Name: visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence
Uploaded: 2018-11-06T13:30:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence at JoVE.com

H.B. understøttes af startup finansiering fra det medicinske fakultet og SFB829 af universitetet i Köln. C.X. understøttes af DFG give BA 5810/1-1. Vi vil gerne takke de Imaging faciliteter på CECAD research center og Memorial Sloan Kettering Cancer Center (New York, USA). Vi takker Joaquín Minik-Bessa (spansk National Center for hjerte-kar-forskning, Madrid, Spanien) for hans indsigt på montering af embryoner til WMIF.

Alle eksperimenter, der involverer dyreforsøg blev godkendt af de ansvarlige myndigheder i Rhein Westfalen (LANUV-NRW).
1. scanning Elektron Mikroskopi af noden mus embryonale
<ol><li>Ofre den gravide kvinde musen på ~ E7.5 (2-4 somite fase) af cervikal dislokation. En detaljeret forklaring med diagrammer af trin 1.1 - 1.7 er tilgængelig i mus embryo laboratorium manualer13.</li>
	<li>Åbne abdomen gennem huden og mesenteries og fjerne livmoderen ved hjælp af saks og fine pincet.</li>
	<li>Skyl livmoderen kort i destilleret vand og Placer det i et lille rent petriskål (6 cm) indeholdende 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS).</li>
	<li>Under en dissekere mikroskop og ved hjælp af fine pincet, fjerne uterin musklerne for at frigøre de individuelle deciduae eller implantation websteder.</li>
	<li>Hold hver decidua med et par pincet og bruge de andre par til at lave en langsgående fuld-tykkelse snit mellem den røde del (fremtidige moderkagen) og hvide del (hvor embryo er placeret). Gøre overfladiske perforeringer lodret langs den hvide del af decidua sammenhængende med indsnit. Trække decidua apart vandret i to halvdele og omhyggeligt øse ud embryo i den hvide del af decidua.</li>
	<li>Overføre embryonet til en ny petriskål (35 mm) med frisk steril-filtreret PBS. Gentag for alle deciduae/embryoner.</li>
	<li>Fjerne Reicherts membran, en relativt uigennemsigtig membran oversvømmer embryo, fra hvert foster af drilleri det som væk en sok, startende fra ectoplacental kegle (rødlig implantation websted). For genotypebestemmelse, tage et lille stykke (~ 0.1 mm2) af blommesækken på dette stadium.</li>
	<li>Under en kemisk hætte og iført passende beskyttelse (handsker), overførsel af embryoner til EM grade fiksativ sammensat af 2,5% glutaraldehyd i steril-filtreret PBS i et microcentrifuge (1,5 mL) rør ved stuetemperatur. Fix embryonerne natten over ved 4 ° C.</li>
	<li>Forsigtigt fjerne glutaraldehyd fiksativ fra røret uden at røre embryonerne og kassér i en ordentlig spildbakken. Vask embryonerne tre gange i steril-filtreret PBS for 15 min ved stuetemperatur.</li>
	<li>Dehydrere embryoner i en ethanol serie i 5 min: 50%, 70%, 85% og tre gange i 100% eller absolut ethanol. Opbevare embryoner på −20 ° C i ethanol eller gå direkte til næste trin.</li>
	<li>Overførsel af embryoner i ethanol til kurve for kritiske punkt tørring (CPD) i et kritisk punkt tørretumbler maskinen. Fyld salen med ethanol til at dække kurvene helt.</li>
	<li>Udveksle ethanol ved omhyggeligt gennemskylning med flydende CO2 til 10 gange på 10 ° C. Afløb fra flydende CO2 efter det sidste trin indtil salen er halvt fyldt. Varme op til 40 ° C, indtil trykket når 80 barer (det kritiske punkt) og den flydende CO2 ændres til gas. Vente 10 min og derefter langsomt blæse gas over ca 45 min.</li>
	<li>Som en lettere alternativ til CPD til tørring, skal du tilføje hexamethyldisilazane (HMDS) i forholdet 1:1 til embryoner i ethanol i 30 min. Derefter overføre embryoner til ren HMDS i 30 min. Fjern embryoner fra væsken ved hjælp af en pipette og lade dem tørre i 30 min. Bemærk: Begge tørring metoder arbejdede lige så godt i vores hænder.</li>
	<li>Brug en fin pensel til at montere de tørrede embryoner med den ventrale side (knude) op på en SEM stub med dobbeltklæbende tape.</li>
	<li>Indsæt stubbe med embryoner i en sputter belægning maskine til guld partikel belægning, der er foretrukket til at opkræve de lange tynde cilia. Påfør et lag af 120-150 Å; tiden er afhængig af den aktuelle, som varierer med hver prøve.</li>
	<li>Placere de coatede stubbe med embryoner i en SEM mikroskopet, anvende vakuum og observere de embryonale node og notochordal plade celler med cilier i forstørrelser spænder fra 1000 X 15, 000 X.</li>
</ol>2. hele Mount immunfluorescens af musen Node og Notochordal plade
<ol><li>Ved hjælp af iskold PBS med 0,05% Følg Tween 20 (PBSTw), trin 1.1-1.7 ovenfor at fjerne embryoner på E7.75 og placere dem i PBSTw i en 35 mm petriskål på is.</li>
	<li>Under en kemisk hætte og iført passende beskyttelse (handsker), overførsel af embryoner til en Fikseringsvæske løsning af 4% PARAFORMALDEHYD i PBS i et microcentrifuge rør. Fix embryonerne natten over ved 4 ° C.</li>
	<li>Forsigtigt fjerne PARAFORMALDEHYD fiksativ fra røret uden at røre embryonerne og kassér i en ordentlig spildbakken. Vask af embryoner tre gange i PBS, som indeholder 0,2% Triton X-100 (PBSTr) i 5 min ved stuetemperatur. Udføre alle vask og næste inkubation trin på en nutating shaker.</li>
	<li>Fjerne den sidste vask og tilføje blokerende løsning indeholdende PBSTr med 10% varme-inaktiverede serum (fra værten arter af den sekundære antistof). Blok fra 2 h til natten (eller længere) på en nutator ved 4 ° C.</li>
	<li>Fjern blokering og tilføje ~ 1 mL af den primære antistof fortyndet i blokerende løsning, for eksempel en anti-T antistof i 1: 500 fortynding. Der inkuberes natten over (eller længere) på en nutator ved 4 ° C.</li>
	<li>Fjerne den primære antistof og gemme den til senere brug ved at tilføje natriumazid til en endelig koncentration på 0,02% (1 µL af 20% materiel til 1 mL af antistof løsning). Antistoffet kan genbruges ~ 10 gange. Skyl embryoner to gange med PBSTr og derefter vaske dem tre gange i 30 min. på en nutator ved 4 ° C.</li>
	<li>Erstatte vask med et fluorescens-konjugeret sekundær antistof, mod de primære antistof vært arter, fortyndet på ~ 1:1000 overnight (eller længere) på en nutator ved 4 ° C.</li>
	<li>Fjerne den sekundær antistof og skylles to gange med PBSTr og derefter vaskes tre gange i 30 min med PBSTr.</li>
	<li>Erstatte den sidste vask med PBSTr indeholdende 1: 500 fluorescens-konjugeret phalloidin, at plette F-Actin, og 1:1000 DAPI, for at plette kerner, i 1 time ved stuetemperatur.</li>
	<li>Skylles to gange i PBSTr og vaske en gang med PBSTr i 30 min. ved stuetemperatur.</li>
	<li>Erstat PBSTr med PBS og forlade embryoner på is. Forberede ren positivt ladede dias (60 x 24 mm) og coverslips (24 x 24 mm) og vandig glycerol-baserede montering medier, eksempelvis 90% glycerol i 1xPBS og en antifade reagens, at montere embryonerne.</li>
	<li>Læg to stykker klar tape i en afstand af ~ 15 mm fra hinanden på den klare del af diaset. Dette vil skabe nok 3D rum (i dimensionen Z), der ville tillade udfladning af embryoner, men ikke helt squishing dem.</li>
	<li>Under et dissekere mikroskop, flytte omhyggeligt embryoner ved hjælp af en cut P200 pipette (for at tillade plads nok for embryoet at være overført og ikke er beskadiget) til diaset.</li>
	<li>Brug fine pincet, lave to fulde nedskæringer på de laterale sider af blommesækken at udfolde embryonet. Placer embryo med ventrale side (node og notochordal plade) op (dorsale af neuralrøret ned på diaset).</li>
	<li>Tilsæt 50 µL af montering medier på fosteret. Læg 4-5 embryoner pr dias. Tilføje en dab af montering medier til side af coverslip, der vil først røre dias (øverst eller nederst side), derefter placere den skrævende de to stykker tape og sænk det langsomt ind på embryoner ved hjælp af fine pincet eller en bøjet fin nål samtidig undgå at skabe luftbobler.</li>
	<li>Ren de overskydende montering medier ved hjælp af en absorberende serviet. Vær omhyggelig med ikke at flytte coverslip i processen.</li>
	<li>Ved hjælp af en generøs mængde af neglelak, forsegle sider af coverslip uden at flytte den.</li>
	<li>Observere under en scanning Konfokal mikroskop.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rivera-P&#233;rez, J. A., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+morphogenesis+in+the+early+mouse+embryo.">The dynamics of morphogenesis in the early mouse embryo.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2015).</li><li>Lee, J. D., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+node+and+notochord:+The+cellular+basis+for+the+establishment+and+maintenance+of+left-right+asymmetry+in+the+mouse.">Morphogenesis of the node and notochord: The cellular basis for the establishment and maintenance of left-right asymmetry in the mouse.</a> Developmental Dynamics. 237 (12), 3464-3476 (2008).</li><li>Balmer, S., Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notochord+morphogenesis+in+mice:+Current+understanding+and+open+questions.">Notochord morphogenesis in mice: Current understanding and open questions.</a> Developmental Dynamics. 245 (5), 547-557 (2016).</li><li>Yoshiba, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilia+at+the+node+of+mouse+embryos+sense+fluid+flow+for+left-right+determination+via+Pkd2.">Cilia at the node of mouse embryos sense fluid flow for left-right determination via Pkd2.</a> Science. , (2012).</li><li>Jurand, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+aspects+of+the+development+of+the+notochord+in+mouse+embryos.">Some aspects of the development of the notochord in mouse embryos.</a> Journal of Embryology and Experimental Morpholog. 32 (1), 1-33 (1974).</li><li>Poelmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+head-process+and+the+formation+of+the+definitive+endoderm+in+the+mouse+embryo.">The head-process and the formation of the definitive endoderm in the mouse embryo.</a> Anatomy and Embryology (Berl). , 41-49 (1981).</li><li>Sulik, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+murine+node+and+notochordal+plate.">Morphogenesis of the murine node and notochordal plate.</a> Developmental Dynamics. 201 (3), 260-278 (1994).</li><li>Bazzi, H., Soroka, E., Alcorn, H. L., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STRIP1,+a+core+component+of+STRIPAK+complexes,+is+essential+for+normal+mesoderm+migration+in+the+mouse+embryo.">STRIP1, a core component of STRIPAK complexes, is essential for normal mesoderm migration in the mouse embryo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (51), 10928-10936 (2017).</li><li>Bazzi, H., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acentriolar+mitosis+activates+a+p53-dependent+apoptosis+pathway+in+the+mouse+embryo.">Acentriolar mitosis activates a p53-dependent apoptosis pathway in the mouse embryo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 1491-1500 (2014).</li><li>Huangfu, D., Liu, A., Rakeman, A. S., Murcia, N. S., Niswander, L., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signalling+in+the+mouse+requires+intraflagellar+transport+proteins.">Hedgehog signalling in the mouse requires intraflagellar transport proteins.</a> Nature. 426 (6962), 83-87 (2003).</li><li>McMullan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy+1928-1965.">Scanning electron microscopy 1928-1965.</a> Scanning. 17 (3), 175-185 (2006).</li><li>Bai, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+set+of+conserved+and+new+regulators+of+cytoskeletal+organization,+cell+morphology+and+migration.">Identification and characterization of a set of conserved and new regulators of cytoskeletal organization, cell morphology and migration.</a> BMC Biology. 9, (2011).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Vintersen Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+the+Mouse+Embryo:+A+Laboratory+Manual,+Fourth+Edition.">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Fourth Edition.</a> Cold Harb Lab Press. , (2014).</li><li>Braet, F., De Zanger, R., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drying+cells+for+SEM,+AFM+and+TEM+by+hexamethyldisilazane:+a+study+on+hepatic+endothelial+cells.">Drying cells for SEM, AFM and TEM by hexamethyldisilazane: a study on hepatic endothelial cells.</a> Journal of Microscopy. 186, 84-87 (1997).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

I dette arbejde vise vi, hvordan man udfører SEM og WMIF for at visualisere mus embryonale node og notochordal plade. Den lille størrelse af gastrulating musen embryoner ~ E7.5 og tilstedeværelsen af disse strukturer på overfladen gør dem ideelle til at studere ved hjælp af teknikker beskrevet2,7,8. Tilgængeligheden af gode antistoffer, som T og cilia markører, giver fremragende 3D-oplysninger ved hjælp af WMIF på struktur, organisation og dannelsen af disse væsentlige embryonale arrangørerne8.
Fordi musen embryonale udvikling skrider frem i et meget hurtigt tempo og node og notochordal plade er kun forbigående til stede på overfladen af embryonet, er timing afgørende for succes af disse eksperimenter2,3. For eksempel, er 2-4 somite embryoner god til SEM analyse af en ældre node pit med lange cilia. I meget tidligere eller senere embryoner (for eksempel 12 timer før eller efter), kan noden ikke være til stede på overfladen. WMIF er lidt mere fleksibel i denne henseende, men strukturerne, der selv er også forbigående under udvikling og timingen, i dette tilfælde afhænger af forskernes interesser.
Renheden af reagenserne er også afgørende for en vellykket gennemførelse af disse teknikker, især i sondering af ultrastruktur af SEM. Tiny urenheder, der klæber til embryonerne normalt resultere i enorme artefakter.
Vi har testet to forskellige metoder til embryo fiksering til SEM et med halv Karnovsky fiksativ (2,5% glutaraldehyd, 2% PARAFORMALDEHYD og 0,1 M cacodylate buffer) og en enklere 2,5% glutaraldehyd i 1 x PBS. Vi foretrækker at bruge glutaraldehyd og PBS fiksativ som beskrevet i trin 1, men vi og andre har også brugt det halve Karnovsky fiksativ med succes for SEM.
Vi har også sammenlignet to metoder til tørring af embryoner til SEM og fandt ingen forskel i kvaliteten af prøven ved hjælp af enten et kritisk punkt tørretumbler eller HMDS som beskrevet i trin 1 og rapporteret et andet sted14.
For trin 2, vi har testet indlejring af embryoner efter sidste vask trin i 1% lavt smeltepunkt Agarosen monteret på en 35 mm glas-bund fad og derefter topping det med ~ 10 µL af montering medium. Denne indlejring metode virker og bevarer den oprindelige 3D-struktur af fosteret og tilhørende strukturer; dog et multiphoton mikroskop er forpligtet til at billede modellen, fordi en regelmæssig Konfokal mikroskop ikke kan nå så dybt ind i de intakte embryoner (~ 1 mm).
Vi mener, at ved hjælp af disse to teknikker giver supplerende oplysninger om strukturen af noden og den notochordal plade under normale udvikling og i mutanter, der viser fejl i dannelsen af disse strukturer.

Gastrulation og de ledsagende morfogenetiske bevægelser er afgørende for udformningen af musen embryo1. Ændringer i cellulære form og organisation under morfogenese diktere positionelle oplysninger for at regulere celle skæbne og også tillade de efterfølgende signaling veje til netop udføre deres funktioner for at diversificere den nydannede Kim lag1. Dannelsen af forbigående organisere strukturer og signalering Centre såsom node og notochord er afgørende for gennemførelsen af de udviklingsmæssige program2. Udviklingsmæssige biologer har brugt en bred vifte af teknikker til at studere morfogenese af disse strukturer, mest bemærkelsesværdige er brugen af cellulære journalister og levende ex vivo billeddannelse til at følge dynamikken i cellulært og subcellulært adfærd2 ,3,4. I denne betænkning, vi fokuserer på at beskrive detaljerne i vores optimerede protokoller for to af disse teknikker: scanning elektronmikroskopi (SEM) og hele mount immunofluorescens (WMIF), som var og er stadig medvirkende til at studere morfogenese af noden og den notochordal plade, forløberen for notochord.
Musen embryonale node er en teardrop-formet kop af celler, der er placeret på musen embryo omkring den tidlige ventrale overflade til sene hoved fold stadier under gastrulation og morfogenese (embryonale dag, E7.5-E8)2,5, 6,7. Notochordal pladen udstråler morfologisk anteriorly fra knude3. Hver celle i node og notochordal plade er kendetegnet ved en enkelt cilium, der stikker ud på ydersiden, som er længere i node celler men hvis længde varierer med udviklingsstadiet2. Rotation af cilier i node pit har vist sig at være vigtigt for signalering, der bestemmer højre-asymmetri4. Den notochordal plade er en forløber for notochord, signalering centrum, der er vigtige for mønstre af de tilstødende somites og den overliggende neuralrøret3.
På grund af attributterne af placering (overflade), form (kop) og besidder forskellige ydre cellulære strukturer (cilier), har SEM traditionelt været brugt til at visualisere node og notochordal plade og studere deres dannelse og struktur2, 7. SEM bruges ligeledes til at studere ændringer i strukturen af noden, der selv eller cilier på dens celler i mutationer, der påvirker gastrulation, morfogenese, samt cilia dannelse8,9,10. SEM er en teknik, der udnytter en fokuseret stråle af elektroner til at afhøre de topologiske ultrastruktur af den ydre overflade af materialer såsom biologiske prøver11. Prøven er normalt fast, tørret og derefter sputter overtrukket med metaller til observation under en scanning elektron mikroskop som vi beskriver i trin 1.
WMIF er en farvnings-teknik til at visualisere genprodukter, såsom proteiner, i tre-dimensioner (3D). WMIF af væv, organer eller endda hele organismer giver geografisk information om fordelingen af signalet og formen af den deraf følgende struktur i 3D. Teknikken er baseret på fastsættelse af prøven derefter farvning med fluorescerende konjugater. Mus embryoner ~ E7.5 er små og gennemskuelig og derfor ideel til WMIF protokoller til at visualisere node og notochordal plade. For eksempel, transskription faktor Barchyury (T) er udtrykt i kerner af node og notochordal plade, og i mindre grad i primitivstriberne omkring E7.5-E8 af embryonale udvikling og god orden antistoffer mod T af WMIF er kommercielt rådighed og muliggøre den farvning procedure. Cellerne i node og notochordal plade er også karakteriseret ved sammensnøret apikale overflader, som står udenfor og dermed kan være farvet med fluorescens-konjugeret Phalloidin til mark F-Actin på de apikale forsnævringer. Brug af disse reagenser som eksempler, indeholder kombinationen af T og F-Actin farvning af WMIF en repræsentation af node og notochordal plade i 3D i gastrulating mus embryoner, som vi viser i trin 2 8. Markører for cilia, som ARL13B eller acetyleret tubulin, samt andre markører af node og notochordal plade, såsom FOXA2, kan dog også bruges til at udføre WMIF på udvikle mus embryoner3,4.
Vi har vist, at striatin-interagere protein 1 (STRIP1) er nødvendig for normal gastrulation og morfogenese i mus embryo8. STRIP1 er et centralt element i striatin-interagere fosfataser og kinaser komplekser (STRIPAK), som vi og andre har impliceret i actin cytoskeleton organisation8,12. En større defekt i Strip1 mutant embryoner er i dannelsen af aksial mesoderm (node og notochordal plade) og udvidelse af antero-posterior krop akse. Vi har brugt SEM og WMIF til at analysere node og notochordal plade i wild-type (WT) og Strip1 mutant embryoner, som vi viser i de Repræsentative resultater og tilsvarende tal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:843px;" width="842">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">1,1,1,3,3,3 Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td style="width:233px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:163px;">3840</td>
			<td style="width:161px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-T antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Critical Point Dryer</td>
			<td>Blazers Union</td>
			<td>CPD 020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4099,0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutardialdehyde solution 25%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1042390250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4974,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SEM coating unit PS3</td>
			<td>Agar Aids for Electron Microscopy</td>
			<td>PS3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SEM microscope Quantum FEG 250</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (FEI)</td>
			<td>Quantum FEG 250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence

Efter implantation mus embryo undergår store figur ændringer efter indledningen af gastrulation og morfogenese. Kendetegnende for morfogenese er dannelsen af forbigående arrangørerne, node og notochordal plade, fra celler, der har passeret gennem primitivstriberne. Ordentlig dannelsen af disse signaling Centre er afgørende for udviklingen af organ planen og teknikker til at visualisere dem er af stor interesse at musen udviklingsmæssige biologer. Node og notochordal pladen ligge på den ventrale overflade af gastrulating musen embryoner omkring embryonale dag (E) 7,5 udvikling. Noden er en kop-formet struktur, hvis celler besidder en enkelt slank cilium hver. Ordentlig subcellulært lokalisering og rotation af cilia i node pit bestemmer højre-asymmetri. Notochordal plade celler besidder også enkelt cilia, omend kortere end node celler. Notochordal pladen danner de notochord, der fungerer som en vigtig signalfunktion arrangør for somitogenesis og neurale mønstre. Fordi cellerne i node og notochordal plade er forbigående stede på overfladen og besidde cilia, kan de visualiseres ved hjælp af scanning elektronmikroskopi (SEM). Blandt andre teknikker, der anvendes til at visualisere disse strukturer på cellulært niveau er hele mount immunofluorescens (WMIF) ved hjælp af antistoffer mod de proteiner, der er stærkt udtrykt i node og notochordal plade. I denne rapport beskriver vi vores optimerede protokoller for at udføre SEM og WMIF af node og notochordal plade i udviklingslandene mus embryoner til hjælp i vurderingen af væv form og cellulære organisation i wild-type og gastrulation mutant embryoner.

For at undersøge dannelsen af noden i WT og Strip1 mutant embryoner på ~ E7.5, vi brugte SEM som beskrevet i trin 1 og er vist i figur 18. Ultrastrukturelle detaljerne i uden for topologien ved hjælp af SEM var ganske informativ og det blev straks klart, at i modsætning til noden pit-formet i WT embryoner mutant embryonerne havde en flad og uregelmæssige node. Højere forstørrelse af embryonerne viste de karakteristiske cilier på node celler, der utvetydigt har identificeret dem. Den tilsyneladende lavere massefylde af cilia i muterede kan henføres til tabet af node pit struktur og krumning eller et lavere antal node celler. Den notochordal plade, som vises emanating fra noden blev også uregelmæssig i mutant embryoner. De kunne identificeres med deres kortere cilia. SEM var derfor vigtigt at afsløre node morfogenese defekter i Strip1 mutanter8. Vi har også brugt SEM i tidligere undersøgelser for at vise mangel af cilier i den embryonale node af mutanter, der manglede centrioler, som giver skabelonen for cilia9.
For at studere aksial mesoderm dannelse defekter i Strip1 mutant embryoner på cellulært niveau, brugte vi WMIF som beskrevet i trin 2 og er vist i figur 2. Brug af denne teknik var node og notochordal plade let identificeres ved F-Actin og T farvning. WT node og notochordal plade celler har trange apikale domæner hvor F-Actin blev beriget, og nukleare T farvning var tydeligt. Den notochordal plade udvidet rostrally i WT men var korte og uregelmæssige i mutanten. Data viste, at F-Actin organisation er unormal i de forskellige Kim lag af mutant embryonerne herunder aksial mesoderm8. Således var WMIF medvirkende til at studere defekter i node og notochordal plade dannelse i Strip1 mutant embryoner.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58321/58321fig1.jpg"> Figur 1 . Scanning Elektron Mikroskopi afslører mangler i node morfogenese i Strip1 mutant musen embryoner. (Top) SEM analyserne af WT og Strip1 mutant ventrale embryonale noder og notochordal plader (Noto)8. Et eksempel på en lav forstørrelse billede af en WT embryo er vist til venstre. (Nederst) Højere forstørrelser i midten af de noder, der er vist ovenpå afslører den lange monocilia fremspringende fra node celler. Anterior er op i alle paneler. Skalere barer: 30 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58321/58321fig1large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58321/58321fig2.jpg"> Figur 2 . Hele mount immunofluorescens viser unormal node og notochordal plade på cellulært niveau i Strip1 mutant embryoner. (Top) Ventrale 3D rendering (Volocity software) af WMIF på WT og Strip1 mutant embryoner ved hjælp af en kombination af fluorescens-konjugeret phalloidin (F-Actin, red) og Thomsen (grøn) antistoffarvning. (Nederst) Flere eksempler på farvning vist ovenfor med fokus på noden med højere zoom og herunder DAPI. Anterior er op i alle paneler. Skalere barer: 30 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58321/58321fig2large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence at JoVE.com

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal plade i Gastrulating mus embryoner ved hjælp af Scanning elektronmikroskopi og hele Mount immunfluorescens

Node og notochordal plade er forbigående signalering arrangører udvikle mus embryoner, der kan visualiseres ved hjælp af flere teknikker. Her, vi beskriver i detaljer, hvordan du udfører to af teknikker til at studere deres struktur og morfogenese: 1) scanning elektronmikroskopi (SEM); og 2) hele mount immunofluorescens (WMIF).

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Noden og notochordal plade er væsentlige arrangører under mus embryonale udvikling. I dag vil vi beskrive to teknikker, der anvendes af udviklingsbiologer til at visualisere og studere disse strukturer. I den første protokol vil vi demonstrere, hvordan man udfører scanning elektromikroskopi, SEM og i den anden, hele mount immunofluorescens.Noden og notochordalpladen er forbigående til stede på overfladen af embryonet på embryonale dag E7.75, vægt lille cilier projicerer til ydersiden, som gør det muligt for dem at identificere og visualisere af SEM. I begge protokoller vil vi demonstrere kritiske skridt i håndteringen af de relativt små museembryoner og fokusere på, hvordan de kan overføres og dirigeres. Til at begynde, åbne maven af en aflivet gravid mus gennem huden og mesenterierne.Brug saks og fine kraftæceser, fjerne livmoderen. Skyl livmoderen kortvarigt i destilleret vand og læg den i en lille petriskål indeholdende PBS. Derefter, bruge en dissekere mikroskop og fine kraftpind til at fjerne livmodermusklerne til at befri den enkelte decidui.Under dissekere mikroskop, holde hver decidua med et par kraftaffængt og bruge et andet par til at gøre en langsgående, fuld tykkelse snit mellem den røde del og den hvide del. Lav overfladiske perforeringer lodret langs den hvide del af decidua, sammenhængende med snittet. Træk derefter decidua fra hinanden vandret i to halvdele og fjern forsigtigt fosteret fra den hvide del af decidua.Herefter overføres embryonerne til en ny petriskål, der indeholder sterilt filtreret PBS. Fjern Reicherts membran fra hvert foster, begyndende ved den ectoplacental kegle. For fremtidige genotyping, fjerne et lille stykke af blomme sæk.Under en kemisk emhætte overføres embryonerne til et mikrocentrifugerør, der indeholder fiktiv EM-kvalitet bestående af 2,5 % glutaraldehyd og sterilt filtreret PBS. Derefter fjernes fixitivet fra røret uden at forstyrre embryonerne. Embryonerne vaskes tre gange i steril, filtreret PBS i 15 minutter ved stuetemperatur.Embryonerne dehydreres i en ethanolserie i fem minutter hver med 50%70% og 85%ethanol fortyndet i PBS. Vask tre gange i 100% ethanol. Opbevar embryoner i 100% ethanol ved 20 grader Celsius, eller gå videre til næste trin.Derefter overføres embroyos til et passende fartøj, og eventuel resterende væske fjernes. Tilsæt HMDS og ethanol i et forhold på en til en til embryonerne i 30 minutter. Fjern derefter væsken og tilsæt ren HMDS i 30 minutter.Fjern væsken fra embryonerne med en pipette og lad dem tørre i 30 minutter. Brug en lille børste og dobbeltsidet tape til at montere de tørrede embryoner på SEM-stubs, med ventrale sider op. Sæt stubbene i en sputter belægning maskine til guld partikel belægning.Et af de mest delikate trin i SEM-partiklen er at montere embryonerne i den korrekte retning på stubben. Når embryonet lander på båndet, kan orienteringen ikke ændres længere. Derefter skal de belagte stubbe sættes i et SEM-mikroskop, et vakuum påføres og observeres de embryonale nikder og notochordal pladeceller med cilier.Efter fjernelse af embryoner på E7.75, læg dem i PBS Tween i en petriskål på is. Under en kemisk hætte overføres embryonerne til et mikrocentrifugerør, der indeholder fiksativ opløsning. Derefter fjernes fikseringseativet fra røret, idet man skal passe på ikke at røre ved embryonerne.Derefter vaskes embryonerne tre gange i PBS, der indeholder 0,2% Triton X-100 i 5 minutter ved stuetemperatur på en nøddeskryser. Fjern den sidste vask fra embryonerne og tilsæt blokerende opløsning, der indeholder PBS Triton, med 10% varme inaktiveret serum. Bloker embryonerne i mindst to timer på en nutator ved fire grader Celsius.Dernæst fjernes blokeringen og tilsættes ca. en milliliter primær antistof fortyndet i blokerende opløsning. Inkuber embryonerne natten over på en nutator ved fire grader Celsius. Fjern det primære antistof og gem det til senere brug.Skyl derefter embryonerne med PBS Triton to gange. Og vask dem tre gange i 30 minutter på en nutator. Vasken erstattes med det fortyndede florescence-konjugerede sekundære antistof mod den primære antistofværtsart.Og inkubere natten over på en nutator ved fire grader Celsius. Fjern derefter det sekundære antistof og skyl embryonerne med PBS Triton to gange. Før vask tre gange i 30 minutter med PBS Triton.Den sidste vask udløses med PBS Triton indeholdende fortyndet florescence konjugerede falloidin og fortyndet DAPI og plet i en time ved stuetemperatur. Skyl derefter embryonerne to gange i PBS Triton. Og vask dem med PBS Triton i 30 minutter ved stuetemperatur.Derefter skal PBS Triton udskiftes med PBS, og embryonerne efterlades på is. Derefter forberede rene, positivt ladede dias, dække glider og vandige glycerol baseret montering medier. Placer to stykker af klar tape 15 millimeter fra hinanden på diaset.Brug derefter en modificeret P200-pipette under dissekerende mikroskop til at flytte et foster til diaset. Brug fine saftæt, foretage to fulde nedskæringer på sidesiden af æggeblomme sæk til at udfolde fosteret. Placer derefter fosteret med den ventrale side op.Tilføj 50 mikroliter monteringsmedier til embryonet. Derefter skal du tilføje en dub af montering medier til dækslet slip. Placer det strækker sig over de to stykker tape, og sænk det langsomt på embryonerne ved hjælp af en bøjet nål.Brug en absorberende tørre til at fjerne overskydende monteringsmedier, idet du skal passe på ikke at flytte dækslet slip. Brug derefter en generøs mængde neglelak til at forsegle siderne af dækslet slip. Endelig skal du bruge et scanningskonfokalt mikroskop til at observere embryonerne.Det er vigtigt ikke at flytte dækslet slip efter montering det over embryoner, fordi det kan fordreje dem for 3D visualisering. Ved hjælp af scanning elektronmikroskopi blev dannelsen af noden i vild type og frataget et mutant museembryon ved E7.75 observeret. I modsætning til den pitformede node i vildtypen viste de mutante embryoner en flad og en almindelig node og nodalcordal plade.Hele nu til immunfluorescens blev brugt til at studere node og notochordal plade dannelse defekter i Strip 1 mutant embryoner på celleniveau. Dataene viste, at de var unormale og hæmmede i de mutante embryoner. Noden og nodalcortal plade er kun forbigående til stede på overfladen af fosteret, derfor timing er afgørende for succes SEM.For eksempel er to til fire somite embryoner godt for SEM analyse af en moden node med lange cilier. Renheden reagenser er også afgørende for succes af disse teknikker, især i sondering af ultrastruktur af SEM. Tiny urenheder, der holder sig til fosteret normalt resultere i enorme artefakter.Vi mener, at disse to teknikker giver supplerende oplysninger om strukturen af node og nodalcortal plade under normal udvikling og i mutanter, der viser fejl i dannelsen af disse strukturer.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Kontrast Imaging i museembryoer Brug højfrekvent ultralyd

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy Nanotomy of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Storstilet Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) af Sund og Tilskadekomne Zebrafisk Brain

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution electron microscopy. Others and we previously ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering til sammenligning genekspression domæner i<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryoner

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Metoder til at undersøge lymfeknuder kirtel og hæmocytter i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Organ Kultur og Whole Mount Immunofluorescens Farvning af Mouse Wolffian Kanaler

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualisere Multiciliated celler i zebrafisk gennem en kombineret protokol af hele Mount fluorescerende In Situ hybridisering og immunfluorescens

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitative hele-mount immunofluorescens analyse af Cardiac stamfader populationer i mus embryoner

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Multimodal hierarkisk billeddannelse af serielle sektioner for at finde specifikke cellulære mål inden for store mængder

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Hele Mount immunofluorescens og follikel kvantificering af kulturperler mus æggestokke

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

Analyse af hjerte kammer udvikling under musen embryogenese bruger hele bjerget epifluorescensmikroskop

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...