Name: fabricating a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel
Uploaded: 2018-10-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel at JoVE.com

Yazar Lynn ve Mike Garvey görüntüleme Laboratuvarı kök hücre ve rejeneratif tıp ve LifeCenter Kuzeybatı Enstitüsü'nde kabul etmek istiyorum. Ayrıca mali destek Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe, UH2/UH3 TR000504 (için J.H.) ve DP2DK102258 (için Y.Z.), NIH T32 eğitim hibe DK0007467 (R.J.N.) ve Kuzeybatı böbrek merkezleri için sınırsız bir hediye kabul etmek istiyorum Böbrek Araştırma Enstitüsü.

İnsan böbrek LifeCenter Derneği, Organ tedarik kuruluşlar tarafından ayarla etik yönergeleri izleyerek Kuzeybatı tarafından izole. Bu iletişim kuralı Washington Üniversitesi tarafından özetlenen hayvan bakım ve hücre kültür kuralları izler.
1. insan böbrek doku hazırlanması
<ol><li>Decellularization çözüm hazırlanması<ol>
<li>5000 mL kabı ve 70 x 10 mm heyecan bar sterilize.</li>
		<li>1: 1000 (ağırlık: cilt) Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) kabı autoclaved deiyoniz...

Matrisler hücre davranış yöneten önemli mekanik ve kimyasal yardımlar sağlayabilirsiniz. Sentetik hydrogels karmaşık 3 boyutlu desenlendirme destekler ancak fizyolojik matris microenvironments içinde bulunan çeşitli hücre dışı yardım sağlamak başarısız edebiliyoruz. Yerel ECM türetilmiş Hydrogels in vivo ve in vitro çalışmalar için ideal malzemelerdir. Önceki çalışmalarda decellularized ECM hydrogels kök hücre35,36</su...

Hücre dışı matriks (ECM) doku homeostazı korumak için önemli biyofiziksel ve biyokimyasal ipuçları sağlar. Karmaşık moleküler kompozisyonu doku yapısal ve işlevsel özellikleri düzenler. Yapısal proteinler hücre ile mekansal farkındalık sağlamak ve yapışma ve geçiş1için izin verir. İlişkili ligandlar hücre davranış2denetlemek için hücre yüzey reseptörleri ile etkileşim. Böbrek ECM moleküller olan kompozisyon ve yapısı değişir anatomik konumu, gelişimsel sahne ve hastalık durumu3,4bağlı olarak bir bolluk içerir. ECM karmaşıklığı recapitulating böbrek kaynaklı hücreler içinde vitroeğitim önemli bir yönüdür.
ECM microenvironments çoğaltılıyor önceki girişimleri iskele recellularization yeteneğine oluşturmak için decellularizing bütün doku üzerinde odaklanmıştır. Decellularization Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) gibi kimyasal deterjan veya non-iyonik deterjanlar ile gerçekleştirilen ve her iki bütün organ perfüzyon veya daldırma ve ajitasyon yöntemleri5,6,7 kullanır ,8,9,10,11,12,13. Burada sunulan iskele yerel doku ECM bulundu yapısal ve biyokimyasal ipuçları korumak; Ayrıca, recellularization donör özgü hücrelerle Rekonstrüktif Cerrahi14,15,da16,17,18, klinik önemi vardır 19. ancak, bu iskele eksikliği yapısal esneklik ve bu nedenle vitro çalışmalar için kullanılan birçok geçerli aygıtlar ile uyumsuzdur. Bu sınırlamayı aşmak için çok grup daha fazla hydrogels20,21,22,23,24decellularized ECM işleme. Bu hydrogels enjeksiyon kalıplama ve bioink ile uyumlu ve iskele yer hücrelerde decellularized mikrometre ölçekli kayma kısıtlamaları aşmak. Ayrıca, moleküler kompozisyonu ve yerel ECM bulundu oranları3,25korunur. Burada böbrek korteks ECM (kECM) elde edilen bir hidrojel imal etmek bir yöntemi göstermektedir.
Bu iletişim kuralının amacını microenvironment böbrek kortikal bölgesinin çoğaltır hidrojel üretmektir. Böbrek korteks doku hücresel madde kaldırmak için sürekli ajitasyon altında % 1 SDS çözümünde decellularized. SDS doku immünolojik hücresel malzeme6,7,9,26hızlı bir şekilde kaldırmak için onun yetenek nedeniyle decellularize için yaygın olarak kullanılır. KECM sonra mekanik homojenizasyon ve lyophilization5,6,9,11,26bağlıdır. Pepsin ile güçlü bir asit solubilization bir son hidrojel hisse senedi çözüm20,27içinde sonuçlanır. Yapısal için önemli yerli kECM protein desteği ve sinyal iletim3,25korunur. Hidrojel da için bir büyüklük içinde yerel insan böbrek korteks28,29,30gelled. Bu matris hydrogels için diğer matris proteinler karşılaştırıldığında böbrek özel hücre sendika korumak için kullanılan fizyolojik bir ortam sağlar. Ayrıca, matris kompozisyon, örneğin, kollajen eklenmesi manipüle edilebilir-ben modeli hastalığı ortamlara çalışma için böbrek fibrozis ve diğer böbrek hastalıkları31,32.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Preparation of Kidney Tissue</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5000 mL Beaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z740589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclaved DI H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Bar (70 x 10 mm)</td>
			<td>Fisher Science</td>
			<td>14-512-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Vacuum Filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97066-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS6795420D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Beaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS10031L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4642</td>
			<td>Any similar forceps may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor-Handle Hemostat Clamp</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z168866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z265977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle, No. 4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25859-000</td>
			<td>Any similar scalpel handle may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade, No. 20</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25860-020</td>
			<td>Any similar scalpel blade may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Bar (38.1 x 9.5 mm)</td>
			<td>Fisher Science</td>
			<td>14-513-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent Underpad</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82020-845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish (150 x 25 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclavable Biohazard Bag</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14220-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainer (40 um)</td>
			<td>Fisher Science</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Grade Water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30529.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL Freestanding Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89012-778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fabrication of ECM Gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Homogenizer Machine</td>
			<td>Polytron</td>
			<td>PCU-20110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze Dryer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7670520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL Glass Scintillation Vials and Cap</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V7130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Bar (15.9 x 8 mm)</td>
			<td>Fisher Science</td>
			<td>14-513-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from Porcine Gastric Mucosa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.01 N HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td>Dilute to 0.01 N HCl with cell culuture water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kidney ECM Gelation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 N NaOH (Sterile)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>415413</td>
			<td>Dilute to 1 N in cell culture grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tube</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11330.032</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Transferrin, Selenium, Sodium Pyruvate Solution (ITS-A) 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>51300-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z192325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspatula</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z193208</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabricating a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel

Hücre dışı matriks (ECM) doku homeostazı korumak için önemli biyofiziksel ve biyokimyasal ipuçları sağlar. Vitro kültür hücre ama fizyolojik davranış hücrelerden temin için gerekli protein ve ligand kompozisyon eksikliği için geçerli sentetik hydrogels güçlü mekanik destek sunuyoruz. Bu el yazması için bir böbrek korteks hidrojel ECM kaynaklı imalat yöntemi uygun mekanik sağlamlık ve destekleyici biyokimyasal kompozisyonu ile açıklar. Hidrojel mekanik homojenizasyon ve decellularized insan böbrek korteks ECM çözücü fabrikasyon olduğunu. Matrix yerli böbrek korteks ECM protein oranları da jelleşme fizyolojik mekanik stiffnesses için izin verirken korur. Hidrojel hangi böbrek korteks kaynaklı hücreleri fizyolojik koşullar altında korunabilir substratı olarak hizmet vermektedir. Ayrıca, hidrojel kompozisyon böbrek hastalıkları gelecekteki çalışma sağlayan bir hastalıklı ortam modellemek için manipüle edilebilir.

KECM hidrojel böbrek hücre kültürü ile yerel böbrek microenvironment olarak benzer kimyasal bileşimi için bir matris sağlar. Hidrojel imal etmek, böbrek korteks doku tüm böbrek organ ve doğranmış (Şekil 1) mekanik olarak izole edilmiştir. Decellularization deterjan parçacıkları (Şekil 2A.4-A.6) kaldırmak için su ile durular ardından kimyasal deterjan (Şekil 2A</strong...

Watch this Scientific Journal Video about Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel at JoVE.com

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Burada bir iletişim kuralı yerel böbrek hücre dışı matriks (ECM) yapısal ve biyokimyasal kompozisyonu tutulacağı bir böbrek korteks ekstraselüler matrisi elde edilen hidrojel imal etmek mevcut. İmalat süreci ve uygulamaları açıklanmıştır. Son olarak, böbrek özel cep ve doku rejenerasyonu ve Biyomühendislik desteklemek için bu hidrojel kullanarak bir bakış açısı ele alınmıştır.

Bir böbrek korteks ekstraselüler matrisi elde edilen hidrojel imalatı

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Bu yöntem, hücre matris etkileşimlerinin sülfatı nasıl etkilediği gibi biyomalzemeler alanındaki temel soruların yanıtlatına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, doğal böbrek korteks biyokimyasal mikro ortamlarını doğru bir şekilde yansıtan ilk malzemeyi üretmesidir. Bir doku kültürü başlığı bir yastık altında ile çizgi.Bir karıştırma çubuğu içeren bir litrelik beher yerleştirin, bir 150 milimetre steril doku kültür çanak, ve kaputun içine tüm böbrek. Kabı %1 SDS çözeltisinin 500 mililitresi ile doldurun. Steril doku kültür çanak böbrek yerleştirin.Bir neşter ile böbrek kapsülü etrafında hafifçe tıraş tarafından tüm perirenal yağ çıkarın. Sonra, altta yatan korteks dokusuna zarar vermeden böbrek kapsülü açmak için, böbrek üstün ucunda sığ bir 8 ila 10 santimetrelik bir kesi yapmak. Korteks dokusundan soyurarak böbrek kapsülü kaldırmak için iki hemostat kelepçekullanın.Böbreğin yan tarafı boyunca neşter kullanarak koronal düzlem boyunca böbreği ikiye ayırın. Neşter bölgeyi neşterle oyarak korteks dokusunu her iki yarıdan ayırın. Sonra, 0.5 santimetre küp parçalar halinde korteks dokusu zar ve herhangi bir büyük, görünür damarları kaldırın.Böbrekten ekstrasellüler matriks izole etmek için, sds çözeltisi içeren beher içine doğranmış korteks dokusu yerleştirin. Otoklavlı alüminyum folyo ile kaplayın ve doku kültürü başlık dışında, yaklaşık 400 RPM bir karıştırma plakası üzerine yerleştirin. Karıştırma 24 saat sonra, bir doku kültürü başlık içine beher getirmek.Naylon örgü ile yapılan 40 mikron steril hücreli süzgeç ekleyin. Ve sonra, 1000 mililitrelik ayrı bir kabı 200 mililitre çamaşır suyuyla doldurun ve doku kültürüne yerleştirin. SDS çözeltisini hücre süzgecinden geçirerek çamaşır suyu içeren kabın içine atın.Kalan SDS çözeltisini sadece hücredışı doku ve hücre süzgeci kabında kalana kadar dışarı çıkar. Hücre süzgecini kabın içinde bırakın ve 500 mililitre taze SDS çözeltisi ekleyin. Aynı alüminyum folyo ile kaplayın ve daha önce aynı hızda bir karıştırma plakası üzerine yerleştirin.Hücredışılaştırma ve yıkamadan sonra, bu noktadan itibaren böbrek ECM olarak adlandırılan hücredışı doku, 30 mililitrelik kendi kendine duran konik tüp içine transfer. Ve tüm doku lar sular altında kalana kadar hücre kültürü sınıfı suyla doldurun. İlk olarak, konik tüpte böbrek ECM homojenize etmek için bir doku homogenizer kullanın, ECM görünür parçaları ile opak bir çözüm elde edilene kadar.Daha sonra, tüp çevreleyen kaynama kadar sıvı azot böbrek ECM içeren konik tüp batırın artık devam eder. Böbrek ECM'sini bir gecede eksi 4 derecede saklayın. Dondurulmuş hücreli doku lyophilize için, biraz gaz değişimi için izin konik tüp kapağı gevşetin, ve bir lyophilization makineiçine tüp yerleştirin.Üç gün boyunca böbrek ECM lyophilize, ya da ince, beyaz toz benzeyene kadar. Kimyasal sindirmek ve jel solubilize etmek için, dikkatle tartılmış domuz mide pepsin ekleyin, ve 0.01 bir scintillation aşağılık bir scintillation için bir scintillation bar içeren. Tüm pepsin eriyene kadar, yaklaşık 500 RPM karıştırın.Daha sonra, sintillation aşağılık lyophilized böbrek ECM aktarın ve stok böbrek ECM hidrojel yapmak için üç gün boyunca yaklaşık 500 RPM bir karıştırma plakası üzerinde çözüm bırakın. Bir doku kültürü başlık olarak, steril bir 30 mililitre lik kendi kendine ayakta konik tüp içine hücre kültürü medya, bir normal sodyum hidroksit ve M199 takviyesi gerekli hacimlerde pipet. Nötralize reaktif çözeltisini mikro spatula ile karıştırın.Nötralize reaktif çözeltisi stok böbrek ECM hidrojel uygun hacmi aktarmak için steril bir mililitre şırınga kullanın. Homojen bir renk, hidrojel çözeltisi elde edilene kadar çözeltiyi nazikçe karıştırmak için mikro spatula kullanın. Yavaş ve yavaşça karıştırarak hava kabarcıkları tanıtmakkaçının.Böbrek ECM hidrojel içine hücreleri dahil etmek için, her hidrojel için orta 10 mikrolitre üç yüz bin hücreleri resuspend. Pipet 10 mikrolitre hücre süspansiyonu son böbrek ECM jeline. Hücreler eşit dağıtılana kadar bir mikro spatula ile çözelti yikarıştırın.Böbrek ECM hidrojel ile istenen hücre kültürü cihazı doldurmak için bir mililitre şırınga kullanın. Hücre kültürü cihazında hücreleri böbrek ECM'sine aktarmadan veya kaplamadan önce jelin bir saat boyunca 37 santigrat dereceye ayarlanın. Kütle spektrometresi ile hücreli korteks dokusunun analizi, fesleğen lamina ile ilişkili proteinlerin varlığını ortaya koymuştur, Kollajen-IV ve Kollajen-I en yüksek temsil olmak.Kollajen-IV, A1 ve A2 zincirleri, tüm bazal membranlarda korunmuştur. Glomerulusun sadece bazal membranlarında bulunan kollajen-IV, A3 ve A5 zincirleri de saptandı. Laminalar ve Kollajen-I'nin ortak izo formları da tespit edildi.İnsan böbrek peritubüler mikrovasküler endotel hücreleri, veya HKMECs, Kollajen-I kültürlü, böbrek ECM, ve 1:1 karışım jel, fenotip farklılıkları gösterdi. Kollajen-I'de kültürlenen HKMEC'ler, kırmızı renkte görülen tek tip CD31 ifadesini sergilediler. HKMECs böbrek ECM içeren iki jel kültürlü iken, düzensiz dağılımlarda azaltılmış CD31 ifadesi görüntülenir.Matris türü, yeşil renkle gösterilen VWF ifadesini etkilemiyor. Bu işlemi denerken, tamamen hücreleşmiş böbrek korteks dokusu homojenize hatırlamak önemlidir. Ayrıca, nötralize reaktifler ile jel karıştırırken, hava kabarcıkları giriş kaçının.Mikro fizyolojik sistemler kontrollü bir laboratuvar ortamında organ fonksiyonunun incelenmesine olanak sağlar. Bu tür sistemlerin oluşturulması hücrelerin, matrislerin ve uyaranların uygulanmasını gerektirir. Burada üretilen kECM hidrojel, böbrek mikro ortamlarını özetleyen sistemleri incelememize olanak sağlayacaktır.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Kalp Doku Mühendisliği Fibrin Hidrojel kardiyomiyositlerinin Kapsülleme

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

3 boyutlu montaj Self-Peptid Hidrojel İnsan Sinir Progenitör Hücreler Yetiştiriciliği

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation

ASC farklılaşma kontrol için bir iki tabakalı Hidrojel mühendislik

Natural polymers over the years have gained more importance because of their host biocompatibility and ability to interact with cells in vitro and in ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

Bir Intein aracılı yapay protein Hidrojel sentezi

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Düşük Bolluk Proteinler saptamak için plazma veya idrar hidrojel Nanoparçacık Hasat

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

Domuz Kalbe Yerel Kateter Enjeksiyon için bir Enjekte ve İlaç yüklü Supramoleküler Hidrojel

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Biyomedikal Uygulamalar için Süperhidrofobik Polimer Malzemeler imalatı

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Fabricating Cotton Analytical Devices

Pamuk Analitik Cihazlar imalatı

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting cellularized dokuya özel Hidrojel Bioink kullanılarak dahil edilmesi

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Doku spesifik Hücre Kültürü ve Delivery Platform olarak Ekstrasellüler Matriks kaynaklı Köpükler ve mikro Fabrikasyon

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...