Name: conducting multiple imaging modes with one fluorescence microscope
Uploaded: 2018-10-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope at JoVE.com

J.F. Searle akademisyenler Program ve NIH yönetmenin yeni yenilikçi Ödülü destek kabul eder. Yazar Paul Selvin'ın Lab (Illinois Üniversitesi, Urbana-Champaign) 3-b objektif konumlandırma için yararlı öneriler kabul etmiş oluyorsunuz.

1. mikroskop tasarım ve montaj
<ol><li>
Uyarma yolu Not: Lazerler, fark girişim kontrast (DIC) bileşenleri, mikroskop beden ve onun aydınlatma kol uyarma yolu içerir.<ol>
<li>Titreşim izole optik masa hazırlamak. Örneğin, bir yapısal amortisörleri tablosu 48 x 96 x 12'' tüm bileşenler için yeterli alan sunuyor. Not: kurulum ile sıcaklık kontrolü (Örneğin, 21.4 ± 0.55 ° C) bir odada kurmak. Sıcaklık kararlılığı optik uyum korumak açısından önemlidir.</li>
		...

<ol>
	<li>Lipson, S. G., Lipson, H., Tannhauser, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optical physics. , (1995).</li><li>T&#246;r&#246;k, P., Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rigorous+theory+for+axial+resolution+in+confocal+microscopes.">Rigorous theory for axial resolution in confocal microscopes.</a> Optics Communications. 137 (1-3), 127-135 (1997).</li><li>Klar, T. A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction+resolution+in+far-field+fluorescence+microscopy.">Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy.</a> Optics Letters. 24 (14), 954-956 (1999).</li><li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission:+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy.">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Optics Letters. 19 (11), 780-782 (1994).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination.">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li><li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction+multicolor+imaging+of+the+nuclear+periphery+with+3D+structured+illumination+microscopy.">Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy.</a> Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Balzarotti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometer+resolution+imaging+and+tracking+of+fluorescent+molecules+with+minimal+photon+fluxes.">Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes.</a> Science. 355 (6325), 606-612 (2017).</li><li>Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrabright+photoactivatable+fluorophores+created+by+reductive+caging.">Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging.</a> Nature Methods. 9 (12), 1181-1184 (2012).</li><li>Ha, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+interaction+between+two+single+molecules:+fluorescence+resonance+energy+transfer+between+a+single+donor+and+a+single+acceptor.">Probing the interaction between two single molecules: fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6264-6268 (1996).</li><li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-molecule+FRET.">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li><li>Hua, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+surface+passivation+method+for+single-molecule+studies.">An improved surface passivation method for single-molecule studies.</a> Nature Methods. 11 (12), 1233-1236 (2014).</li><li>Fei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+biochemistry.+Determination+of+in+vivo+target+search+kinetics+of+regulatory+noncoding+RNA.">RNA biochemistry. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA.</a> Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).</li><li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li><li>Stracy, M., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+and+super-resolution+imaging+of+transcription+in+living+bacteria.">Single-molecule and super-resolution imaging of transcription in living bacteria.</a> Methods. 120, 103-114 (2017).</li><li>Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+development+of+photoactivatable+fluorescent+proteins+for+single-molecule-based+superresolution+imaging.">Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8452-8457 (2014).</li><li>Sekar, R. B., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET)+microscopy+imaging+of+live+cell+protein+localizations.">Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations.</a> The Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).</li><li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+reveals+that+disruption+of+ciliary+transition-zone+architecture+causes+Joubert+syndrome.">Super-resolution microscopy reveals that disruption of ciliary transition-zone architecture causes Joubert syndrome.</a> Nature Cell Biology. 19 (10), 1178-1188 (2017).</li><li>Youn, Y., Ishitsuka, Y., Jin, C., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+nanoimprint+lithography+for+drift+correction+in+super-resolution+fluorescence+microscopy.">Thermal nanoimprint lithography for drift correction in super-resolution fluorescence microscopy.</a> Optics Express. 26 (2), 1670-1680 (2018).</li></ol>

Bu melez mikroskop sistem birden fazla mikroskoplar satın almak için ortadan kaldırır. Optik tablo, tablo yükleme işçilik, yazılım ve iş istasyonu, dahil bütün parçalar için maliyet yaklaşık $230.000 toplamdır. Mag lens ve 3-b lens, dahil, özel işlenmiş parçalar yaklaşık 700 $ (farklı kurumları gerçek masrafları maliyeti bağlıdır) maliyet. Tipik piyasada bulunan entegre sistemleri tek molekül algılama tabanlı SR mikroskobu fazla 300.000 $ maliyet için ~ 400.000 ve değil kolayca smFRET ?...

Floresans mikroskoplar modern biyolojik bilim araştırma için önemli araçlar ve floresan görüntüleme düzenli olarak birçok biyoloji laboratuvarlarında yapılan. Biomolecules fluorophores ile ilgi etiketleyerek, biz doğrudan onları mikroskop altında görselleştirmek ve yerelleştirme, uyum, etkileşim ve derleme devlet içinde VIVO veya vitrozamana bağımlı değişiklikleri kaydetmek. Geleneksel floresan mikroskoplar ~ 200-300 nm yanal yönde ve ~ 500-700 nm eksenel yönde1,2ve vardır, bu nedenle, düşsel vasıl 100'ler için sınırlı olduğunu bir kırınım-sınırlı kayma çözünürlüğe sahip nanometre mikron ölçek. Moleküler derleme veya kuruluşunuzdaki ince ayrıntıları ortaya çıkarmak için kırınım sınırı zarar verebilir çeşitli SR microscopies geliştirilmiştir. SR elde etmek için kullanılan stratejiler içerir uyarılmış emisyonu tükenmesi (STED) mikroskopi3,4 ve yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM)5,6, gibi doğrusal olmayan optik etkileri 7, Stokastik optik imar mikroskobu (fırtına)8 ve photoactivated yerelleştirme mikroskobu (PALM)9ve MINFLUX10gibi her ikisinin bir birleşimi gibi tek moleküllerin Stokastik algılama. Bu SR microscopies arasında tek molekül algılama tabanlı SR mikroskoplar tek molekül mikroskop set-up nispeten kolayca değiştirilebilir. Tekrarlayan harekete geçirmek ve photoactivatable floresan proteinler (FPs) veya fotoğraf değiştirilebilir boyalar üzerinde ilgi biomolecules öğesini görüntüleme ile Uzaysal Çözünürlük 10-20 nm11ulaşabilirsiniz. Moleküler etkileşimleri ve konformasyon bilgi elde etmek için gerçek zamanlı, angstrom nanometre çözünürlükte dynamics gereklidir. smFRET12,13 bu çözünürlük elde etmek için bir yaklaşımdır. Genel olarak, faiz biyolojik sorular bağlı olarak, görüntüleme yöntemleri farklı uzamsal çözünürlük ile ihtiyaç vardır.
Tipik olarak, görüntüleme her türü için belirli uyarma ve/veya emisyon optik yapılandırmasına gerek yoktur. Örneğin, tek molekül algılama için en sık kullanılan aydınlatma yöntemlerden birini belirli uyarma açı bir prizma veya objektif lens yoluyla ulaşılması gereken toplam iç yansıma (tır), geçer. SmFRET tespiti için donör ve alıcısı boyalar emisyonları dağınık şekilde ayrılmış olup elektron-çarpımı, şarj kuplajlı birtakım aynalar ve dikroik ışın ayırıcılar ile elde edilebilir cihaz (EMCCD), farklı bölümlerine yönelik gerek emisyon yolundaki yerleştirilir. Üç boyutlu (3-D), düşsel bir optik, bir bileşen bir silindirik objektif14, SR emisyon yolundaki bir astigmat etkiye neden için gereklidir. Bu nedenle, homebuilt veya piyasada bulunan entegre mikroskoplar genellikle, işlevsel olarak görüntüleme yöntemi her türü için uzmanlaşmış olan ve aynı kurulum üzerinde farklı görüntüleme yöntemleri arasında geçiş yapmak için esnek değildir. Burada üç farklı görüntüleme yöntemleri arasında ayarlanabilir ve tekrarlanabilir anahtarları sağlayan bir maliyet-etkin, hibrid sistemi mevcut: kırınım-sınırlı çözünürlük, tek molekül algılama tabanlı SR ile geleneksel epi-floresan görüntüleme görüntü ve çok renkli tek molekül algılama, smFRET (Şekil 1A) görüntüleme dahil olmak üzere. Özellikle, burada sunulan set-up fiber birleştiğinde giriş lazerler çok renkli uyarma için içerir ve epi- ve tır modları arasında geçiş yapmak için uyarma açı kontrolünü sağlar uyarma yolunda bir ticari aydınlatma kol programlanmış. Emisyon yolundaki bir çıkarılabilir homebuilt silindirik objektif Kaset 3-b SR görüntüleme için mikroskop gövdesi içinde yerleştirilir ve bir ticari ışın ayırıcı seçerek birden fazla emisyon kanal algılamak için etkin bir EMCCD kamera önce yerleştirilir aynı anda.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nikon Ti-E microscope stand</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>100X NA 1.49 CFI HP TIRF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy imaging software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS-Elements Advanced Research/HC</td>
			<td>HC includes &#34;JOBS&#34; module, the programmed acquisition module being used for SR imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The illumination arm</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-TIRF-EM Motorized Illuminator Unit M</td>
			<td>This arm has a slot for a magnification lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analyze block</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-A</td>
			<td>This is installed in the filter turret.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z-drift correction system</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>PFS</td>
			<td>This system is composed by the stepmotor on the objective nosepiece, IR LED, and a detector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical table top</td>
			<td>TMC</td>
			<td>783-655-02R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical table bases</td>
			<td>TMC</td>
			<td>14-426-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>647 nm laser</td>
			<td>Cobolt</td>
			<td>90346 (0647-06-01-0120-100)</td>
			<td>Modulated Laser Diode 647nm 120mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>561 nm laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>1280721</td>
			<td>OBIS 561nm LS 150mW Laser System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 nm laser</td>
			<td>Cobolt</td>
			<td>90308 (0488-06-01-0060-100)</td>
			<td>Modulated Laser Diode 488nm 60mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405 nm laser</td>
			<td>Crystalaser</td>
			<td>DL405-025-O</td>
			<td>405 (+/-5)nm, 25mW, Circular , M2 &#60;1.3, Low Noise, CW, TTL up to 20MHz. 2 BNC connectors for TTL &#38; Analog adjust</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat sink</td>
			<td>Cobolt</td>
			<td>11658 (HS-03)</td>
			<td>Two units, Heat sink without fan HS-03, Heat sink for 647 nm and 488 nm lasers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat sink</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>1193289</td>
			<td>Obis heat sink with fan, 165 x 50 x 50 mm for the 561 nm laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAB-USB-miniUSB</td>
			<td>Cobolt</td>
			<td>10908</td>
			<td>Two units, communication cable for 647 nm and 488 nm lasers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aluminum for height adjustment</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9146T35</td>
			<td>Multipurpose 6061 Aluminum, Rectangular Bar, 4MM X 40MM, 1&#39; Long for raising 561 nm laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aluminum for height adjustment</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8975K248</td>
			<td>Multipurpose 6061 Aluminum, 1-1/4&#34; Thick X 3&#34; Width X 1&#39; Length for raising 405 nm laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC cable</td>
			<td>L-com</td>
			<td>CC58C-6</td>
			<td>RG58C Coaxial Cable, BNC Male / Male, 6.0 ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC adapter</td>
			<td>L-com</td>
			<td>BA1087</td>
			<td>Coaxial Adapter, BNC Bulkhead, Grounded</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMA to BNC Adapter</td>
			<td>HOD</td>
			<td>SMA-870</td>
			<td>Cobolt MLD lasers have SMA interface, so this adapter is used for BNC connection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMB to BNC Adapter</td>
			<td>Fairview Microwave</td>
			<td>FMC1638316-12</td>
			<td>SMB Plug to BNC Female Bulkhead Cable RG316 Coax in 12 Inch for Coherent Obis lasers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition Card</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>PCI-6723</td>
			<td>13-Bit, 32 Channels, 800 kS/s Analog Output Device for controlling lasers, DIC LED, and etc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barrier Filter Wheel controller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>Lambda 10-B</td>
			<td>Optical Filter Changer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission Splitter</td>
			<td>Cairn</td>
			<td>OptoSplit III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic beamsplitter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>T640LPXR-UF2</td>
			<td>Dichroic beamsplitter separating red emission from green emission in OptoSplit III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic beamsplitter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>T565LPXR-UF2</td>
			<td>Dichroic beamsplitter separating green &#38; red emission from blue emission in OptoSplit III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET700/75M</td>
			<td>Two units, Emission filter for red emission (like Alexa Fluor 647) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET595/50M</td>
			<td>Two units, Emission filter for yellow/green emission (like Cy3B) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET525/50M</td>
			<td>Two units, Emission filter for blue emission(like Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF02-447/60-25</td>
			<td>Emission filter for violet emission (like DAPI/Alexa Fluor 405), installed in the Barrier filter wheel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic beamsplitter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>zt405/488/561/647/752rpc-UF3</td>
			<td>Multiband dichroic beam splitter for 647, 561, 488, and 405 nm laser excitations inside of the microscope body</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Filter set</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49000</td>
			<td>installed in the microscope body</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon laser/TIRF filtercube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>91032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>590 long pass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>T590LPXR-UF1</td>
			<td>for combining 647 nm laser and 561 nm laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>525 long pass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>T525LPXR-UF1</td>
			<td>for combining already combined 647 nm and 561nm lasers with 488 nm laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>470 long pass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>T470LPXR-UF1</td>
			<td>for combining already combined 647 nm, 561 nm and 488 nm lasers with 405 nm laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser clean-up filter (647)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>zet640/20x</td>
			<td>for cleaning up other wavelengths from the 647 nm laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser clean up filter (488)</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>LL01-488-25</td>
			<td>for cleaning up other wavelengths from the 488 nm laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED light source</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>X-Cite120LED</td>
			<td>used only for DAPI imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirror mount</td>
			<td>Newport</td>
			<td>SU100-F3K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical posts</td>
			<td>Newport</td>
			<td>PS-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamping fork</td>
			<td>Newport</td>
			<td>PS-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Meter</td>
			<td>Newport</td>
			<td>PMKIT</td>
			<td>For measuring laser power</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic beamcombiner mount</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>58-872</td>
			<td>C-Mount Kinematic Mount, for holding dichroic beamcombiners in the laser excitation assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining ring</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CMRR</td>
			<td>used for dichroic beamcombiner mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Adapter Plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1FC</td>
			<td>FC/PC Fiber Adapter Plate with External SM1 (1.035&#34;-40) Thread</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z-axis translational mount</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1Z</td>
			<td>Z-Axis Translation Mount, 30 mm Cage Compatible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Achromatic Doublet lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC050-008-A-ML</td>
			<td>&#216;5 mm, Mounted Achromatic Doublets, AR Coated: 400 - 700 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage Plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CP1TM09</td>
			<td>30 mm Cage Plate with M9 x 0.5 Internal Threads, 8-32 Tap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage Assembly Rod</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ER4</td>
			<td>Cage Assembly Rod, 4&#34; Long, &#216;6 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage Mounting Bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CP02B</td>
			<td>30 mm Cage Mounting Bracket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single mode optical fiber</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>P5-405BPM-FC-2</td>
			<td>Patch Cable, PM, FC/PC to FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi mode optical fiber</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M42L01</td>
			<td>&#216;50 &#181;m, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Fiber Patch Cable, 1 m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Achromatic Doublet lens (mag lens)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ACN127-025-A</td>
			<td>ACN127-025-A - f=-25.0 mm, &#216;1/2&#34; Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm , a concave lens in the &#34;mag lens&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Achromatic Doublet lens (mag lens)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC127-050-A</td>
			<td>f=50.0 mm, &#216;1/2&#34; Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, a convex lens in the &#34;mag lens&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining ring</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM05PRR</td>
			<td>SM05 Plastic Retaining Ring for &#216;1/2&#34; Lens Tubes and Mounts, for &#34;mag lens&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon-tipped screw</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SS3MN6</td>
			<td>M3 x 0.5 Nylon-Tipped Setscrew, 6 mm Long, for holding &#34;3D lens&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D lens</td>
			<td>CVI Laser Optics</td>
			<td>RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700</td>
			<td>f=10 m, rectangular cylindrical lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon Ultra 888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 nm multichannel beads</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>T7279, TetraSpeck microspheres</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red dye</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Alexa Fluor 647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yellow-green dye</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Cy3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>green dye</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Cy3B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blue dye</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Alexa Fluor 488</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

conducting multiple imaging modes with one fluorescence microscope

Floresans mikroskobu biyolojik moleküller üzerine çalışmaları in situ algılamak ve onların dinamiği ve etkileşim gerçek zamanlı olarak izlemek için güçlü bir araçtır. Geleneksel epi-floresan mikroskopi ek olarak, belirli deneysel hedeflere ulaşmak için çeşitli görüntüleme teknikleri geliştirilmiştir. Bazı yaygın olarak kullanılan teknikler konformasyon değişiklikler ve angstrom çözünürlük ve tek molekül algılama tabanlı moleküler etkileşimleri bildirebilirsiniz tek molekül floresans rezonans enerji transfer (smFRET), dahil uzaysal çözünürlüğü için yaklaşık on twentyfold kırınım-sınırlı Mikroskopi için karşılaştırıldığında artırabilir görüntüleme-Süper çözünürlük (SR). Burada bir mikroskop, geleneksel epi-floresan görüntüleme, tek molekül algılama tabanlı SR görüntü ve çok renkli tek molekül algılama dahil olmak üzere birden çok görüntüleme yöntemleri birleştirir bir müşteri tasarlanmış entegre sistemi, mevcut, smFRET görüntüleme dahil olmak üzere. Farklı görüntüleme yöntemleri kolayca ve tekrarlanarak optik öğeleri geçiş yaparak elde edilebilir. Bu kurulum rutin ve düşük maliyet ve bireysel amaçlar için ayrı mikroskoplar bina göre alan çeşitli görüntüleme deneyler için bir ihtiyaç ile Biyoloji Bilimleri herhangi bir araştırma laboratuvarı tarafından evlat edinmek kolaydır.

Bu mikroskop esnek ve tekrarlanabilir farklı görüntüleme yöntemleri arasında geçiş sağlar. Burada her görüntüleme modülü ile toplanan örnek resimleri göster.
Şekil 5 d üzerinde yanıp sönen molekül PSF SR alım sırasında gösterir. Böyle görüntüleri binlerce son SR görüntü (Şekil 5E) oluşturmak için yeniden. Şekil 5E...

Watch this Scientific Journal Video about Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope at JoVE.com

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Çoklu görüntüleme modları bir floresan mikroskop ile iletken

Burada geleneksel epi-floresan görüntüleme, tek molekül algılama tabanlı süper kararlılık düşsel ve çok renkli tek molekül algılama birleştiren, bir tümleşik mikroskobu sistem inşaat pratik bir rehber mevcut de dahil olmak üzere tek molekül floresans rezonans enerji görüntüleme, maliyet-etkin bir şekilde bir set-up içine aktarın.

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Bu yöntem, optik mikroskopi alanındaki süper çözünürlüklü görüntülerin yanı sıra aynı mikroskopu kullanarak FRET görüntülerinin nasıl alınabileceği gibi anahtar soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, üç farklı görüntüleme modülünü tek bir mikroskopta birleştirerek toplam maliyeti önemli ölçüde azaltabiliyor olmamızdır. Uyarma yolunun montajı öğrenilen zor olduğu için bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir.Uygun parça seçimi ve hassas optik hizalamalar gerektirir. Başlamak için, bir PCI arabirimi üzerinden bir veri toplama kartı yükleyin ve lazerleri bilgisayara bağlamak için kullanın. Transistör-transistör mantığı çıkışı ve bu kartın analog çıkışı ile güç ayarı ile lazerlerin açık ve kapalı davranışlarını kontrol edin.Daha sonra, burada gösterildiği ve eşlik eden metin protokolünde açıklandığı gibi aynalar ve ışın ayırıcıları ile titreşim izole edilmiş bir optik tablo hazırlayın. Lazer ışınlarını ilk olarak z eksenli çeviri yuvasına fiber adaptör plakası takarak tek modlu optik fiber olarak birleştirin. Daha sonra, bir kafes plaka bir akromatik doublet lens monte.Bir kafes oluşturmak için adaptör ve lens bağlamak için bir uzatma çubuğu kullanın. Ardından, kafesi optik masaya monte etmek için bir inç kalınlığında optik direkler kullanın. 647 nanometrelazeri, lifler aracılığıyla maksimum lazer güç çıkışı elde etmek için bileşenleri ayarlayarak hizalayın.İlk lazerin hizalanması yapıldıktan sonra, geçici olarak bir çift irises tonuyla tonuyla layın ve lazerlerin geri kalanını tek tek hizalayın. Bir güç ölçer ile her lazerin hizalama verimliliğini kontrol edin. Lazerlerin yansımalarını azaltmak için adaptör plakasının önünde bir iris bıraktığından emin olun.Daha sonra, eşlik eden metin protokolünde açıklandığı gibi büyütme merceği tasarlayın ve kurun. Her bir molekülün z-koordinatlarını çıkarmak için gerekli astigmatist efektini oluşturmak için, kasete 10 metre odak uzaklığına sahip bir 3D lens yerleştirin ve emisyon ışını yoluna yerleştirin. Sıralı çok renkli epifloresan görüntüleme sırasında titreşimleri en aza indirmek için, mikroskobun yanına bağlı bir bariyer filtre tekerleğine yerleştirilen emisyon filtrelerini kullanın.Tek moleküllü FRET deneyleri sırasında eşzamanlı çoklu renk algılama için, emisyon ayırıcıya başka bir filtre seti yerleştirin. Epi-uyarma kullanarak kırınım sınırlı görüntüleme için ayarlamak için, öncelikle uyarma lazerin tesadüfi açısını aydınlatma kolundaki epi moduna ayarlayın. Daha sonra, 3D lensi devre dışı bırakıp emisyon bölücüse baypas küpü yerleştirin.Daha sonra, geniş aydınlatma için mag lens takın. Ayarlandıktan sonra, istediğiniz sonuçlara göre numunenizin çok kanallı, z-stack ve/veya zaman aşımına geçmiş görüntülerini alın. Yüzeyimize edilmiş moleküllerin çok renkli tek moleküllü algılamasını ayarlamak için, önce filtre tekerleğiboş bir konuma taşıyın.Bu lazerlerin geçmesine izin verecek. Daha sonra uyarma lazerlerinin tesadüfi açısını çim açısına ayarlayın ve hem mag hem de 3D lensleri devre dışı edin. Ardından, ilk önce tüm ışığın tüm kanallardan geçmesine izin veren bir kalibrasyon küpü ile baypas küpü değiştirerek emisyon bölücü üç kanallı modu meşgul.Ardından, DIC altındaki kamerayı açın ve emisyon bölücünün diyafram açıklığını ekranda tam olarak ayrılmış üç kanal belirene kadar ayarlayın. Emisyon bölücüse dikey yatay ayar kontrol düğümlerini çevirin ve üç kanalı kabaca hizala. Ardından, kamerayı kapatın ve kalibrasyon küpü ile üçlü küp değiştirin.100 nanometrelik çok kanallı boncuklardan oluşan bir örnek yerleştirin. 488 nanometrede uyarma üzerine, 100 nanometrelik çok kanallı boncuklar farklı ışık dalga boylarında ışık yakımını sağlayarak üç kanallı hizalama yı sağlarlar. Ardından, kamerayı ve 488 nanometre lazeri açın, parlak boncuklardan birini yakınlaştırın ve son olarak ayarlama kontrol düğümlerini tekrar çevirerek üç kanalı hizalayın.Örnek şimdi yerinde, zayıf bir lazer kullanarak, makul bir nokta yoğunluğu ile bir alana gidin ve kabul edilebilir sinyal-gürültü ve fotobeyaznasyon düzeyleri elde etmek için lazer gücü ve pozlama süresini ayarlayın. Ardından, hızlandırılmış görüntüler çekmek için görüntüleme yazılımını kullanın. Süper çözünürlüklü görüntüleme için, 3D lens takarak başlayın ve mag lens içıkarın.Daha sonra çim açısı olmak için optimal uyarma lazer tesadüfi açısını belirleyin. SR görüntüleme için uygun nesnel yüksekliği bulmak için, hücrelerin orta düzlemini bulmak için DIC görüntüleme kullanın. Düzlemi hücrelerin saydam hale geldiği yüksekliğe göre tanımlayın.İstenilen odak düzlemi belirlendikten sonra süper çözünürlüklü görüntülemeye başlayın. Görüntüleme sırasında, yanıp sönen noktalar makul bir yoğunluk korumak için 405 nanometre lazer gücünü değiştirin. Menekşe lazer gücü olmadan görüntülemeye başlayın.Belirli bir dönemde yanıp sönen noktaların sayısını sayın ve mor lazer gücünü artırın, böylece yanıp sönen nokta sayısı görüş alanında kullanıcı tarafından tanımlanan bir sayma eşiğinin üzerinde tutulur. Görüntüleme çerçevelerinde her noktanın santriomlarını algılayarak verileri analiz edin ve x ve y genişliklerinden her nokta için z değerlerini ayıklayın. Yeniden oluşturulmuş bir görüntü oluşturun ve nesneleri 3B olarak görselleştirin.Bu mikroskop kurulumu, geleneksel epifloresan görüntüleme, tek moleküllü algılama tabanlı süper çözünürlüklü görüntüleme ve çok renkli tek moleküllü algılama gibi farklı görüntüleme yöntemleri arasında esnek ve tekrarlanabilir geçiş sağlar. Moleküler montajda daha ince ayrıntıları ortaya çıkarmak için, süper çözünürlüklü mikroskopi bunun gibi binlerce görüntüyü birleştirir. Bu görüntüler daha sonra son bir süper çözünürlüklü görüntü oluşturmak için yeniden oluşturulur.Süper çözünürlük teknikleri, diğer tekniklerle görülemez ayrıntıları sağlayarak, yüksek uzamsal çözünürlük sağlar. Bu, burada gösterilen iki resimde vurgulanır. Süper çözünürlüklü görüntü epifloresan görüntü olarak aynı bakteriyel düzenleyici RNase gösterir ama tek molekül algılama sağlar.SmFRET nanometre çözünürlüğe angstrom yeteneğine sahip başka bir yöntemdir. Burada katlanmış RNA molekülleri yeşil donör boya ve kırmızı alıcı boya ile etiketlenmiştir. Floresan yoğunluk yörüngeleri tek tek moleküllerden çıkarılabilir, zamanın bir fonksiyonu olarak FRET verimliliği üreten.Lazerlerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın ve bu işlemi yaparken her zaman göz koruması takmak veya lazer güçlerini düşürmek gibi önlemler alınmalıdır.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Yaşayan Hücreler Moleküler Rotorlar arasında Flüoresans Ömrü Görüntüleme

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

Optik Frekans Domain Görüntüleme<em&gt; Ex vivo</em&gt; Pulmoner Rezeksiyon Örnekler: Histopatoloji Korelasyon için Birebir Görüntü Alınması

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting ...

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

RootChip kullanarak Kök Çevre Rapid manipülasyonu ile Arabidopsis Kök Büyüme Time-lapse Floresans Görüntüleme

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Floresan Mikroskobu ile Görüntüleme Hücre Göç Yapıştırıcı ve Çözünür Degradeler oluşturma

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

One Minute, Sub-One-Watt Photothermal Tumor Ablation Using Porphysomes, Intrinsic Multifunctional Nanovesicles

One Minute, Porphysomes Sub-Bir-Watt Fototermal Tümör Ablasyon, İçsel fonksiyonlu Nanovesicles

We recently developed porphysomes as intrinsically multifunctional nanovesicles. A photosensitizer, pyropheophorbide &alpha;, was conjugated to a ...

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

Nicel Optik Mikroskopi: Hücresel biyofizik ölçümü Standart Optik Mikroskop ile Özellikleri

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

Modifiye İki foton mikroskop 3D Orbital Takip: Hücre içi veziküllerin İzlemeye Bir Uygulama

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Ticari Mikroskop Canlı Hücre Zarları Moleküler Difüzyon Kanunu Hızlı Floresans Görüntüleme Gönderen

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

Çoklu Renkler Yüksek hızında Yapısal Aydınlatma TIRF Mikroskopi A Guide

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...