Name: visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence
Uploaded: 2018-11-06T13:30:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence at JoVE.com

غبطة معتمد من قبل بدء التمويل من كلية الطب و SFB829 من جامعة كولونيا. C.X. معتمد من قبل DFG منح با 5810/1-1. نود أن نشكر "مرافق التصوير" في مركز أبحاث سكاد والنصب التذكاري مركز سلون كيترينج للسرطان (نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية). ونحن نشكر خواكين غريغو-بيسا (الإسبانية المركز الوطني "أبحاث القلب والأوعية الدموية"، مدريد، إسبانيا) لبصيرته في تصاعد الأجنة ومف.

جميع التجارب التي تشمل التجارب على الحيوانات بموافقة السلطات المسؤولة في شمال الراين وستفاليا (لانوف-NRW).
1-فحص المجهر الإلكتروني للعقدة الجنينية الماوس
<ol><li>التضحية بالماوس الإناث الحوامل في ~ E7.5 (2-4 المرحلة سميط) بخلع عنق الرحم. شرح مفصل مع الرسومات التخطيطية للخطوات 1.1-1.7 متوفر في الماوس الجنين مختبر الأدلة13.</li>
	<li>فتح البطن من خلال الجلد وميسينتيريس وإزالة الرحم باستخدام مقص وملقط غرامة.</li>
	<li>شطف الرحم بإيجاز في الماء المقطر ووضعه في طبق بتري نظيفة صغيرة (6 سم) يحتوي على 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS).</li>
	<li>تحت مجهر تشريح واستخدام الملقط غرامة، إزالة عضلات الرحم لتحرير ديسيدواي الفردية أو المواقع غرس.</li>
	<li>يعقد كل أوروبية مع زوج واحد من الملقط واستخدام الزوج الأخرى لجعل شق كامل-سمك طولية بين الجزء الأحمر (المستقبل المشيمة) والجزء الأبيض (حيث يقع الجنين). جعل ثقوب سطحية عمودياً على طول الجزء الأبيض من أوروبية متجاورة مع الشق. سحب أوروبية عن بعضها البعض أفقياً إلى نصفين وعناية يستخرج الجنين في الجزء الأبيض من أوروبية.</li>
	<li>نقل الجنين إلى طبق بتري جديدة (35 ملم) مع برنامج تلفزيوني جديد العقيمة التي تمت تصفيتها. كرر لكل ديسيدواي/الأجنة.</li>
	<li>إزالة الغشاء رايشرت ب، غشاء مبهمة نسبيا التي تجتاح الجنين، من كل جنين باغاظة أنه بعيداً مثل جورب بدءاً من مخروط اكتوبلاسينتال (موقع غرس المحمر). للتنميط، تأخذ قطعة صغيرة (~ 0.1 مم2) من كيس ألمح في هذه المرحلة.</li>
	<li>تحت غطاء كيميائية ويرتدي الحماية المناسبة (قفازات)، نقل الأجنة إلى مثبت الرتب EM تتألف من 2.5 ٪ glutaraldehyde في برنامج تلفزيوني العقيمة التي تمت تصفيتها في أنبوب ميكروسينتريفوجي (1.5 مل) في درجة حرارة الغرفة. إصلاح الأجنة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.</li>
	<li>بعناية إزالة مثبت glutaraldehyde من الأنبوب دون لمس الأجنة وتجاهل في حاوية نفايات سليم. تغسل الأجنة ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني العقيمة التي تمت تصفيتها، لمدة كل 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>يذوي الأجنة في سلسلة إيثانول لمدة 5 دقائق: 50%، 70%، 85%، وثلاث مرات في 100% أو الإيثانول المطلقة. تخزين الأجنة في −20 درجة مئوية في الإيثانول أو انتقل مباشرة إلى الخطوة التالية.</li>
	<li>نقل الأجنة في الإيثانول إلى سلال للنقطة الحرجة التجفيف (وثيقة البرنامج القطري) في جهاز مجفف نقطة حرجة. ملء الدائرة مع الإيثانول لتغطية السلال تماما.</li>
	<li>تبادل الإيثانول بالتنظيف بعناية مع سائل CO2 لعشر مرات في 10 درجة مئوية. استنزاف قبالة السائل CO2 بعد الخطوة الأخيرة حتى الدائرة نصف كاملة. حرارة تصل إلى 40 درجة مئوية حتى يصل الضغط إلى أشرطة 80 (النقطة الحرجة) و أول أكسيد الكربون السائل2 يتغير إلى غاز. انتظر لمدة 10 دقائق ثم ضربة ببطء قبالة الغاز على مدى ما يقرب من 45 دقيقة.</li>
	<li>كبديل أسهل لوثيقة البرنامج القطري للتجفيف، إضافة هيكساميثيلديسيلازاني (همدس) بنسبة 1:1 للأجنة في الإيثانول لمدة 30 دقيقة. ثم نقل الأجنة إلى همدس نقية للحد الأدنى 30 إزالة الأجنة من السائل باستخدام ماصة وتركها لتجف لمدة 30 دقيقة. ملاحظة: كلا أساليب التجفيف عملت على قدم المساواة في أيدينا.</li>
	<li>استخدام فرشاة دقيقة لتحميل الأجنة المجففة مع الجانب البطني (عقده) حتى على كعب SEM مع شريط مزدوج الوجهين.</li>
	<li>إدراج بذرة مع الأجنة في آلة الرش طلاء لطلاء الذهب الجسيمات، الذي هو المفضل لشحن أهداب رقيقة طويلة. تطبيق طبقة من 120-150؛ الوقت يتوقف على الحالية، التي تختلف مع كل عينة.</li>
	<li>ضع بذرة مغلفة بالأجنة إلى مجهر SEM وتطبيق فراغ وتلتزم بالعقدة الجنينية والخلايا لوحة نوتوتشوردال بأهداب في تكبير تتراوح بين 1000 X 15، 000 X.</li>
</ol>2-كاملة الفلورة جبل العقدة الماوس ولوحة نوتوتشوردال
<ol><li>استخدام برنامج تلفزيوني المثلج مع 0.05% 20 توين (ببستو)، اتبع الخطوات أعلاه 1.1-1.7 إزالة الأجنة في E7.75 ووضعها في ببستو في 35 مم طبق بيتري على الجليد.</li>
	<li>تحت غطاء كيميائية ويرتدي الحماية المناسبة (قفازات)، نقل الأجنة إلى حل مثبت بارافورمالدهيد 4% في برنامج تلفزيوني في أنبوب ميكروسينتريفوجي. إصلاح الأجنة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.</li>
	<li>بعناية إزالة مثبت بارافورمالدهيد من الأنبوب دون لمس الأجنة وتجاهل في حاوية نفايات سليم. تغسل الأجنة ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.2% Triton X-100 (PBSTr) لمدة كل 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أداء جميع المياه والصرف الصحي وحضانة الخطوات التالية على شاكر نوتاتينج.</li>
	<li>إزالة الغسيل الأخير وإضافة حظر حل الذي يحتوي على PBSTr مع المصل إبطال الحرارة 10% (من الأنواع المضيفة من جسم الثانوي). كتلة من ح 2 إلى بين عشية وضحاها (أو أكثر) في نوتاتور عند 4 درجة مئوية.</li>
	<li>إزالة حجب وإضافة ~ 1 مل جسم الابتدائي المخفف في عرقلة الحل، على سبيل المثال جسم المضادة-تي في تمييع 1: 500. تبني بين عشية وضحاها (أو أكثر) في نوتاتور عند 4 درجة مئوية.</li>
	<li>إزالة الأجسام المضادة الأولية وحفظها من أجل استخدامها لاحقاً بإضافة أزيد الصوديوم بتركيز 0.02% (1 ميليلتر من الأسهم 20 في المائة إلى 1 مل من محلول جسم) نهائي. يمكن إعادة استخدامها في الجسم ~ 10 مرات. شطف الأجنة مرتين مع PBSTr وثم غسلها ثلاث مرات عن 30 دقيقة في نوتاتور عند 4 درجة مئوية.</li>
	<li>يستعاض عن الغسيل بجسم ثانوي مترافق الأسفار، ضد الأنواع المضيفة جسم الأولية، تضعف في ~ 1: 1000 بين عشية وضحاها (أو أكثر) في نوتاتور عند 4 درجة مئوية.</li>
	<li>إزالة الأجسام المضادة الثانوية وشطف مرتين مع PBSTr، ثم يغسل ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة مع PBSTr.</li>
	<li>محل الغسيل الأخير مع PBSTr التي تحتوي على فالويدين مترافق الأسفار 1: 500، وصمة عار واكتين، و 1: 1000 DAPI، وصمة عار النوى، ح 1 في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>شطف مرتين في PBSTr ويغسل مرة واحدة مع PBSTr لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>استبدال PBSTr ببرنامج تلفزيوني وتترك الأجنة في الجليد. إعداد شرائح نظيفة مشحونة إيجابيا (60 x 24 مم) وكوفيرسليبس (24 × 24 مم) والمتصاعدة على أساس والغليسيرول مائي وسائط الإعلام، على سبيل المثال، والغليسيرول 90% في 1xPBS وكاشف أنتيفادي، جبل الأجنة.</li>
	<li>وضع قطعتين من الشريط واضحة على مسافة من ~ 15 ملم من بعضهما البعض في جزء واضح من الشريحة. وهذا خلق مساحة ثلاثية الأبعاد (في البعد Z) تتيح التسوية الأجنة ولكن ليس تماما سكويشينج لهم.</li>
	<li>تحت مجهر تشريح، بعناية نقل الأجنة باستخدام ماصة P200 قطع (مساحة كافية للسماح للجنين إلى نقل ولا أضرار) إلى الشريحة.</li>
	<li>استخدام الملقط غرامة، إجراء تخفيضات كامل اثنين على الجانبين الأفقي من كيس ألمح تطور الجنين. وضع الجنين مع الجانب البطني (العقدة ولوحة نوتوتشوردال) حتى (الظهرية من الأنبوب العصبي لأسفل على الشريحة).</li>
	<li>إضافة 50 ميليلتر من تركيب وسائط على الجنين. ضع 4-5 أجنة كل شريحة. إضافة لمسة من تركيب وسائط إلى جانب ساترة أولاً اللمس الشريحة (الجانب العلوي أو السفلي)، ثم وضعه على المتداخلة قطعتين من الشريط، وخفضه ببطء على الأجنة باستخدام الملقط غرامة أو إبرة الجميلة بنت مع تجنب خلق فقاعات الهواء.</li>
	<li>تنظيف وسائل الإعلام تصاعد الزائدة باستخدام مسح ماصة. كن حذراً لا للانتقال ساترة في العملية.</li>
	<li>استخدام كمية سخية من طلاء الأظافر، ختم على جانبي ساترة دون نقله.</li>
	<li>مراقبة تحت مجهر [كنفوكل] المسح ضوئي.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rivera-P&#233;rez, J. A., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+morphogenesis+in+the+early+mouse+embryo.">The dynamics of morphogenesis in the early mouse embryo.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2015).</li><li>Lee, J. D., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+node+and+notochord:+The+cellular+basis+for+the+establishment+and+maintenance+of+left-right+asymmetry+in+the+mouse.">Morphogenesis of the node and notochord: The cellular basis for the establishment and maintenance of left-right asymmetry in the mouse.</a> Developmental Dynamics. 237 (12), 3464-3476 (2008).</li><li>Balmer, S., Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notochord+morphogenesis+in+mice:+Current+understanding+and+open+questions.">Notochord morphogenesis in mice: Current understanding and open questions.</a> Developmental Dynamics. 245 (5), 547-557 (2016).</li><li>Yoshiba, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilia+at+the+node+of+mouse+embryos+sense+fluid+flow+for+left-right+determination+via+Pkd2.">Cilia at the node of mouse embryos sense fluid flow for left-right determination via Pkd2.</a> Science. , (2012).</li><li>Jurand, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+aspects+of+the+development+of+the+notochord+in+mouse+embryos.">Some aspects of the development of the notochord in mouse embryos.</a> Journal of Embryology and Experimental Morpholog. 32 (1), 1-33 (1974).</li><li>Poelmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+head-process+and+the+formation+of+the+definitive+endoderm+in+the+mouse+embryo.">The head-process and the formation of the definitive endoderm in the mouse embryo.</a> Anatomy and Embryology (Berl). , 41-49 (1981).</li><li>Sulik, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+murine+node+and+notochordal+plate.">Morphogenesis of the murine node and notochordal plate.</a> Developmental Dynamics. 201 (3), 260-278 (1994).</li><li>Bazzi, H., Soroka, E., Alcorn, H. L., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STRIP1,+a+core+component+of+STRIPAK+complexes,+is+essential+for+normal+mesoderm+migration+in+the+mouse+embryo.">STRIP1, a core component of STRIPAK complexes, is essential for normal mesoderm migration in the mouse embryo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (51), 10928-10936 (2017).</li><li>Bazzi, H., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acentriolar+mitosis+activates+a+p53-dependent+apoptosis+pathway+in+the+mouse+embryo.">Acentriolar mitosis activates a p53-dependent apoptosis pathway in the mouse embryo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 1491-1500 (2014).</li><li>Huangfu, D., Liu, A., Rakeman, A. S., Murcia, N. S., Niswander, L., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signalling+in+the+mouse+requires+intraflagellar+transport+proteins.">Hedgehog signalling in the mouse requires intraflagellar transport proteins.</a> Nature. 426 (6962), 83-87 (2003).</li><li>McMullan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy+1928-1965.">Scanning electron microscopy 1928-1965.</a> Scanning. 17 (3), 175-185 (2006).</li><li>Bai, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+set+of+conserved+and+new+regulators+of+cytoskeletal+organization,+cell+morphology+and+migration.">Identification and characterization of a set of conserved and new regulators of cytoskeletal organization, cell morphology and migration.</a> BMC Biology. 9, (2011).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Vintersen Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+the+Mouse+Embryo:+A+Laboratory+Manual,+Fourth+Edition.">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Fourth Edition.</a> Cold Harb Lab Press. , (2014).</li><li>Braet, F., De Zanger, R., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drying+cells+for+SEM,+AFM+and+TEM+by+hexamethyldisilazane:+a+study+on+hepatic+endothelial+cells.">Drying cells for SEM, AFM and TEM by hexamethyldisilazane: a study on hepatic endothelial cells.</a> Journal of Microscopy. 186, 84-87 (1997).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

في هذا العمل، نحن لشرح كيفية أداء أمانة شؤون المرأة، ومف تصور العقدة الجنينية الماوس ولوحة نوتوتشوردال. صغر حجم الأجنة الماوس جاسترولاتينج ~ E7.5 ووجود هذه الهياكل على السطح تجعلها مثالية لدراسة استخدام تقنيات وصف2،،من78. توافر أجسام جيدة، مثل علامات T واهداب، يعطي معلومات ثلاثية الأبعاد ممتازة استخدام ومف على هيكل وتنظيم وتشكيل هذه المنظمين الجنينية الأساسية8.
لأن عائدات التنمية الجنينية الماوس بوتيرة سريعة جداً، وعقده ولوحة نوتوتشوردال موجودة فقط عابر على السطح للجنين، توقيت أمر ضروري لنجاح هذه التجارب2،3. على سبيل المثال، الأجنة سميط 2-4 جيدة لتحليل SEM من حفرة العقدة ناضجة بأهداب طويلة. في الأجنة كثيرا في وقت سابق أو لاحق (على سبيل المثال، ح 12 قبل أو بعد)، قد لا تكون العقدة الحالية على السطح. ومف قليلاً أكثر مرونة في هذا الصدد ولكن الهياكل نفسها أيضا عابرة أثناء التطوير والتوقيت يعتمد في هذه الحالة على المصالح الباحثين.
نقاء الكواشف أمر ضروري لنجاح هذه التقنيات، لا سيما في التدقيق في أولتراستروكتوري بشوائب صغيرة sem. أن تتمسك بالأجنة وعادة ما يسفر عن التحف الضخمة.
لدينا اختبار اثنين من أساليب مختلفة لتثبيت الجنين لوزارة شؤون المرأة واحد باستخدام مثبت نصف كارنوفسكي (2.5 ٪ glutaraldehyde، المخزن كاكوديلاتي بارافورمالدهيد و 0.1 M 2%) وأبسط 2.5 ٪ glutaraldehyde في برنامج تلفزيوني 1 x. نحن نفضل استخدام glutaraldehyde وبرنامج تلفزيوني مثبت كما هو موضح في الخطوة 1، ومع ذلك، نحن وآخرون أيضا استخدمت مثبت في كارنوفسكي نصف بنجاح لوزارة شؤون المرأة.
لدينا أيضا مقارنة طريقتين لتجفيف الأجنة لوزارة شؤون المرأة، والعثور على أي اختلاف في نوعية العينة باستخدام نقطة حرجة مجفف أو همدس كما هو موضح في الخطوة 1 وذكرت في مكان آخر من14.
لخطوة 2، نحن اختبار التضمين الأجنة بعد خطوات الغسيل النهائي في 1% [اغروس] منخفضة ذوبان محمل على طبق أسفل زجاج 35 ملم وثم تحتل المرتبة الأولى مع ~ 10 ميليلتر من تصاعد المتوسطة. يعمل هذا الأسلوب التضمين ويحافظ على هيكل ثلاثي الأبعاد الأصلية للجنين والهياكل المرتبطة بها؛ مع ذلك، مطلوب مجهر مولتيفوتون صورة العينة لأنه لا يمكن التوصل إلى مجهر عادية [كنفوكل] كبالغ إلى أجنة سليمة (~ 1 مم).
ونحن نعتقد أن استخدام هذه التقنيات اثنين يعطي معلومات تكميلية عن بنية العقدة ولوحة نوتوتشوردال خلال التطور الطبيعي وفي المسوخ التي تظهر العيوب في تشكيل هذه الهياكل.

جاستروليشن وحركات morphogenetic المصاحبة حاسمة بالنسبة لتشكيل الجنين الماوس1. التغييرات في الشكل الخلوية والمنظمة خلال morphogenesis إملاء المعلومات الموضعية لتنظيم مصير الخلية وتسمح أيضا مسارات الإشارات التي تلت ذلك بدقة أداء مهامهم لتنويع الطبقات الجرثومية تشكل حديثا1. تشكيل تنظيم هياكل عابرة، ويشير إلى مراكز مثل العقدة و notochord أمر ضروري لتنفيذ برنامج إنمائي2. علماء الأحياء التنموي قد استخدمت مجموعة متنوعة من التقنيات لدراسة morphogenesis لهذه الهياكل، وأبرزها وهو استخدام الصحفيين الخلوية ويعيش السابقين فيفو التصوير لمتابعة الديناميات في السلوك الخلوية وسوبسيلولار2 ،،من34. وفي هذا التقرير، علينا أن نركز على وصف تفاصيل لدينا البروتوكولات الأمثل لاثنين من هذه التقنيات: المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM) وجبل كاملة الفلورة (وميف)، التي كانت ولا تزال مفيدة في دراسة morphogenesis العقدة ولوحة نوتوتشوردال، تمهيدا نوتوتشورد.
العقدة الجنينية الماوس هو كوب على شكل دمعة الخلايا الموجودة على السطح البطني للجنين الماوس حولها وقت مبكر للمراحل المتأخرة من إضعاف رئيس خلال gastrulation و morphogenesis (يوم الجنينية، E7.5 E8)،،من25 6،7. لوحة نوتوتشوردال شكلياً ينبع الأسفل من العقدة3. كل خلية في العقدة ولوحة نوتوتشوردال يتسم هدب واحد أن يبرز إلى الخارج، وهو أطول في خلايا العقدة ولكن طوله يختلف مع مرحلة النمو2. ثبت تناوب أهداب في الحفرة عقده هامة للإشارات التي تحدد عدم التماثل في اليسار واليمين4. لوحة نوتوتشوردال هو مقدمة نوتوتشورد، مما يشير إلى مركز مهم للزخرفة somites المتاخمة و الأنبوب العصبي السطحية3.
وبسبب سمات الموقع (السطح) والشكل (كأس) وتمتلك هياكل متميزة الخلوي الخارجي (أهداب)، استخدمت وزارة شؤون المرأة تقليديا لتصور عقده ولوحة نوتوتشوردال ودراسة عن تكوين وهيكل2، 7-وزارة شؤون المرأة ويستخدم أيضا دراسة التغيرات في هيكل العقدة نفسها أو أهداب على خلاياه في الطفرات التي تؤثر في جاستروليشن، morphogenesis، فضلا عن أهداب تشكيل8،،من910. ووزارة شؤون المرأة هو أسلوب الذي يستخدم تركيز شعاع الإلكترونات باستجواب أولتراستروكتوري الطوبوغرافية للسطح الخارجي لمواد مثل العينات البيولوجية11. العينة هي عادة ثابتة والمجففة وثم الرش المغلفة مع المعادن لمراقبة تحت مجهر الإلكترون المسح كما يصف لنا في الخطوة 1.
ومف أسلوب المصبوغة لتصور منتجات الجينات، مثل البروتينات، في ثلاثة أبعاد (3D). وميف أنسجة أو أجهزة أو الكائنات كلها حتى يوفر المعلومات المكانية حول التوزيع الإشارات وشكل هيكل الناتج في 3D. يستند الأسلوب تحديد العينة ثم تلوين أنه مع يصرف الفلورسنت. ماوس الأجنة ~ E7.5 صغيرة وشفافة وذلك مثالية للبروتوكولات ومف تصور عقده ولوحة نوتوتشوردال. على سبيل المثال، عامل النسخ وأعرب عن بارتشيوري (T) في نواة لعقدة ولوحة نوتوتشوردال، وإلى حد أقل في الانتصارات البدائية، حول E7.5-E8 من التنمية الجنينية وحسن الأجسام المضادة للعامل ضد تي قبل وميف تجارياً المتاحة وإجراء المصبوغة الممكنة. خلايا العقدة ولوحة نوتوتشوردال تتميز أيضا بالأسطح قمي مقيدة، التي تواجه الخارج وهكذا يمكن ملطخة فالويدين fluorescence مترافق لمارك واكتين في التفجرات قمي. باستخدام هذه الكواشف كأمثلة، يوفر الجمع بين T وواو-أكتين تلطيخ ومف تمثيل العقدة ولوحة نوتوتشوردال في 3D في جاسترولاتينج الماوس الأجنة كما نبدي في الخطوة 2 8. ومع ذلك، يمكن استخدامها علامات أهداب، مثل ARL13B أو توبولين أسيتيلاتيد، فضلا عن علامات أخرى لعقدة ولوحة نوتوتشوردال، مثل FOXA2، أيضا أداء ومف على وضع الماوس الأجنة3،4.
وقد أظهرنا أن بروتين سترياتين-التفاعل 1 (STRIP1) ضروري ل gastrulation العادي و morphogenesis في جنين الفأر8. STRIP1 هو عنصر أساسي من التفاعل سترياتين فوسفاتاسيس ومجمعات مؤنزم (ستريباك)، التي تورطت في أكتين cytoskeleton المنظمة8،12نحن وآخرون. عيب رئيسي في الأجنة متحولة Strip1 في تشكيل mesoderm المحوري (العقدة ولوحة نوتوتشوردال)، وامتداد للمحور الخلفي أنتيرو الجسم. أننا استخدمنا ومف ووزارة شؤون المرأة لتحليل العقدة ولوحة نوتوتشوردال في البرية من نوع (WT) والأجنة Strip1 متحولة كما نعرض في نتائج الممثل والأرقام المقابلة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:843px;" width="842">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">1,1,1,3,3,3 Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td style="width:233px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:163px;">3840</td>
			<td style="width:161px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-T antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Critical Point Dryer</td>
			<td>Blazers Union</td>
			<td>CPD 020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4099,0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutardialdehyde solution 25%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1042390250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4974,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SEM coating unit PS3</td>
			<td>Agar Aids for Electron Microscopy</td>
			<td>PS3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SEM microscope Quantum FEG 250</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (FEI)</td>
			<td>Quantum FEG 250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence

الماوس بعد زرع الجنين يخضع لتغيرات رئيسية الشكل بعد بدء جاستروليشن و morphogenesis. تشكيل المنظمون عابر، بعقدة ولوحة نوتوتشوردال، ومن الخلايا التي مرت من خلال الانتصارات البدائية هو السمة مميزة ل morphogenesis. تشكيل هذه المراكز إرسال الإشارات المناسبة أمر ضروري لتطوير خطة الهيئة وتقنيات لتصور لهم ذات أهمية عالية لعلماء الأحياء التنموي الماوس. تكمن العقدة ولوحة نوتوتشوردال على السطح البطني لاجنة الفأر جاسترولاتينج حول يوم الجنينية (ه) 7.5 من التنمية. العقدة هو بنية على شكل كأس الخلايا التي تمتلك مفردة مرهف هدب كل. تعريب سوبسيلولار السليم وتناوب أهداب في الحفرة عقده يحدد عدم التماثل في اليسار واليمين. كما تمتلك الخلايا لوحة نوتوتشوردال أهداب واحد أن كان أقصر من تلك الخلايا العقدة. وتشكل لوحة نوتوتشوردال نوتوتشورد الذي يعمل كمنظم إشارات هامة سوميتوجينيسيس والزخرفة العصبية. نظراً لأن خلايا العقدة ولوحة نوتوتشوردال موجودة عابر على السطح، وتمتلك أهداب، يمكن تصور استخدام المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM). من بين التقنيات الأخرى المستخدمة لتصور هذه الهياكل على المستوى الخلوي هو جبل كاملة الفلورة (ومف) باستخدام الأجسام المضادة ضد البروتينات التي يتم التعبير عنها عاليا في العقدة ولوحة نوتوتشوردال. في هذا التقرير، تصف نحن لدينا البروتوكولات الأمثل لأداء ومف العقدة ولوحة نوتوتشوردال ووزارة شؤون المرأة في وضع الماوس الأجنة للمساعدة في تقييم منظمة الخلوية في البرية من نوع وشكل الأنسجة والأجنة gastrulation المسخ.

من أجل بحث تشكيل العقدة في الأجنة متحولة WT و Strip1 في ~ E7.5، استخدمنا SEM كما هو موضح في الخطوة 1 وهو مبين في الشكل 18. تفاصيل الطبولوجيا خارج استخدام SEM ultrastructural كانت مفيدة جداً، وكان من الواضح فورا أن الأجنة المسخ كان خلافا للعقدة على شكل حفرة في وزن الأجنة، عقده مسطح وغير النظامية. وأظهرت أعلى التكبير من الأجنة أهداب مميزة في خلايا العقدة التي حددت لهم لا لبس فيه. قد يكون الظاهر أقل كثافة من أهداب في المسخ يعزى إلى فقدان الهيكل حفرة العقدة وانحناء أو عددا أقل من خلايا العقدة. لوحة نوتوتشوردال الذي يظهر المنبثقة من العقدة كان أيضا غير النظامية في الأجنة المسخ. وكانت شخصية مع أهداب أقصر. ولذلك، من المهم SEM تكشف عيوب morphogenesis العقدة في طفرات Strip1 8. كما أننا استخدمنا وزارة شؤون المرأة في الدراسات السابقة لإظهار عدم وجود أهداب في العقدة الجنينية طفرات التي تفتقر إلى centrioles، التي تقدم القالب لأهداب9.
دراسة العيوب تشكيل mesoderm المحوري في الأجنة Strip1 المسخ على المستوى الخلوي، استخدمنا ومف كما هو موضح في الخطوة 2 وهو مبين في الشكل 2. باستخدام هذا الأسلوب، بعقدة ولوحة نوتوتشوردال بسهولة حددت واكتين وتلطيخ T. العقدة WT ولوحة نوتوتشوردال الخلايا يكون مقيدة المجالات قمي حيث اثريت واكتين، وتلطيخ تي النووية كان واضحا. لوحة نوتوتشوردال الموسعة روسترالي في الوزن ولكن كانت قصيرة وغير النظامية في المسخ. وأظهرت البيانات أن المنظمة أكتين و غير طبيعي في الطبقات الجرثومية مختلفة من الأجنة متحولة بما في ذلك mesoderm محوري8. وهكذا، ومف كان مفيداً لدراسة العيوب في العقدة وتشكيل لوحة نوتوتشوردال في Strip1 الأجنة المسخ.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58321/58321fig1.jpg"> الشكل 1 . المسح الضوئي المجهر الإلكتروني يكشف العيوب في morphogenesis العقدة في الأجنة الماوس متحولة Strip1 . (أعلى) وزارة شؤون المرأة تحليلات WT و Strip1 متحولة البطني الجنينية العقد ولوحات نوتوتشوردال (نوتو)8. ويرد مثال لصورة تضخم منخفضة جنينا WT على اليسار. (أسفل) تكبير أعلى من مركز العقد سيظهر في أعلى كشف مونوسيليا طويلة إسقاط من خلايا العقدة. أمامي أعلى في كل اللوحات. تغيير حجم أشرطة: 30 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58321/58321fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58321/58321fig2.jpg"> الشكل 2 . جبل كاملة الفلورة ويبين العقدة غير طبيعي ولوحة نوتوتشوردال على المستوى الخلوي في الأجنة متحولة Strip1 . (أعلى) البطني عرض ثلاثي الأبعاد (برنامج فولوسيتي) ومف على الأجنة متحولة WT و Strip1 باستخدام مزيج من فالويدين fluorescence مترافق (F-أكتين، أحمر) وتلطيخ جسم (الأخضر) T. (أسفل) المزيد من الأمثلة لتلطيخ هو مبين أعلاه مع التركيز على العقدة مع تكبير أعلى، بما في ذلك DAPI. أمامي أعلى في كل اللوحات. تغيير حجم أشرطة: 30 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58321/58321fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence at JoVE.com

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

تصور بالعقدة ولوحة نوتوتشوردال في جاسترولاتينج الأجنة الماوس باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني المسح وكله جبل الفلورة

العقدة ولوحة نوتوتشوردال عابرة يشير المنظمون في وضع الماوس الأجنة التي يمكن تصور استخدام العديد من التقنيات. هنا، نحن تصف بالتفصيل كيفية تنفيذ اثنين من التقنيات لدراسة هيكل و morphogenesis: 1) المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM)؛ و 2) جبل كاملة الفلورة (ومف).

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

العقدة و لوحة notochordal هي المنظمين الأساسية أثناء تطوير الجنينية الماوس. اليوم، سوف نصف اثنين من التقنيات المستخدمة من قبل علماء الأحياء التنموية لتصور ودراسة هذه الهياكل. في البروتوكول الأول، سوف نبين كيفية إجراء المسح المجهري الكهربائي، SEM وفي الثانية، كل من المناعة جبل.العقدة وألواح نوتوكودال موجودة بشكل عابر على سطح الجنين في يوم الجنين E7.75 ، يتم إسقاط الأهداب الصغيرة للتأكيد إلى الخارج ، والتي تسمح بتحديدها وتصورها من قبل SEM. وفي كلا البروتوكولين، سنظهر خطوات حاسمة في التعامل مع أجنة الماوس الصغيرة نسبياً ونركز على كيفية نقلها وتوجيهها. للبدء، افتح بطن فأرة حامل القتل الرحيم من خلال الجلد والميناتاريا.باستخدام مقص والملقط غرامة، وإزالة الرحم. شطف الرحم لفترة وجيزة في الماء المقطر ووضعها في طبق بتري صغير يحتوي على PBS. ثم، استخدام المجهر تشريح والملباب غرامة لإزالة عضلات الرحم لتحرير decidui الفردية.تحت المجهر تشريح، عقد كل decidua مع زوج من ملقط واستخدام زوج آخر لجعل طولي، شق سمك كامل بين الجزء الأحمر والجزء الأبيض. جعل الثقوب السطحية عموديا على طول الجزء الأبيض من decidua، المتاخمة مع شق. ثم، سحب decidua بعيدا أفقيا إلى نصفين وإزالة بعناية الجنين من الجزء الأبيض من decidua.بعد ذلك، نقل الأجنة إلى طبق بتري جديد يحتوي على برنامج تلفزيوني مصفى معقمة. إزالة غشاء Reichert من كل جنين، بدءا من مخروط ectoplacental. بالنسبة لgenotyping في المستقبل، وإزالة قطعة صغيرة من كيس صفار.تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية، ونقل الأجنة إلى أنبوب microcentrifuge التي تحتوي على درجة EM fixitive تتألف من 2.5٪ glutaraldehyde وBBS معقم المصفاة. بعد ذلك ، قم بإزالة التثبيت من الأنبوب دون إزعاج الأجنة. اغسل الأجنة ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني معقمة تمت تصفيته لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.يجفف الأجنة في سلسلة الإيثانول لمدة خمس دقائق لكل من هذه الدقائق، وذلك باستخدام 50٪70٪ و 85٪ الإيثانول المخفف في برنامج تلفزيوني. غسل ثلاث مرات في الإيثانول 100٪. تخزين الأجنة في الإيثانول 100٪ في 20 درجة مئوية، أو المضي قدما إلى الخطوة التالية.بعد ذلك، نقل embroyos إلى وعاء مناسب وإزالة أي السائل المتبقية. إضافة HMDS والإيثانول بنسبة واحد إلى واحد إلى الأجنة لمدة 30 دقيقة. ثم، إزالة السائل وإضافة HMDS نقية لمدة 30 دقيقة.إزالة السائل من الأجنة مع ماصة والسماح لهم لتجف لمدة 30 دقيقة. استخدام فرشاة صغيرة وشريط من جانبين مزدوج لتركيب الأجنة المجففة على كعب SEM، مع الجانبين البطني. أدخل كعب في آلة طلاء البصق لطلاء الجسيمات الذهبية.واحدة من الخطوات الأكثر حساسية في الجسيمات SEM هو تركيب الأجنة في الاتجاه الصحيح على كعب. بمجرد أن يهبط الجنين على الشريط، لا يمكن تغيير الاتجاه بعد الآن. بعد ذلك، ضع كعب المعاطف المغلفة في مجهر SEM، وتطبيق فراغ، ومراقبة العقد الجنينية وخلايا الصفائح غير الحمراء مع أهداب.بعد إزالة الأجنة في E7.75، ووضعها في برنامج تلفزيوني توين في طبق بتري على الجليد. تحت غطاء محرك السيارة الكيميائي، نقل الأجنة إلى أنبوب microcentrifuge التي تحتوي على حل التثبيت. بعد ذلك ، قم بإزالة المثبت من الأنبوب ، مع الحرص على عدم لمس الأجنة.ثم، غسل الأجنة ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.2٪ تريتون X-100 لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة على شاكر nutating. إزالة آخر غسل من الأجنة وإضافة محلول حجب يحتوي على برنامج تلفزيوني تريتون، مع 10٪ من حرارة المصل المعطل. منع الأجنة لمدة ساعتين على الأقل على nutator في أربع درجات مئوية.بعد ذلك، قم بإزالة الحجب وإضافة ما يقرب من ملليلتر واحد من الأجسام المضادة الأولية المخففة في حل الحظر. احتضان الأجنة بين عشية وضحاها على nutator في أربع درجات مئوية. قم بإزالة الجسم المضاد الأساسي واحفظه للاستخدام في وقت لاحق.ثم، شطف الأجنة مع برنامج تلفزيوني تريتون مرتين. واغسلها ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة على المُجنّة. استبدال غسل مع الجسم المضاد الاقتران فلوريسكين المخفف الثانوي ضد الأنواع المضيفة المضادة الأولية.واحتضان بين عشية وضحاها على nutator في أربع درجات مئوية. ثم، إزالة الأجسام المضادة الثانوية وشطف الأجنة مع برنامج تلفزيوني تريتون مرتين. قبل الغسيل ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة مع برنامج تلفزيوني تريتون.استبدال آخر غسل مع برنامج تلفزيوني تريتون التي تحتوي على phalloidin مخففة فلوريسكنس مخففة وDAPI المخفف وصمة عار لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم، شطف الأجنة مرتين في برنامج تلفزيوني تريتون. واغسلها بـ"بي بي إس تريتون" لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفةبعد هذا، استبدال برنامج تلفزيوني تريتون مع برنامج تلفزيوني وترك الأجنة على الجليد. ثم إعداد الشرائح نظيفة، مشحونة بشكل إيجابي، وزلات الغطاء وجليسرول المائية القائمة على تصاعد وسائل الإعلام. ضع قطعتين من شريط واضح 15 ملليمترا وبصرف النظر عن بعضها البعض على الشريحة.ثم، تحت المجهر تشريح، واستخدام ماصة P200 المعدلة لنقل الجنين إلى الشريحة. باستخدام ملقط غرامة، وجعل اثنين من التخفيضات الكاملة على الجانبين الجانبي من كيس صفار لتتكشف الجنين. ثم ضع الجنين مع الجانب البطني.إضافة 50 ميكرولترات من تصاعد وسائل الإعلام إلى الجنين. ثم، إضافة داب من تصاعد وسائل الإعلام إلى زلة الغطاء. وضعه تمتد على قطعة اثنين من الشريط، وخفض ببطء على الأجنة باستخدام إبرة عازمة.استخدم مسح ماصة لإزالة وسائط التركيب الزائدة، مع الحرص على عدم تحريك زلة الغطاء. ثم، استخدام كمية سخية من طلاء الأظافر لختم الجانبين من زلة الغطاء. وأخيراً، استخدم مجهرًا مُلَحٍ لمراقبة الأجنة.من المهم عدم تحريك زلة الغطاء بعد تركيبها على الأجنة ، لأنها يمكن أن تشوهها للتصور ثلاثي الأبعاد. وباستخدام المجهر الإلكتروني المسحي، لوحظ تكوين العقدة في النوع البري وتجريد أجنة ماوس متحولة في E7.75. على عكس العقدة على شكل حفرة في النوع البري ، عرضت الأجنة المتحولة عقدة مسطّحة وطبقة العقدة المنتظمة.كل الآن إلى immunofluorescence كان يستخدم لدراسة العقدة و نوتوشورديال عيوب تكوين الصفائح في قطاع 1 الأجنة المتحولة على المستوى الخلوي. وأظهرت البيانات أنها كانت غير طبيعية ومتوقفة في الأجنة المتحولة. العقدة والصحن العقدي هي فقط عابرة موجودة على سطح الجنين، وبالتالي توقيت ضروري لنجاح SEM.على سبيل المثال، اثنين إلى أربعة أجنة somite جيدة لتحليل SEM عقدة ناضجة مع أهداب طويلة. الكواشف النقاء ضروري أيضا لنجاح هذه التقنيات، وخاصة في التحقيق في البنية الفائقة من قبل SEM. الشوائب الصغيرة التي تلتصق الجنين عادة ما يؤدي إلى التحف الضخمة.ونحن نعتقد أن هذين التقنيات تعطي معلومات تكميلية عن هيكل العقدة والصحن العقدي خلال التطور الطبيعي وفي المسوخ التي تظهر عيوب في تشكيل هذه الهياكل.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

التباين التصوير في أجنة الفئران عن طريق الموجات فوق الصوتية عالية التردد

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy Nanotomy of Healthy and Injured Zebrafish Brain

على نطاق واسع الضوئي نقل المجهر (Nanotomy) من صحي والمصاب الزرد الدماغ

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution electron microscopy. Others and we previously ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

متعددة الهدف اللونية الجامع جبل<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين لمقارنة الجينات مجالات التعبير في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

طرق لفحص الليمفاوية الغدة وHemocytes في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; يرقات

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

هيئة الثقافة والجامع جبل المناعي تلون ماوس وولف القنوات

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

تصور الخلايا مولتيسيلياتيد في الزرد من خلال بروتوكول مجتمعة في الموقع كله جبل فلوري التهجين والفلوره

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

تحليل كمي الجامع-جبل الفلورة السكان السلف القلب في الأجنة الماوس

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

تصوير هرمي متعدد الوسائط من مقاطع المسلسل للعثور على أهداف محددة الخلوية داخل كميات كبيرة

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

كله جبل الفلورة وتقدير جريب المبايض الماوس مثقف

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

تحليل لتطوير دائرة القلب أثناء Embryogenesis الماوس باستخدام كامل جبل ابيفلوريسسينسي

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...