Name: visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence
Uploaded: 2018-11-06T13:30:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence at JoVE.com

H.B wird unterstützt durch die Start-up Finanzierung von der medizinischen Fakultät und SFB829 von der Universität zu Köln. C.X wird von der DFG unterstützt BA 5810/1-1 zu gewähren. Wir möchte die Imaging-Einrichtungen am CECAD Forschungszentrum und Memorial Sloan Kettering Cancer Center (New York, USA). Wir danken für seine Einsicht bei der Montage der Embryos für WMIF Joaquín Grego-Bessa (Spanisch National Center for Cardiovascular Research, Madrid, Spanien).

Alle Experimente tierexperimentelle stimmten mit den zuständigen Behörden in Nord-Rhein-Westfalen (LANUV-NRW).
(1) Rasterelektronenmikroskopie des Knotens embryonalen Maus
<ol><li>Opfern die schwangere weiblichen Maus an ~ E7.5 (2-4 Somiten Stufe) durch zervikale Dislokation. Eine ausführliche Erläuterung mit Diagrammen der Schritte 1.1 - 1.7 gibt es in Maus-Embryo-Labor-Handbücher-13.</li>
	<li>Öffnen Sie den Bauch durch die Haut und Mesenterien und Entfernen der Gebärmutter mit Schere und feine Pinzette.</li>
	<li>Spülen Sie die Gebärmutter kurz in destilliertem Wasser und legen Sie sie in einer kleinen sauberen Petrischale (6 cm) mit 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).</li>
	<li>Entfernen Sie unter einem Mikroskop sezieren und mit feinen Pinzette die uterinen Muskeln um die einzelnen Deciduae oder Implantation Websites freizugeben.</li>
	<li>Halten Sie jedes Decidua mit ein paar Zangen und das andere Paar eine longitudinale voll dicke Einschnitt zwischen den roten Teil (zukünftige Plazenta) und weißen Teil (wo sich der Embryo befindet). Oberflächliche Perforationen vertikal entlang den weißen Teil der Dezidua zusammenhängend mit der Schnitt zu machen. Auseinanderziehen Sie der Dezidua horizontal in zwei Hälften und der Embryo in den weißen Teil der Dezidua aushöhlen Sie vorsichtig.</li>
	<li>Übertragen Sie den Embryo auf eine neue Petrischale (35 mm) mit frischen steril filtriert PBS. Wiederholen Sie für alle Deciduae/Embryonen.</li>
	<li>Reicherts Membran zu entfernen, eine relativ undurchsichtig Membran Verschlingung des Embryos, von jedem Embryo durch Hänseleien es entfernt wie eine Socke Ectoplacental Kegel (rötliche Implantationsort) ab. Für die Genotypisierung, nehmen Sie ein kleines Stück (~ 0,1 mm2) von dem Dottersack in diesem Stadium.</li>
	<li>Übertragen Sie unter einer chemischen Kapuze und angemessenen Schutz (Handschuhe) tragen die Embryonen auf EM Grade Fixiermittel bestehend aus 2,5 % Glutaraldehyd in steril filtriert PBS in einem Microcentrifuge (1,5 mL) Rohr bei Raumtemperatur. Beheben Sie die Embryonen über Nacht bei 4 ° C.</li>
	<li>Sorgfältig entfernen Sie das Glutaraldehyd Fixiermittel aus der Tube ohne Berührung der Embryonen und in einem richtigen Abfallbehälter entsorgen. Waschen Sie die Embryonen dreimal in steril filtriert PBS für 15 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Die Embryonen in einem Ethanol-Serie für 5 min zu entwässern: 50 %, 70 % und 85 % dreimal in 100 % oder absoluten Ethanol. Speichern Sie die Embryonen bei −20 ° C in Ethanol oder direkt mit dem nächsten Schritt fortfahren.</li>
	<li>Transferieren Sie die Embryonen in Ethanol, Körbe für den kritischen Punkt (CPD) in einer kritischen Punkt Trockner Maschine trocknen. Füllen Sie die Kammer mit Ethanol auf die Körbe vollständig zu bedecken.</li>
	<li>Tauschen Sie das Ethanol durch sorgfältig spülen mit flüssigem CO2 für zehn Mal bei 10 ° C. Lassen Sie flüssiges CO2 nach dem letzten Schritt ab, bis die Kammer halb voll ist. Erhitzen Sie bis zu 40 ° C, bis der Druck 80 bar (der kritische Punkt erreicht) und das flüssige CO2 auf Gas ändert. 10 min warten und dann langsam das Gas über ca. 45 min Abblasen.</li>
	<li>Als einfachere Alternative zu CPD zum Trocknen hinzufügen der Embryonen in Ethanol für 30 min Hexamethyldisilazane (HMDS) in einem Verhältnis von 1:1. Dann transfer der Embryonen zum reinen HMDS für 30 min. entfernen die Embryonen aus der Flüssigkeit mit einer Pipette und lassen Sie diese für 30 min trocknen. Hinweis: Beide Trocknungsmethoden arbeitete ebenso gut in unseren Händen.</li>
	<li>Verwenden Sie einen feinen Pinsel die getrockneten Embryonen mit der Bauchseite (Knoten), an ein SEM-Stub mit doppelseitigem Klebeband befestigen.</li>
	<li>Legen Sie die Stubs mit den Embryonen in ein Sputter-Beschichtungsanlage für gold Teilchen Beschichtung, die bevorzugt wird, die langen, dünnen Cilien zu berechnen. Tragen Sie eine Schicht von 120-150 Å; die Zeit ist abhängig von der Strom, der mit jeder Probe variieren.</li>
	<li>Legen Sie die beschichteten Stubs mit Embryonen in einem SEM-Mikroskop, Vakuum anzuwenden und beobachten die embryonalen Knoten und notochordal Platte Zellen mit Zilien bei Vergrößerungen von 1000 X bis hin zu 15, 000 X.</li>
</ol>2. ganze Mount Immunfluoreszenz der Maus Knoten und Notochordal Platte
<ol><li>Mit eiskaltem PBS mit 0,05 % Tween 20 (PBSTw), führen Sie die Schritte oben 1,1-1,7 zu entfernen die Embryonen im E7.75 und legen Sie sie in PBSTw in einem 35 mm Petrischale auf Eis.</li>
	<li>Übertragen Sie unter einer chemischen Kapuze und angemessenen Schutz (Handschuhe) tragen die Embryonen auf eine Fixativ Lösung von 4 % Paraformaldehyd mit PBS-Puffer in einem Microcentrifuge Schlauch. Beheben Sie die Embryonen über Nacht bei 4 ° C.</li>
	<li>Sorgfältig entfernen Sie Paraformaldehyd Fixiermittel aus der Tube ohne Berührung der Embryonen und in einem richtigen Abfallbehälter entsorgen. Waschen Sie die Embryonen dreimal mit PBS-Puffer mit 0,2 % Triton x-100 (PBSTr) für 5 min bei Raumtemperatur. Führen Sie die Wasch- und nächsten Inkubationsschritte auf Nutating Shaker.</li>
	<li>Entfernen der letzten Wäsche und blockierende Lösung mit PBSTr mit 10 % Hitze-inaktivierten Serum (aus der Wirtsarten des sekundären Antikörpers). Block von 2 h zu Nacht (oder länger) auf ein Nutator bei 4 ° C.</li>
	<li>Entfernen Sie die Blockierung und fügen ~ 1 mL des primären Antikörpers in blocking-Lösung, zum Beispiel ein Anti-T-Antikörper bei Verdünnung 1: 500 verdünnt. Inkubieren Sie über Nacht (oder mehr) auf einen Nutator bei 4 ° c</li>
	<li>Entfernen Sie den primären Antikörper und durch Zugabe von Natriumazid, eine Endkonzentration von 0,02 % (20 % Aktien zu 1 mL der Antikörperlösung 1 µL) für die spätere Verwendung zu speichern. Der Antikörper kann wiederverwendet werden ~ 10 Mal. Spülen Sie die Embryonen zweimal mit PBSTr und waschen Sie sie dann drei Mal für 30 min auf eine Nutator bei 4 ° C.</li>
	<li>Ersetzen die Wäsche mit einem Fluoreszenz-konjugierten Sekundärantikörper gegen den Primärantikörper Wirtsarten, verdünnt ~ 1: 1000 Nacht (oder länger) auf ein Nutator bei 4 ° C.</li>
	<li>Entfernen Sie den sekundären Antikörper und zweimal mit PBSTr, dann waschen dreimal für 30 min mit PBSTr spülen.</li>
	<li>Ersetzen Sie die letzten Waschen mit PBSTr mit 1: 500 Fluoreszenz konjugiert Phalloidin, F-Aktin und 1: 1000 DAPI, um Kerne für 1 h bei Raumtemperatur Fleck Fleck.</li>
	<li>In PBSTr zweimal spülen Sie und waschen Sie einmal mit PBSTr für 30 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Ersetzen Sie PBSTr durch PBS und lassen Sie die Embryonen auf Eis. Bereiten Sie sauber positiv geladenen Folien (60 x 24 mm) und Deckgläsern (24 x 24 mm) und wässrigen Glycerin-basierte Montage Medien, z. B. 90 % Glycerin in 1xPBS und ein antifade Reagenz, die Embryonen zu montieren.</li>
	<li>Setzen Sie zwei Stücke von durchsichtigem Klebeband in einer Entfernung von ~ 15 mm voneinander entfernt auf den klaren Teil der Folie. Dadurch wird genügend 3D-Raum (in der Z-Dimension) erstellt, die es ermöglichen würde, Abflachung der Embryonen, aber nicht vollständig zerquetschen sie.</li>
	<li>Unter dem sezierenden Mikroskop bewegen vorsichtig die Embryonen mit einer geschnittenen P200-Pipette (damit genug Platz für den Embryo übertragen und nicht beschädigt werden kann) auf die Folie.</li>
	<li>Mit feinen Pinzette, kürzen Sie zwei voll auf die Seitenflächen der Dottersack, den Embryo zu entfalten. Legen Sie den Embryo mit der Bauchseite (Knoten und notochordal Platte) bis (dorsal des Neuralrohrs unten auf der Folie).</li>
	<li>Fügen Sie 50 µL Medien auf den Embryo zu montieren. Platz 4-5 Embryonen pro Folie. Hinzufügen eines Dab-Montage Medien zum Rand des Deckglases, die zuerst berühren die Folie (obere oder untere Seite), dann legen Sie es zwischen die beiden Teile des Bandes und senken es langsam auf die Embryonen mit einer feinen Pinzette oder einer gebogenen feinen Nadel unter Vermeidung von Luftblasen zu schaffen.</li>
	<li>Mit einem saugfähigen Tuch reinigen Sie die überschüssige Montage-Medien. Achten Sie darauf, dass Sie nicht das Deckglas dabei zu bewegen.</li>
	<li>Verwenden eine großzügige Menge von Nagellack, versiegeln Sie die Seiten des dem Deckglas ohne es zu bewegen.</li>
	<li>Unter einem Scan confocal Mikroskop beobachten.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

In dieser Arbeit zeigen wir wie Sie SEM und WMIF um die embryonalen Maus Knoten und notochordal Platte visualisieren durchführen. Die geringe Größe des gastrulating Mausembryonen ~ E7.5 und das Vorhandensein von diesen Strukturen auf der Oberfläche sind sie ideal zu studieren, mit den Techniken beschrieben2,7,8. Die Verfügbarkeit von guten Antikörper, wie T und Zilien Marker gibt ausgezeichnete 3D Informationen über die Struktur, Organisation und Bildung von diesen wesentlichen embryonalen Organisatoren8WMIF.
Weil Maus Embryonalentwicklung in einem sehr schnellen Tempo verläuft und die Knoten und notochordal Platte nur vorübergehend auf der Oberfläche des Embryos vorhanden sind, ist das Timing entscheidend für den Erfolg dieser Experimente2,3. Beispielsweise eignen sich 2-4 Somiten Embryonen für SEM-Analyse einer Reifen Knoten Grube mit langen Cilien. In viel früheren oder späteren Embryonen (z. B. 12 h vor oder nach) kann der Knoten nicht auf der Oberfläche vorliegen. WMIF ist in dieser Hinsicht ein wenig flexibler aber die Strukturen selbst sind auch vorübergehend während der Entwicklung und das Timing hängt in diesem Fall die Forscher Interessen.
Die Reinheit der Reagenzien ist auch entscheidend für den Erfolg dieser Techniken, vor allem in sondieren die Ultrastruktur von SEM Tiny Verunreinigungen, die in der Regel mit den Embryonen bleiben führen Sie riesige Artefakte.
Wir haben zwei verschiedene Methoden der Embryo Fixierung für SEM eines getestet mit halben Karnovsky Fixiermittel (2,5 % Glutaraldehyd, 2 % Paraformaldehyd und 0,1 M Cacodylate-Puffer) und ein einfacher 2,5 % Glutaraldehyd in 1 X PBS. Wir bevorzugen die Glutaraldehyd und PBS Fixiermittel wie in Schritt 1 beschrieben, jedoch wir und andere haben auch die halbe Karnovsky Fixiermittel erfolgreich eingesetzt für SEM
Wir haben auch zwei Methoden der Trocknung der Embryos für SEM verglichen und fanden keinen Unterschied in der Qualität der Probe entweder mithilfe einer kritischen Punkt Trockner oder HMD wie in Schritt 1 beschrieben und berichtet an anderer Stelle14.
Für Schritt2, wir testeten Einbettung der Embryonen nach der endgültigen Waschschritten in 1 % niedrig schmelzende Agarose auf eine 35 mm Glasboden Schüssel montiert und dann Richtfest es mit ~ 10 µL Eindeckmedium. Diese Einbettung Methode funktioniert und bewahrt die ursprüngliche 3D-Struktur des Embryos und zugehörigen Strukturen; multiphoton Mikroskop ist jedoch erforderlich, um die Probe Bild, da eine regelmäßige confocal Mikroskop nicht so tief in die intakten Embryonen erreichen kann (~ 1 mm).
Wir glauben, dass mit diesen beiden Techniken gibt ergänzende Informationen über die Struktur des Knotens und der notochordal Platte während der normalen Entwicklung und Mutanten die Mängel bei der Bildung dieser Strukturen zeigen.

Gastrulation und die begleitenden morphogenetischen Bewegungen sind entscheidend für die Gestaltung der Maus-Embryo-1. Die Veränderungen in der zellulären Form und Organisation während der Morphogenese diktieren Positionsinformationen zu regulieren Zelle Schicksal und erlauben auch die anschließenden Signalwege genau ihre Aufgaben der neu gegründeten Mikrobeschichten1zu diversifizieren. Die Bildung der Transienten Organisation Strukturen und Signalisierung Zentren wie die Knoten und die Chorda ist essentiell für die Ausführung von Entwicklungs Programm2. Entwicklungs Biologen haben eine Vielzahl von Techniken verwendet, um die Morphogenese dieser Strukturen, am bemerkenswertesten ist die Verwendung von zellulären Reporter und live- ex-Vivo imaging, die Dynamik zellulärer und subzellulärer Verhalten2 Folgen zu studieren ,3,4. In diesem Bericht konzentrieren wir uns auf die Details unserer optimierte Protokolle für zwei dieser Techniken zu beschreiben: Scannen von Rasterelektronenmikroskopie (SEM) und ganze Berg Immunfluoreszenz (WMIF), die waren und sind immer noch maßgeblich bei der Untersuchung der Morphogenese des Knotens und die notochordal Platte, die Vorläufer der Chorda.
Der embryonalen Maus-Knoten ist eine tropfenförmige Tasse von Zellen, die auf der ventralen Oberfläche des Mausembryos in den frühen bis späten Kopf Falte Phasen während der Gastrulation und Morphogenese (embryonale Tag, E7.5-E8) befindet2,5, 6,7. Die notochordal Platte entspringt morphologisch anterior Knoten3. Jede Zelle in den Knoten und notochordal Platte zeichnet sich durch einen einzigen Zilie, die nach außen ragt, die länger in Knoten Zellen aber deren Länge variiert mit der Entwicklungsstufe2. Die Rotation der Flimmerhärchen in der Knoten-Grube hat sich gezeigt, wichtig für die Signalisierung, die links-rechts-Asymmetrie4bestimmt. Die notochordal Platte ist der Vorläufer der Chorda, die Signalisierung Zentrum, das für die Strukturierung von der angrenzenden Somiten und die darüberliegenden Neuralrohr3wichtig.
Wegen der Eigenschaften der Lage (Oberfläche), Form (Pokal) und besitzen unterschiedliche äußere Zellstrukturen (Zilien) wurde SEM traditionell verwendet, um Knoten und notochordal Platte zu visualisieren und studieren ihre Entstehung und Struktur2, 7. SEM wird auch verwendet, um die Veränderungen in der Struktur der Knoten selbst oder die Cilien auf seine Zellen in Mutationen, die Gastrulation, Morphogenese sowie Zilien Bildung8,9,10betreffen zu studieren. SEM ist eine Technik, die einen fokussierten Strahl von Elektronen, die topologische Ultrastruktur der äußeren Oberfläche der Materialien wie biologischer Präparate11Verhören nutzt. Die Probe ist in der Regel fest, getrocknet und dann Sputter-beschichtet mit Metallen für die Beobachtung unter dem Rasterelektronenmikroskop wie in Schritt 1 beschrieben.
WMIF ist eine Färbung Technik, Gen-Produkte, wie zum Beispiel Proteine, dreidimensionalen (3D) zu visualisieren. WMIF von Gewebe, Organen oder sogar ganze Organismen bietet räumliche Informationen über die Verteilung des Signals und die Form der daraus resultierenden Struktur in 3D. Die Technik basiert auf die Festsetzung der Probe, die sie dann mit fluoreszierenden Konjugate beflecken. Maus-Embryonen ~ E7.5 sind klein und transparent und daher ideal für WMIF Protokolle, Knoten und notochordal Platte zu visualisieren. Beispielsweise der Transkriptionsfaktor, die Barchyury (T) zum Ausdruck kommt, in den Kernen des Knotens und notochordal Platte und in geringerem Maße in der primitive Streak, um E7.5-E8 der Embryonalentwicklung und gut funktionierende Antikörper gegen T von WMIF sind im Handel zur Verfügung und ermöglichen das Färbeverfahren. Die Zellen des Knotens und notochordal Platte zeichnen sich auch durch verengte apikalen Oberflächen, die außen stehen und somit kann auch gebeizt mit Fluoreszenz-konjugiert Phalloidin, Mark F-Aktin an der apikalen Verengungen. Unter Verwendung dieser Reagenzien als Beispiele, bietet die Kombination aus T und F-Aktin Färbung von WMIF eine Darstellung des Knotens und notochordal Platte in 3D in gastrulating Mäuseembryonen, wie wir in Schritt2 8zeigen. Jedoch können Marker der Zilien, wie ARL13B oder Schimmelpilzschäden Tubulin sowie anderen Markern des Knotens und notochordal Platte, z. B. FOXA2, auch durchführen WMIF auf entwickelnden Maus Embryonen3,4verwendet werden.
Wir haben gezeigt, dass striatin-Interaktion Protein 1 (STRIP1) für normale Gastrulation und Morphogenese in der Maus Embryo8unerlässlich. STRIP1 ist eine Kernkomponente des striatin-Interaktion Phosphatasen und Kinasen-komplexe (STRIPAK), die wir und andere in den Aktin-Zytoskelett Organisation8,12in Verbindung gebracht haben. Ein schwerwiegenden Mangel in Strip1 mutierten Embryonen ist bei der Bildung der axialen Mesoderm (Knoten und notochordal Platte) und Erweiterung der Antero-posterioren Körperachse. Wir haben SEM und WMIF verwendet, um den Knoten und notochordal Platte im Wildtyp (WT) und Strip1 mutierten Embryonen zu analysieren, wie wir in die Vertreter Ergebnisse und Vergleichszahlen zeigen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:843px;" width="842">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">1,1,1,3,3,3 Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td style="width:233px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:163px;">3840</td>
			<td style="width:161px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-T antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Critical Point Dryer</td>
			<td>Blazers Union</td>
			<td>CPD 020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4099,0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutardialdehyde solution 25%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1042390250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4974,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SEM coating unit PS3</td>
			<td>Agar Aids for Electron Microscopy</td>
			<td>PS3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SEM microscope Quantum FEG 250</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (FEI)</td>
			<td>Quantum FEG 250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence

Nach der Implantation Mausembryos erfährt große Formänderungen nach der Einleitung der Gastrulation und Morphogenese. Ein Markenzeichen der Morphogenese ist die Bildung der Transienten-Organisatoren, die Knoten und notochordal Platte aus Zellen, die das primitive Streak durchlaufen haben. Die richtige Bildung dieser Signalisierung Zentren ist essentiell für die Entwicklung des Körpers Plans und Techniken, um sie zu visualisieren sind von großem Interesse für die Maus Entwicklungs Biologen. Die Knoten und notochordal Platte liegen auf der ventralen Oberfläche der gastrulating Mausembryonen um embryonale Tag (E) 7.5 Entwicklung. Der Knoten ist eine schalenförmige Struktur, deren Zellen einen einzigen schlanken Zilie besitzen. Die richtige subzelluläre Lokalisation und die Drehung der Zilien in der Knoten-Grube bestimmt, links-rechts-Asymmetrie. Die notochordal Platte Zellen besitzen auch einzelne Zilien, wenn auch kürzer als die der Knoten Zellen. Die notochordal Platte bildet die Chorda fungiert als wichtige Signalisierung Veranstalter für Somitogenesis und neuronale Musterbildung. Da die Zellen des Knotens und notochordal Platte befinden sich vorübergehend auf der Oberfläche und Cilien besitzen, können sie mit Rasterelektronenmikroskopie (SEM) visualisiert werden. Unter anderen Techniken zur Visualisierung verwendet diese Strukturen auf zellulärer Ebene ist ganze Berg Immunfluoreszenz (WMIF) mit Hilfe der Antikörper gegen die Proteine, die hoch in den Knoten und notochordal Platte zum Ausdruck kommen. In diesem Bericht beschreiben wir unsere optimierte Protokolle um SEM und WMIF des Knotens und notochordal Platte in Entwicklungsländern Mäuseembryonen, helfen bei der Beurteilung der Gewebe Form und zelluläre Organisation in Wildtyp und Gastrulation mutierten Embryonen durchzuführen.

Um zu untersuchen, die Entstehung des Knotens im WT und Strip1 mutierten Embryonen im ~ E7.5, verwendeten wir SEM wie in Schritt 1 beschrieben und in Abbildung 18gezeigt. Die Ultrastrukturforschung Details der externen Topologie mit SEM waren sehr informativ und es war sofort klar, dass im Gegensatz zu der Grube-förmigen Knoten im WT Embryonen, die mutierten Embryonen einen abgeflachten und unregelmäßigen Knoten. Höherer Vergrößerung des Embryos zeigte die charakteristischen Cilien auf Knoten-Zellen, die sie eindeutig identifiziert. Deutliche geringere Dichte von Zilien in das mutierte möglicherweise zum Verlust der Grube Knotenstruktur und Krümmung oder eine geringere Anzahl an Knoten Zellen zurückzuführen. Die notochordal Platte erscheinenden ausgehend vom Knoten war auch unregelmäßig in der mutierten Embryonen. Sie waren mit ihren kürzeren Zilien identifizierbar. SEM war daher wichtig, die Strip1 Mutanten8Knoten Morphogenese Mängel offenbaren. Wir haben auch SEM in früheren Studien verwendet, um das Fehlen der Zilien im embryonalen Knoten von Mutanten zeigen, die Centriolen, fehlte die Cilien9die Vorlage vorsehen.
Um die axiale Mesoderm Bildung Mängel in Strip1 mutierten Embryonen auf zellulärer Ebene zu untersuchen, haben wir WMIF verwendet, wie in Schritt2 beschrieben und in Abbildung 2dargestellt. Mit dieser Technik wurden die Knoten und notochordal Platte leicht an F-Aktin und T Färbung erkennen. WT-Knoten und notochordal Platte Zellen haben apikale Domänen eingeengt, wo F-Aktin wurde bereichert, und nukleare T Färbung war offensichtlich. Die notochordal Platte Rostral erweitert in der WT aber war kurz und unregelmäßig in den Mutanten. Die Daten zeigten, dass F-Aktin-Organisation in den verschiedenen Schichten der Keim der mutierten Embryonen einschließlich der axialen Mesoderm8abnorm ist. So war WMIF maßgeblich, die Mängel im Knoten und notochordal Platte Bildung in Strip1 mutierten Embryonen zu studieren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58321/58321fig1.jpg"> Abbildung 1 . Rasterelektronenmikroskopie zeigt die Mängel im Knoten Morphogenese in Strip1 mutierte Mausembryonen. (Oben) SEM Analysen von WT und Strip1 mutierte ventralen embryonalen Knoten und notochordal Platten (Noto)8. Ein Beispiel für ein geringer Vergrößerung-Bild eines Embryos WT wird auf der linken Seite angezeigt. (Unten) Höheren Vergrößerungen des Zentrums der Knoten gezeigt oben offenbart die langen Verlaufsformen von Knoten Zellen projizieren. Anterior ist in alle Panels. Skalieren Sie Bars: 30 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58321/58321fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58321/58321fig2.jpg"> Abbildung 2 . Ganzen Berg Immunfluoreszenz zeigt die abnorme Knoten und notochordal Platte auf zellulärer Ebene in Strip1 mutierten Embryonen. (Oben) Ventralen 3D-Rendering (Volocity Software) WMIF auf WT und Strip1 mutierten Embryonen mit einer Kombination von Fluoreszenz-konjugiert Phalloidin (F-Aktin, rot) und T (grün) Antikörper Färbung. (Unten) Weitere Beispiele für die Färbung oben mit Schwerpunkt auf den Knoten mit höheren Zoom und einschließlich DAPI gezeigt. Anterior ist in alle Panels. Skalieren Sie Bars: 30 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58321/58321fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisierung der Knoten und Notochordal Platte In Gastrulating Maus-Embryonen mittels Rasterelektronenmikroskopie und ganze Mount Immunfluoreszenz

Die Knoten und notochordal Platte sind vergänglich Signalisierung Organisatoren bei der Entwicklung von Mäuseembryonen, die mit mehreren Techniken visualisiert werden können. Hier beschreiben wir im Detail wie Sie zwei Techniken ihre Struktur und Morphogenese durchführen: 1) Rasterelektronenmikroskopie (SEM); und 2) ganze Berg Immunfluoreszenz (WMIF).

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Der Knoten und die Notochordalplatte sind wesentliche Organisatoren während der embryonalen Entwicklung der Maus. Heute werden wir zwei Techniken beschreiben, die von Entwicklungsbiologen verwendet werden, um diese Strukturen zu visualisieren und zu untersuchen. Im ersten Protokoll zeigen wir, wie man Diesperelektromikroskopie, SEM und im zweiten, ganzen Mount-Immunfluoreszenz durchführt.Der Knoten und die Notochordalplatte sind vorübergehend auf der Oberfläche des Embryos am Embryonaltag E7.75 vorhanden, Betonung winzige Zilien projizieren nach außen, die ihre Identifizierung und Visualisierung durch SEM ermöglichen. In beiden Protokollen zeigen wir kritische Schritte im Umgang mit den relativ kleinen Mausembryonen auf und konzentrieren uns auf deren Übertragung und Route. Öffnen Sie zunächst den Bauch einer eingeschläferten schwangeren Maus durch die Haut und die Mesenterien.Entfernen Sie die Gebärmutter mit Schere und feinen Zangen. Spülen Sie die Gebärmutter kurz in destilliertes Wasser und legen Sie sie in eine kleine Petrischale mit PBS. Verwenden Sie dann ein Sezieren Mikroskop und feine Zange, um die Gebärmuttermuskeln zu entfernen, um die einzelnen Decidui zu befreien.Halten Sie unter dem Sezieren des Mikroskops jede Decidua mit einem Paar Zangen und verwenden Sie ein anderes Paar, um einen Längsschnitt mit voller Dicke zwischen dem roten und dem weißen Teil herzustellen. Machen Sie oberflächliche Perforationen vertikal entlang des weißen Teils der Dezidua, angrenzend an den Schnitt. Ziehen Sie dann die Decidua horizontal in zwei Hälften auseinander und entfernen Sie vorsichtig den Embryo aus dem weißen Teil der Decidua.Danach übertragen Sie die Embryonen in eine neue Petrischale, die sterilgefilterte PBS enthält. Entfernen Sie Reicherts Membran von jedem Embryo, beginnend am ektoplazentalen Kegel. Für zukünftige Genotypisierung, entfernen Sie ein kleines Stück des Dottersacks.Übertragen Sie die Embryonen unter einer chemischen Haube in ein Mikrozentrifugenrohr, das einen Fixitiven em-Grad enthält, der aus 2,5% Glutaraldehyd und sterilgefiltertem PBS besteht. Danach entfernen Sie den Fixitiven aus dem Rohr, ohne die Embryonen zu stören. Waschen Sie die Embryonen dreimal in sterilem, gefiltertem PBS für 15 Minuten bei Raumtemperatur.Dehydrieren Sie die Embryonen in einer Ethanol-Serie für jeweils fünf Minuten, wobei 50%70% und 85%Ethanol in PBS verdünnt werden. Dreimal in 100% Ethanol waschen. Lagern Sie Embryonen in 100% Ethanol bei 20 Grad Celsius, oder fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.Danach die Sticker in ein geeignetes Gefäß überführen und die verbleibende Flüssigkeit entfernen. Fügen Sie DEN Embryonen 30 Minuten lang HMDS und Ethanol im Verhältnis eins zu eins hinzu. Dann entfernen Sie die Flüssigkeit und fügen Sie reine HMDS für 30 Minuten.Entfernen Sie die Flüssigkeit aus den Embryonen mit einer Pipette und lassen Sie sie für 30 Minuten trocknen. Verwenden Sie eine kleine Bürste und doppelseitiges Klebeband, um die getrockneten Embryonen auf SEM-Stubs zu montieren, wobei die ventralen Seiten nach oben sind. Legen Sie die Stubs in eine Sputterbeschichtungsmaschine für Goldpartikelbeschichtung.Einer der heikelsten Schritte im SEM-Teilchen ist die Montage der Embryonen in der richtigen Ausrichtung auf den Stub. Sobald der Embryo auf dem Band landet, kann die Ausrichtung nicht mehr geändert werden. Danach die beschichteten Stubs in ein SEM-Mikroskop geben, ein Vakuum auftragen und die embryonalen Knoten und notochordalen Plattenzellen mit Zilien beobachten.Nach dem Entfernen der Embryonen bei E7.75, legen Sie sie in PBS Tween in einer Petrischale auf Eis. Übertragen Sie die Embryonen unter einer chemischen Haube in ein Mikrozentrifugenrohr, das eine fixative Lösung enthält. Danach entfernen Sie das Fixativ aus der Röhre, wobei Sie darauf achten, die Embryonen nicht zu berühren.Dann waschen Sie die Embryonen dreimal in PBS, die 0,2%Triton X-100 enthalten, für 5 Minuten bei Raumtemperatur auf einem nussigen Shaker. Entfernen Sie die letzte Wäsche von den Embryonen und fügen Sie eine Blockierende Lösung hinzu, die PBS Triton enthält, mit 10% inaktiviertem Serum. Blockieren Sie die Embryonen für mindestens zwei Stunden auf einem Nutator bei vier Grad Celsius.Entfernen Sie als Nächstes die Blockierung und fügen Sie etwa einen Milliliter Primärantikörper hinzu, der in der Blockierlösung verdünnt wird. Die Embryonen über Nacht auf einem Nutator bei vier Grad Celsius bebrüten. Entfernen Sie den primären Antikörper und speichern Sie ihn für die spätere Verwendung.Dann spülen Sie die Embryonen zweimal mit PBS Triton ab. Und waschen Sie sie dreimal für 30 Minuten auf einem Nutator. Ersetzen Sie die Wäsche durch den verdünnten Blütenstand konjugierten Sekundärantikörper gegen die primäre Antikörper-Wirtsart.Und über Nacht auf einem Nutator bei vier Grad Celsius inkubieren. Entfernen Sie dann den sekundären Antikörper und spülen Sie die Embryonen zweimal mit PBS Triton ab. Vor dem Waschen dreimal für 30 Minuten mit PBS Triton.Ersetzen Sie die letzte Wäsche durch PBS Triton mit verdünntem Blütenstand konjugiertes Phalloidin und verdünntes DAPI und Flecken für eine Stunde bei Raumtemperatur. Dann spülen Sie die Embryonen zweimal in PBS Triton. Und waschen Sie sie mit PBS Triton für 30 Minuten bei Raumtemperatur.Danach ersetzen Sie das PBS Triton durch PBS und lassen Sie die Embryonen auf Eis. Bereiten Sie dann saubere, positiv geladene Dias, Deckelscheine und wässrige Glyzerin-basierte Montagemedien vor. Legen Sie zwei Stücke von klarem Klebeband 15 Millimeter voneinander voneinander auf der Folie.Verwenden Sie dann unter dem Sezieren des Mikroskops eine modifizierte P200-Pipette, um einen Embryo auf das Dia zu bewegen. Mit feinen Zangen, machen Sie zwei volle Schnitte auf den Seiten seiten des Eigelbsacks, um den Embryo zu entfalten. Positionieren Sie dann den Embryo mit der ventralen Seite nach oben.Fügen Sie dem Embryo 50 Mikroliter Montagemedien hinzu. Fügen Sie dann einen Tupfer mit Montagemedien in den Deckbedeckungsbeleg ein. Legen Sie es um die beiden Stücke Von Band, und senken Sie es langsam auf die Embryonen mit einer gebogenen Nadel.Verwenden Sie ein saugfähiges Wischmittel, um überschüssige Montagemedien zu entfernen, wobei Sie darauf achten, den Deckelbeleg nicht zu bewegen. Verwenden Sie dann eine großzügige Menge Nagellack, um die Seiten des Deckelschlupfzu zu versiegeln. Schließlich verwenden Sie ein Raster-Konfokalmikroskop, um die Embryonen zu beobachten.Es ist wichtig, den Deckbedeckungsschlupf nicht nach der Montage über die Embryonen zu bewegen, da er sie für die 3D-Visualisierung verzerren kann. Mittels Rasterelektronenmikroskopie wurde die Bildung des Knotens in Wildtyp und Streifen eines mutierten Mausembryons bei E7.75 beobachtet. Im Gegensatz zum grubenförmigen Knoten im Wildtyp zeigten die mutierten Embryonen einen abgeflachten und einen regulären Knoten und eine Knotenplatte.Ganz jetzt zur Immunfluoreszenz wurde verwendet, um den Knoten und notochordalen Plattenbildung sänglichen Defekten in Strip 1 mutierten Embryonen auf zellulärer Ebene zu untersuchen. Die Daten zeigten, dass sie in den mutierten Embryonen abnormal und verkümmert waren. Der Knoten und die Nodalcortalplatte sind nur vorübergehend auf der Oberfläche des Embryos vorhanden, daher ist Timing für den Erfolg von SEM unerlässlich.Zum Beispiel sind zwei bis vier Embryonen gut für die SEM-Analyse eines reifen Knotens mit langer Zilien. Die Reinheitreagenzien sind auch entscheidend für den Erfolg dieser Techniken, insbesondere bei der Untersuchung der Ultrastruktur durch SEM. Winzige Verunreinigungen, die am Embryo kleben, führen in der Regel zu riesigen Artefakten.Wir glauben, dass diese beiden Techniken ergänzende Informationen über die Struktur des Knotens und der Nodalkortalplatte während der normalen Entwicklung und bei Mutanten geben, die Defekte bei der Bildung dieser Strukturen aufweisen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Contrast Imaging in Maus Embryonen Verwendung von Hochfrequenz-Ultraschall

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy Nanotomy of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Großflächige Raster-Transmissions-Elektronen-Mikroskopie (Nanotomy) gesunder und verletzter cerebra-

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution electron microscopy. Others and we previously ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-Target-Chromogenic Whole-mount<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung zum Vergleich Genexpression Domains in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryos

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methoden, um die Lymphdrüsen und Blutzellen zu prüfen, die in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Orgel, Kultur und Ganze Berge Immunfluoreszenzanfärbung von Maus Wolffschen Gänge

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualisierung von Multiciliated Zellen in der Zebrabärbling durch ein kombiniertes Protokoll der ganze Berg Leuchtstofflampen In Situ Hybridisierung und Immunfluoreszenz

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Quantitative ganze-Mount Immunfluoreszenz Analyse der kardialen Vorläuferzellen Populationen in Mausembryonen

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Multimodale hierarchische Darstellung der Schnittserien für die Suche nach spezifischen zellulären Ziele innerhalb großer Mengen

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Ganze Mount Immunfluoreszenz und Follikel Quantifizierung der kultivierten Maus Eierstöcke

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

Analyse der Entwicklung der kardialen Kammer in der Maus Embryogenese mit ganzen Mount Epifluoreszenz

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...