vidare, vid blandning av gelen med neutraliserande reagenser, undvik införandet av luftbubblor.Mikrofysiologiska system möjliggör studier av organfunktion i en kontrollerad laboratorieinställning. Skapandet av sådana system kräver att celler, matriser och stimuli genomförs. Den kECM hydrogel som produceras här, kommer att tillåta oss att studera sådana system som rekapitulera njuren mikro miljöer.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Inkapsling av Cardiomyocytes i en Fibrin Hydrogel för hjärtvävnad Engineering

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

Odling av mänskliga neurala stamceller i en 3-dimensionell självorganiserande Peptide Hydrogel

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation

Konstruerar en tvåskiktad Hydrogel till Control ASC differentiering

Natural polymers over the years have gained more importance because of their host biocompatibility and ability to interact with cells in vitro and in ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

Syntes av ett intein medierad Artificiell Protein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Hydrogel nanopartiklar Skörd av plasma eller urin för att upptäcka låg förekomst Proteiner

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

En injicerbar and Drug belastad Supra Hydrogel för lokal kateter Injektion i Pig Heart

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Fabricating superhydrofoba Polymera material för biomedicinska tillämpningar

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Fabricating Cotton Analytical Devices

Tillverka Cotton Analytical Devices

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting Cellularized Konstrukt användning av en vävnadsspecifik Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Tillverkning av extracellulär matrix-härledda Skum och Mikrobärare som Vävnadsspecifik Cellodling och Delivery Platforms

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...