Name: visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence
Uploaded: 2018-11-06T13:30:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence at JoVE.com

H.B. נתמך על ידי אתחול מימון מן הפקולטה לרפואה SFB829 באוניברסיטת קולון. C.X. נתמך על-ידי DFG להעניק תואר ראשון 5810/1-1. ברצוננו להודות במתקני הדמיה CECAD מרכז מחקר, מרכז הסרטן סלואן קטרינג הנצחה (ניו יורק, ארה ב). אנו מודים חואקין גרגו-Bessa (ספרדית המרכז הלאומי למחקר קרדיו, מדריד, ספרד) על שלו תובנה על הרכבה העוברים על WMIF.

כל הניסויים מעורבים ניסויים בבעלי חיים אושרו על-ידי השלטונות אחראי צפון ריין ווסטפליה (LANUV-NRW).
1. סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים של הצומת עובריים בעכבר
<ol><li>להקריב את העכבר נקבה בהריון ~ E7.5 (שלב somite 2-4) מאת נקע בצוואר הרחם. הסבר מפורט עם דיאגרמות 1.1 שלבים - 1.7 זמין העכבר עובר מעבדה מדריכים13.</li>
	<li>לפתוח את הבטן דרך העור, mesenteries ולהסיר את הרחם באמצעות מספריים ומלקחיים בסדר.</li>
	<li>לשטוף את הרחם בקצרה במים מזוקקים ולמקם אותו בצלוחית קטנה נקייה (6 ס מ) המכיל 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).</li>
	<li>תחת לנתח מיקרוסקופ באמצעות מלקחיים בסדר, הסר את שרירי הרחם כדי לשחרר את deciduae בודדים או את ההשתלה.</li>
	<li>להחזיק כל רותמי עם זוג מלקחיים ולהשתמש הזוג אחרים עושים חתך אורכי מלא-עובי בין החלק האדום (בעתיד השליה) לבין החלק הלבן (שבו העובר נמצא). לבצע ניקובים שטחית אנכית לאורך החלק הלבן של רותמי רציף עם החתך. להפריד את רותמי אופקית לשני חצאים, ולהוציא בזהירות העובר על החלק הלבן של רותמי.</li>
	<li>להעביר את העובר חדש פטרי (35 מ מ) עם PBS סטרילי-מסוננים טריים. חזור על כל deciduae/העוברים.</li>
	<li>הסר את הממברנה של רייכהרט, ממברנה אטומה יחסית שתבלע את העובר, מתוך כל העובר על ידי להקניט זה משם כמו גרב החל מ- קונוס ectoplacental (אתר ההשתלה אדמדם). עבור genotyping, לקחת חתיכה קטנה (~ 0.1 מ מ2) של שק החלמון בשלב זה.</li>
	<li>תחת ברדס כימי ועונדת הגנה הולמת (כפפות), העברת העוברים EM כיתה מקבע המורכב גלוטראלדהיד 2.5% ב- PBS סטרילי-מסוננים צינור microcentrifuge (1.5 מ"ל) בטמפרטורת החדר. לתקן את העוברים בין לילה ב 4 º C.</li>
	<li>בזהירות להסיר את מקבע גלוטראלדהיד מהצינור בלי לגעת העוברים וזורקים במיכל אשפה נאותה. לשטוף את העוברים שלוש פעמים ב- PBS סטרילי-מסוננים, למשך 15 דקות לכל בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מייבשים את העוברים בסדרה אתנול למשך 5 דקות: 50%, 70%, 85% ושלוש פעמים ב 100% או אתנול מוחלטת. לאחסן את העוברים על −20 ° C אתנול או ישירות לשלב הבא.</li>
	<li>העברת העוברים אתנול סלים עבור נקודה קריטית ייבוש (שיקגו) במכונת מייבש נקודה קריטית. למלא את התא עם אתנול כדי לכסות את הסלים לחלוטין.</li>
	<li>חילופי האתנול על ידי בקפידה שטיפה עם נוזלי CO2 עבור עשר פעמים ב 10 מעלות צלזיוס. לנקז את הנוזל CO2 לאחר השלב האחרון עד החדר חצי מלאה. מחממים עד 40 ° צלזיוס עד הלחץ מגיע 80 ברים (נקודה קריטית) ומשנה נוזלי CO2 לגז. לחכות 10 דקות ואז לאט לאט לפוצץ את הגז על פני כ- 45 דקות.</li>
	<li>כחלופה קל רופאות לייבוש, להוסיף hexamethyldisilazane (HMDS) ביחס של 1:1 העוברים אתנול למשך 30 דקות. ואז להעביר העוברים HMDS טהורה במשך 30 דקות הסר העוברים מתוך הנוזל באמצעות פיפטה ולהשאיר אותם להתייבש למשך 30 דקות. הערה: שתי השיטות ייבוש עבד לא פחות טוב בידיים שלנו.</li>
	<li>להשתמש במברשת בסדר כדי לעלות את העוברים מיובשים עם הצד הבטני (צומת) על ספח SEM עם קלטת צדדית כפולה.</li>
	<li>הכנס את הספחים עם העוברים מכונה ציפוי לרעוד. להוציא לציפוי זהב חלקיקים, אשר מעדיפים להאשים את cilia דק ארוך. למרוח שכבה של 120-150; השעה היא תלויה הנוכחי, אשר משתנה בהתאם כל דגימה.</li>
	<li>למקם את הספחים מצופה עם עוברי מיקרוסקופ SEM, להחיל ואקום ולבחון את צומת עובריים והתאים notochordal צלחת עם cilia-הגדלה ועד 1000 X 15, 000 X.</li>
</ol>2. כל הר Immunofluorescence של עכבר צומת ואת צלחת Notochordal
<ol><li>באמצעות PBS קר כקרח עם 0.05% Tween 20 (PBSTw), בצע שלבים 1.1-1.7 לעיל כדי להסיר את העוברים על E7.75 ומניחים אותם ב- PBSTw ב 35 מ מ פטרי על קרח.</li>
	<li>תחת ברדס כימי ועונדת הגנה הולמת (כפפות), העברת העוברים פתרון לשבועיים של paraformaldehyde 4% ב- PBS צינור microcentrifuge. לתקן את העוברים בין לילה ב 4 º C.</li>
	<li>בזהירות להסיר את paraformaldehyde לשבועיים מהצינור בלי לגעת העוברים וזורקים במיכל אשפה נאותה. לשטוף את העוברים שלוש פעמים ב- PBS המכיל 0.2% טריטון X-100 (PBSTr) למשך 5 דקות כל בטמפרטורת החדר. מבצע כל שטיפת ואת הצעדים הבאים הדגירה מטרף nutating.</li>
	<li>להסיר בכביסה האחרונה ולהוסיף חסימה לאודנום PBSTr עם 10% לא פעיל חום סרום (מן המין המארח של הנוגדן משנית). בלוק של שעתיים עד לילה (או יותר) על nutator ב 4 º C.</li>
	<li>להסיר את חסימת ולהוסיף ~ 1 מ"ל של נוגדן ראשוני מעורבבת עם חסימת פתרון, למשל נוגדן anti-T-שבערך דילול. דגירה ללילה (או יותר) על nutator ב 4 º C.</li>
	<li>להסיר את הנוגדן הראשי ולשמור אותו לשימוש מאוחר יותר על-ידי הוספת אזיד הנתרן ריכוז סופי של 0.02% (1 µL של המניה 20% 1 מ"ל של נוגדן פתרון). הנוגדן חוזר ~ 10 פעמים. לשטוף את העוברים פעמיים עם PBSTr ולאחר מכן לשטוף אותם שלוש פעמים במשך 30 דקות כל אחד ב- nutator-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>החלף בכביסה קרינה פלואורסצנטית מצומדת משני נוגדן, נגד המין מארח נוגדן ראשוני, מדולל ב ~ 1:1000 לילה (או יותר) על nutator ב 4 º C.</li>
	<li>להסיר את הנוגדן משני ולשטוף פעמיים עם PBSTr, ואז לשטוף שלוש פעמים במשך 30 דקות עם PBSTr.</li>
	<li>החלף את השטיפה האחרונה PBSTr המכיל שבערך מצומדת זריחה phalloidin, כתם F-אקטין, ו 1:1000 דאפי, כתם גרעינים, לשעה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לשטוף פעמיים ב PBSTr, לשטוף פעם עם PBSTr למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להחליף את PBSTr עם PBS ולהשאיר את העוברים על קרח. להכין שקופיות נקי מפרוטונים שמטענם (60 x 24 מ מ) ואת coverslips (24 x 24mm) ומדיה הרכבה מבוסס-גליצרול מימית, לדוגמה, גליצרול 90% ב- 1xPBS ' של ריאגנט antifade, כדי לטעון את העוברים.</li>
	<li>לשים שני חלקי הסרט השקוף ממרחק של ~ 15 מ מ אחד מהשני על החלק ברורה של השקופית. פעולה זו תיצור די שטח תלת-ממדיים (בממד Z) שיאפשר שיטוח העוברים אבל לא לגמרי מועכים אותם.</li>
	<li>תחת מיקרוסקופ ויבתר, הזז בזהירות את העוברים באמצעות פיפטה P200 לחתוך (כדי לאפשר די שטח עבור העובר להיות מועברים, לא ניזוק) לשקופית.</li>
	<li>בעזרת מלקחיים בסדר, לעשות שני חתכים מלאה על הצד הלטראלי של שק החלמון להתגלות העובר. למקם את העובר עם הצד הבטני (צומת וצלחת notochordal) למעלה (הגבי של שפופרת פגמים בתעלה למטה על השקופית).</li>
	<li>הוסף µL 50 הגוברת מדיה על העובר. מקום 4-5 העוברים לכל שקופית. להוסיף טיפה של הרכבה מדיה לצד של coverslip זה יהיה קודם לגעת השקופית (צד עליון או תחתון), ואז למקם אותו בפישוק על שתי חתיכות של הקלטת להוריד אותו באיטיות אל העוברים באמצעות מלקחיים בסדר או מחט בסדר כפופות תוך הימנעות יצירת בועות אוויר.</li>
	<li>נקה התקשורת הרכבה עודף באמצעות של ניגוב סופג. יש להיזהר לא לעבור את coverslip בתהליך.</li>
	<li>באמצעות כמות נדיבה של לק, חותם את צידי coverslip מבלי להזיזו.</li>
	<li>להתבונן תחת מיקרוסקופ קונפוקלי סריקה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rivera-P&#233;rez, J. A., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+morphogenesis+in+the+early+mouse+embryo.">The dynamics of morphogenesis in the early mouse embryo.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2015).</li><li>Lee, J. D., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+node+and+notochord:+The+cellular+basis+for+the+establishment+and+maintenance+of+left-right+asymmetry+in+the+mouse.">Morphogenesis of the node and notochord: The cellular basis for the establishment and maintenance of left-right asymmetry in the mouse.</a> Developmental Dynamics. 237 (12), 3464-3476 (2008).</li><li>Balmer, S., Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notochord+morphogenesis+in+mice:+Current+understanding+and+open+questions.">Notochord morphogenesis in mice: Current understanding and open questions.</a> Developmental Dynamics. 245 (5), 547-557 (2016).</li><li>Yoshiba, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilia+at+the+node+of+mouse+embryos+sense+fluid+flow+for+left-right+determination+via+Pkd2.">Cilia at the node of mouse embryos sense fluid flow for left-right determination via Pkd2.</a> Science. , (2012).</li><li>Jurand, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+aspects+of+the+development+of+the+notochord+in+mouse+embryos.">Some aspects of the development of the notochord in mouse embryos.</a> Journal of Embryology and Experimental Morpholog. 32 (1), 1-33 (1974).</li><li>Poelmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+head-process+and+the+formation+of+the+definitive+endoderm+in+the+mouse+embryo.">The head-process and the formation of the definitive endoderm in the mouse embryo.</a> Anatomy and Embryology (Berl). , 41-49 (1981).</li><li>Sulik, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+murine+node+and+notochordal+plate.">Morphogenesis of the murine node and notochordal plate.</a> Developmental Dynamics. 201 (3), 260-278 (1994).</li><li>Bazzi, H., Soroka, E., Alcorn, H. L., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STRIP1,+a+core+component+of+STRIPAK+complexes,+is+essential+for+normal+mesoderm+migration+in+the+mouse+embryo.">STRIP1, a core component of STRIPAK complexes, is essential for normal mesoderm migration in the mouse embryo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (51), 10928-10936 (2017).</li><li>Bazzi, H., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acentriolar+mitosis+activates+a+p53-dependent+apoptosis+pathway+in+the+mouse+embryo.">Acentriolar mitosis activates a p53-dependent apoptosis pathway in the mouse embryo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 1491-1500 (2014).</li><li>Huangfu, D., Liu, A., Rakeman, A. S., Murcia, N. S., Niswander, L., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signalling+in+the+mouse+requires+intraflagellar+transport+proteins.">Hedgehog signalling in the mouse requires intraflagellar transport proteins.</a> Nature. 426 (6962), 83-87 (2003).</li><li>McMullan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy+1928-1965.">Scanning electron microscopy 1928-1965.</a> Scanning. 17 (3), 175-185 (2006).</li><li>Bai, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+set+of+conserved+and+new+regulators+of+cytoskeletal+organization,+cell+morphology+and+migration.">Identification and characterization of a set of conserved and new regulators of cytoskeletal organization, cell morphology and migration.</a> BMC Biology. 9, (2011).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Vintersen Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+the+Mouse+Embryo:+A+Laboratory+Manual,+Fourth+Edition.">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Fourth Edition.</a> Cold Harb Lab Press. , (2014).</li><li>Braet, F., De Zanger, R., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drying+cells+for+SEM,+AFM+and+TEM+by+hexamethyldisilazane:+a+study+on+hepatic+endothelial+cells.">Drying cells for SEM, AFM and TEM by hexamethyldisilazane: a study on hepatic endothelial cells.</a> Journal of Microscopy. 186, 84-87 (1997).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

בעבודה זאת, נדגים כיצד לבצע SEM, WMIF כדי להמחיש את הצומת עובריים בעכבר וצלחת notochordal. גודל קטן של עוברי העכבר gastrulating ~ E7.5 ואת נוכחותם של מבנים אלה על פני להפוך אותם אידיאלי ללמוד באמצעות טכניקות תיאר2,7,8. הזמינות של נוגדנים טובים, כגון סמני T ו- cilia, נותן מצוינים נתוני תלת-ממד באמצעות WMIF על מבנה, ארגון היווצרות אלה חיוניים המארגנים עובריים8.
בגלל התפתחות עובריים בעכבר מתקדם בקצב מהיר מאוד ולא צומת ואת צלחת notochordal נמצאים רק transiently על פני השטח של העובר, תזמון חיוני להצלחה של ניסויים אלה,2,3. לדוגמה, 2-4 somite עוברי טובים לניתוח SEM של בור צומת בוגרת עם cilia ארוך. ב הרבה מוקדמות או מאוחרות יותר עוברי (לדוגמה, 12 שעות לפני או אחרי), הצומת לא יהיה נוכח על פני השטח. WMIF קצת יותר גמיש בהקשר זה אבל המבנים עצמם הם גם חולף במהלך הפיתוח, העיתוי תלוי במקרה זה על האינטרסים החוקרים.
הטוהר של ריאגנטים היא חיונית להצלחת שיטות אלה, ובמיוחד בודק את ultrastructure על ידי זיהומים זעירה ב- SEM. זה מקל העוברים בדרך כלל לגרום חפצים ענק.
בדקנו את שתי שיטות שונות של העובר קיבוע עבור SEM אחד באמצעות לשבועיים של חצי Karnovsky (2.5% גלוטראלדהיד, מאגר cacodylate paraformaldehyde ו- 0.1 M 2%) וגלוטראלדהיד פשוטים יותר של 2.5% ב- 1 x PBS. אנו מעדיפים להשתמש גלוטראלדהיד מקבע PBS כפי שמתואר בשלב 1, עם זאת, אנחנו ואחרים יש להשתמש גם לשבועיים של Karnovsky חצי בהצלחה ב- SEM.
לנו יש גם בהשוואה שתי שיטות של מייבש את העוברים SEM ולא מצאו שום הבדל באיכות הדגימה באמצעות נקודה קריטית מייבש או HMDS כפי שמתואר בשלב 1 ודיווח במקום אחר14.
שלב 2, בדקנו הטבעה העוברים לאחר כביסה סופי בשלבים 1% agarose ההיתוך נמוכה רכוב על צלחת זכוכית-התחתון 35 מ מ, ואז ציפוי עם ~ 10 µL של הרכבה בינונית. שיטה זו ההטבעה עובד ושומר את המבנה התלת-ממד המקורי של העובר מבנים הקשורים; עם זאת, מיקרוסקופ multiphoton נדרשת תמונה הדגימה כי מיקרוסקופ קונפוקלי הרגיל לא יכול להגיע עמוק לתוך העוברים תקין (~ 1 מ"מ).
אנו מאמינים כי שיטות אלה שני נותן משלימים מידע על המבנה של הצומת, את הצלחת notochordal במהלך התפתחות נורמלי מוטציות שמראים פגמים על היווצרות מבנים אלה.

Gastrulation התנועות morphogenetic הנלווים הם חיוניים לעיצוב של העובר העכבר1. השינויים צורה התאית ובארגון במהלך מורפוגנזה להכתיב מידע לפי מיקום כדי לווסת את גורל ולאפשר גם המסלולים איתות שהתפתח לבצע בדיוק את הפונקציות שלהם כדי לגוון את שכבות הנבט שהוקם1. היווצרות של ארגון מבנים ארעיים איתות מרכזי כגון צומת ו מיתר הגב חיוני עבור הביצוע של תוכנית התפתחותית2. ביולוגים התפתחותיים השתמשו במגוון טכניקות כדי ללמוד את מורפוגנזה של מבנים אלה, הבולטים ביותר של אשר הוא השימוש של כתבים הסלולר, חיים שמחוץ הדמיה לעקוב אחר הדינמיקה בהתנהגות הסלולר, subcellular2 3, ,4. בדו ח זה, אנו מתמקדים המתארת את הפרטים של פרוטוקולים ממוטבת שלנו עבור שתי הטכניקות הללו: סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM) ואת כל הר immunofluorescence (WMIF), אשר היו ואינם אינסטרומנטלי עדיין לומד את מורפוגנזה של הצומת הצלחת notochordal, מבשר של מיתר הגב.
הצומת עובריים בעכבר זה בצורת דמעה כוס תאים הנמצא על פני השטח הגחון של העובר העכבר מסביב המוקדמות כדי שהאח קיפול הראש במהלך gastrulation, מורפוגנזה (יום עובריים, E7.5-E8)2,5, 6,7. הצלחת notochordal מורפולוגית נובע anteriorly צומת3. כל תא בצומת וצלחת notochordal מאופיינת ריסי אחת המגיחה החיצוני, שהוא ארוך בתאים צומת אך אורכו משתנה עם שלב התפתחותי2. הרוטציה של cilia בבור צומת הוכח להיות חשוב עבור מערכת אזעקה הקובע משמאל אסימטריה4. הצלחת notochordal הוא מבשר של מיתר הגב, המרכז איתות כי חשוב המתבנת של somites הסמוך ו- שפופרת פגמים בתעלה שמעליה3.
בשל התכונות של מיקום (פני השטח), צורה (כוס), אחזקת מבנים הסלולר החיצוני ברורים (cilia), SEM באופן מסורתי שימש כדי להמחיש את צומת ואת צלחת notochordal וללמוד שלהם צורה ומבנה2, 7. SEM משמש גם ללמוד את השינויים במבנה של הצומת עצמו או של cilia בתאי שלה במוטציות המשפיעות על gastrulation, מורפוגנזה, וכן cilia היווצרות8,9,10. SEM היא טכניקה אשר מנצל קרן אלקטרונים לחקור את ultrastructure טופולוגי של המשטח החיצוני של חומרים כגון דגימות ביולוגיות11ממוקד. המדגם היא בדרך כלל קבוע, מיובשים, ואז לרעוד. להוציא-מצופה מתכות להסתכלות במיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כפי שנתאר בשלב 1.
WMIF היא טכניקה מכתימים להמחיש מוצרים ג'ין, כגון חלבונים, שלוש-מימד (3D). WMIF של רקמות, איברים או אורגניזם שלם אפילו מספק מידע מרחבי על ההתפלגות של האות ושל צורת המבנה שנוצר ב- 3D. הטכניקה מבוססת על תיקון המדגם ואז מכתימה את זה עם conjugates פלורסנט. עכבר עוברי ~ E7.5 הם קטנים ולא שקוף ולכן אידיאלי עבור WMIF פרוטוקולים להמחיש את צומת ואת צלחת notochordal. לדוגמה, הפקטור שעתוק Barchyury (T) מתבטאת הגרעינים של הצומת וצלחת notochordal, ובמידה פחותה ב רצף פרימיטיבי, סביב E7.5-E8 ושל התפתחות נוגדנים עבודה טובה נגד טי מאת WMIF הן מבחינה מסחרית זמין ולהפוך את ההליך מכתימים אפשרי. התאים של הצומת וצלחת notochordal מאופיינים גם מכווץ משטחים הפסגה, אשר פנים בחוץ, ולכן יכול להיות מוכתם Phalloidin מצומדת פלורסצנטיות לסימון F-אקטין-הפסגה constrictions. באמצעות נוגדנים אלה כדוגמאות, השילוב של T ו- F-אקטין צביעת על-ידי WMIF מספק ייצוג של הצומת וצלחת notochordal תלת-ממד gastrulating עוברי העכבר כמו נדגים שלב 2 8. עם זאת, סמנים של cilia, כגון ARL13B או acetylated טובולין, כמו גם סמנים אחרים של הצומת וצלחת notochordal, כגון FOXA2, יכול לשמש גם כדי לבצע WMIF על פיתוח העכבר עוברי3,4.
אנחנו הראו כי striatin-אינטראקציה חלבון 1 (STRIP1) חיונית עבור gastrulation רגיל ומורפוגנזה העובר העכבר8. STRIP1 הוא רכיב ליבה של phosphatases striatin-אינטראקציה, קומפלקסים kinases (STRIPAK), אשר אנחנו ואחרים לסבך8,12הארגון שלד התא אקטין. פגם העיקריים העוברים מוטציה Strip1 הוא היווצרות והמזודרם צירית (צומת וצלחת notochordal) והסיומת של הציר גישה antero-אחוריים הגוף. השתמשנו SEM ו- WMIF כדי לנתח את צומת ואת צלחת notochordal פראי-סוג (WT), העוברים מוטציה Strip1 כפי שנראה נציג תוצאות , דמויות המתאימים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:843px;" width="842">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">1,1,1,3,3,3 Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td style="width:233px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:163px;">3840</td>
			<td style="width:161px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-T antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Critical Point Dryer</td>
			<td>Blazers Union</td>
			<td>CPD 020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4099,0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutardialdehyde solution 25%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1042390250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4974,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SEM coating unit PS3</td>
			<td>Agar Aids for Electron Microscopy</td>
			<td>PS3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SEM microscope Quantum FEG 250</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (FEI)</td>
			<td>Quantum FEG 250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence

העובר שלאחר ההשתלה העכבר עובר שינויי הצורה הגדולות לאחר אתחול של gastrulation, מורפוגנזה. סימן היכר של מורפוגנזה היא היווצרות של המארגנים ארעי, הצומת ואת צלחת notochordal, התאים עברו הרצף השלילי פרימיטיבי. היווצרות נאותה של מרכזים אלה איתות חיוני להתפתחות של התוכנית הגוף, טכניקות כדי להמחיש להם עניין גבוהה ביולוגים התפתחותיים העכבר. צומת וצלחת notochordal לשכב על המשטח הגחון של עוברי gastrulating העכבר מתחלקים היום (ה) 7.5 של פיתוח. הצומת הוא מבנה דמוי ספל אשר התאים בעלי של יחיד ודק ריסי בכל. נאות לוקליזציה subcellular והסיבוב של cilia בבור הצומת קובע אסימטריה משמאל לימין. התאים notochordal צלחת גם מחזיקים cilia יחיד אמנם קצר יותר מאשר אלה של התאים צומת. הצלחת notochordal יוצרת את מיתר הגב אשר משמש מארגן איתות חשוב עבור somitogenesis והמתבנת עצבית. כי התאים של הצומת וצלחת notochordal transiently נמצאים על פני השטח ושולט cilia, הם להיות visualized באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקה (SEM). בין טכניקות אחרות נהגו להמחיש את המבנים הללו ברמה התאית היא כל הר immunofluorescence (WMIF) באמצעות הנוגדנים נגד החלבונים מאוד הבאות לידי ביטוי צומת ואת צלחת notochordal. בדו ח זה, אנו מתארים שלנו פרוטוקולים ממוטבת כדי לבצע SEM ו- WMIF של הצומת וצלחת notochordal העוברים פיתוח העכבר כדי לסייע הערכה של רקמות הצורה והארגון הסלולר פראי-סוג, העוברים מוטציה gastrulation.

כדי לבחון את היווצרות הצומת של WT ו Strip1 עוברי מוטציה ב ~ E7.5, השתמשנו SEM כפי שמתואר בשלב 1 באיור איור 18. הפרטים ultrastructural של הטופולוגיה החיצוני באמצעות SEM היו די אינפורמטיבי, היה ברור כי בניגוד הצומת בצורת בור ב WT עוברי, העוברים המוטציות היה צומת שעברו שיטוח ולא סדירות. הגדלה גבוהה יותר של העוברים הראה את cilia אופיינית על תאים צומת זיהה אותם חד משמעית. הצפיפות נמוכה יותר לעין של cilia ב החשבונאי ייתכן המיוחס אובדן מבנה בור צומת, עקמומיות או מספר נמוך יותר של צומת תאים. הצלחת notochordal המופיע emanating מהצומת היה גם לא-סדירה העוברים מוטציה. הם היו לזיהוי עם cilia שלהם קצר יותר. לכן, SEM היה חשוב לחשוף את הליקויים מורפוגנזה צומת מוטציות Strip1 8. גם השתמשנו SEM במחקרים קודמים כדי להראות העדר cilia הצומת עובריים של מוטציות חסר centrioles, המספקים את התבנית cilia9.
ללמוד את והמזודרם צירית היווצרות פגמים Strip1 עוברי מוטציה ברמה התאית, השתמשנו WMIF כפי שמתואר בשלב 2, המוצגת באיור2. בעזרת טכניקה זו, הצומת ואת צלחת notochordal בקלות אותרו על ידי F-אקטין ו T מכתים. צומת WT ותאים צלחת notochordal יש לכודים תחומים הפסגה שבו הועשר F-אקטין, צביעת T הגרעין היה ברור. הצלחת notochordal מורחב rostrally ב WT אבל היה קצר, לא-סדירה החשבונאי. הנתונים הראו כי הארגון F-אקטין היא חריגה בשכבות נבט שונים של העוברים המוטציות כולל מפוח והמזודרם8. לפיכך, WMIF היה תפקיד חשוב ללמוד את הליקויים בצומת ו צלחת notochordal-צורה Strip1 עוברי מוטציה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58321/58321fig1.jpg"> איור 1 . מיקרוסקופ אלקטרונים סורק חושף את הליקויים בעבודת צומת מורפוגנזה ב Strip1 בעכבר מוטנט עוברי. (למעלה) SEM ניתוחים של WT ו Strip1 הגחוני מוטציה עובריים צמתים, צלחות notochordal (Noto)8. דוגמה של תמונת הגדלה נמוכה של העובר WT המוצג בצד השמאל. (למטה) הגדלה גבוהה יותר של מרכז הצמתים המוצג על גבי חושף את monocilia זמן מקרין התאים צומת. קדמי, נמצאת כל החלוניות. גודל ברים: 30 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58321/58321fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58321/58321fig2.jpg"> איור 2 . הר שלמה immunofluorescence מציג את צומת חריג וצלחת notochordal ברמה התאית עוברי מוטציה Strip1 . (למעלה) הגחון 3עיבוד (התוכנה Volocity) של WMIF על העוברים מוטציה WT ו Strip1 באמצעות שילוב של phalloidin מצומדת קרינה פלואורסצנטית (F-אקטין, אדום) ו- T מכתים נוגדנים (ירוק). (למטה) דוגמאות נוספות ההכתמה המוצגות לעיל התמקדות הצומת עם זום גבוה יותר, כולל דאפי. קדמי, נמצאת כל החלוניות. גודל ברים: 30 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58321/58321fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence at JoVE.com

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

להמחיש את צומת ואת צלחת Notochordal Gastrulating עוברי העכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כל הר Immunofluorescence

צומת וצלחת notochordal בארעיותם איתות המארגנים בפיתוח עוברי העכבר זה ניתן לאבחן באמצעות מספר טכניקות. כאן נתאר בפירוט כיצד לבצע את שתי הטכניקות כדי ללמוד את המבנה ואת מורפוגנזה: 1) סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM); ו- 2) כל הר immunofluorescence (WMIF).

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

הצומת ואת הצלחת notochordal הם מארגנים חיוניים במהלך התפתחות עוברית העכבר. כיום, נתאר שתי טכניקות המשמשות ביולוגים התפתחותיים כדי לדמיין וללמוד מבנים אלה. בפרוטוקול הראשון, נדגים כיצד לבצע סריקת מיקרוסקופיה אלקטרו, SEM ובשנייה, immunofluorescence הר שלם.הצומת והצלחת הנוטנורדית נמצאים באופן ארעי על פני השטח של העובר ביום העוברי E7.75, דגש על גירויים זעירים מקרינים מבחוץ, המאפשרים זיהוים והדמיה שלהם על ידי SEM. בשני הפרוטוקולים, נדגים צעדים קריטיים בטיפול בעוברים הקטנים יחסית של העכבר ו נתמקד כיצד להעביר ולתדרך אותם. כדי להתחיל, לפתוח את הבטן של עכבר בהריון המתת הריון דרך העור ואת mesenteries.באמצעות מספריים ומדפים עדין, להסיר את הרחם. שוטפים את הרחם לזמן קצר במים מזוקקים ומ מניחים אותו בצלחת פטרי קטנה המכילה PBS. לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ ניתוח ומטחנים עדין כדי להסיר את שרירי הרחם כדי לשחרר את decidui הפרט.מתחת למיקרוסקופ הניתוח, החזיקו כל דציבואה עם זוג מדפים ולהשתמש בזוג אחר כדי לבצע חתך אורך ועובי מלא בין החלק האדום לחלק הלבן. בצע ניקובים שטחיים אנכית לאורך החלק הלבן של decidua, רציף עם החתך. לאחר מכן, למשוך את decidua לגזרים אופקית לתוך שני חצאים בזהירות להסיר את העובר מהחלק הלבן של decidua.לאחר מכן, להעביר את העוברים לצלחת פטרי חדשה המכילה PBS מסונן סטרילי. הסר את הממברנה של רייכרט מכל עובר, החל בקון האקטו-פלסנטי. עבור genotyping בעתיד, להסיר חתיכה קטנה של שם החלמון.תחת מכסה המנוע הכימי, להעביר את העוברים לצינור microcentrifuge המכיל תיקון כיתה EM מורכב 2.5% glutaraldehyde ו PBS מסונן סטרילי. לאחר מכן, להסיר את fixitive מהצינור מבלי להפריע לעוברים. לשטוף את העוברים שלוש פעמים PBS סטרילי, מסונן במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.לייבש את העוברים בסדרת אתנול במשך חמש דקות כל אחד, באמצעות 50%70% ו 85% אתנול מדולל PBS. לשטוף שלוש פעמים ב100% אתנול. לאחסן עוברים ב 100% אתנול ב 20 מעלות צלזיוס, או להמשיך לשלב הבא.לאחר מכן, להעביר את embroyos לכלי מתאים ולהסיר את כל הנוזלים שנותרו. מוסיפים HMDS ואתנול ביחס של אחד לאחד לעוברים במשך 30 דקות. לאחר מכן, להסיר את הנוזל ולהוסיף HMDS טהור במשך 30 דקות.מוציאים את הנוזל מהעוברים עם פיפטה ומאפשרים להם להתייבש במשך 30 דקות. השתמש במברשת קטנה וקלטת דו צדדית כדי להרכיב את העוברים המיובשים על סטאפים SEM, עם הצדדים הגחון למעלה. הכנס את הדגמים למכונת ציפוי sputter עבור ציפוי חלקיקי זהב.אחד הצעדים העדינים ביותר בחלקיק SEM הוא הרכבה של העוברים בכיוון הנכון על גבי התותב. ברגע שהעובר נוחת על הקלטת, לא ניתן לשנות את האוריינטציה יותר. לאחר מכן, מניחים את הסנובים המצופים במיקרוסקופ SEM, מיישמים ואקום, ומתבוננים בצמתים העובריים ותאי הלוחות הנוטוריים עם ה- Cilia.לאחר הסרת העוברים ב E7.75, מניחים אותם PBS Tween בצלחת פטרי על קרח. מתחת למכסה המנוע הכימי, מעבירים את העוברים לצינור מיקרוצנטריפוגה המכיל פתרון מתקן. לאחר מכן, להסיר את התיקון מן הצינור, דואג לא לגעת בעוברים.לאחר מכן, לשטוף את העוברים שלוש פעמים PBS המכיל 0.2% טריטון X-100 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר אגוזי. הסר את הכביסה האחרונה מן העוברים ולהוסיף פתרון חסימה המכיל PBS טריטון, עם 10% חום סרום מושבת. חוסמים את העוברים לפחות שעתיים על מטור ב-4 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, להסיר את החסימה ולהוסיף כמיליליטר של נוגדן ראשוני מדולל בתתכנון חסימה. להתבגר העוברים לילה על מטור ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את הנוגדן העיקרי ולשמור אותו לשימוש מאוחר יותר.לאחר מכן, לשטוף את העוברים עם PBS טריטון פעמיים. ולשטוף אותם שלוש פעמים במשך 30 דקות על מטורף. החלף את הכביסה בנוגדן המשני המדולל נגד המין המארח העיקרי של הנוגדנים.וחגירה לילה על אגוז בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להסיר את הנוגדן המשני ולשטוף את העוברים עם PBS טריטון פעמיים. לפני כביסה שלוש פעמים במשך 30 דקות עם PBS טריטון.החלף את הכביסה האחרונה עם PBS טריטון המכיל פלודין מדולל מצומד ו DAPI מדולל וכתם במשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף את העוברים פעמיים ב PBS טריטון. ולשטוף אותם עם PBS טריטון במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, להחליף את טריטון PBS עם PBS ולהשאיר את העוברים על קרח. לאחר מכן הכינו שקופיות נקיות, טעונות באופן חיובי, תלושי כיסוי ומדיית הרכבה מיקווית המבוססת על גליצרול. מניחים שתי חתיכות של קלטת ברורה 15 מילימטרים זה מזה על השקופית.לאחר מכן, תחת המיקרוסקופ המפעל, השתמש בפיפלט P200 שונה כדי להעביר עובר לשקופית. באמצעות מלקחיים עדין, לעשות שני חתכים מלאים על הצדדים הצדדיים של שם החלמון כדי לפתוח את העובר. לאחר מכן, למקם את העובר עם הצד הגחון למעלה.הוסף 50 מיקרוליטרים של מדיה הרכבה לעובר. לאחר מכן, הוסף dab של מדיה הרכבה לתק השער. מניחים אותו על שתי חתיכות של סרט הדבקה, ולהוריד אותו לאט על העוברים באמצעות מחט כפופה.השתמש במגבון סופג כדי להסיר מדיית הרכבה עודפת, תוך כדי דאגה לא להזיז את פתק הכיסוי. לאחר מכן, השתמש בכמות נדיבה של לק כדי לאטום את הצדדים של להחליק את הכיסוי. לבסוף, השתמש במיקרוסקופ קונפוקל סריקה כדי להתבונן בעוברים.זה קריטי לא להזיז את החלק הכיסוי לאחר הרכבה אותו על העוברים, כי זה יכול לעוות אותם עבור הדמיה 3D. באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה, היווצרות הצומת בסוג פראי ולהפשיט עוברי עכבר מוטנט אחד ב E7.75 נצפתה. שלא כמו הצומת בצורת בור בסוג הבר, העוברים המוטנטים הציגו צומת שטוח וצומת רגיל וצלחת nodalcordal.שלם עכשיו כדי immunofluorescence שימש כדי ללמוד את הצומת ואת פגמים היווצרות לוח notochordal ברצועה 1 עוברים מוטנטים ברמה התאית. הנתונים הראו שהם היו חריגים ופעלו בעוברים המוטנטים. הצומת וצלחת הנודלקורטלית נמצאים רק באופן חולף על פני השטח של העובר, ולכן התזמון חיוני להצלחת SEM.לדוגמה, שניים עד ארבעה עוברים somite טובים לניתוח SEM של צומת בוגר עם ריסים ארוכים. Reagents טוהר הוא גם חיוני להצלחת טכניקות אלה, במיוחד בחיקור אולטרה מבנה על ידי SEM. זיהומים זעירים כי מקל על העובר בדרך כלל לגרום חפצים ענקיים.אנו מאמינים כי שתי טכניקות אלה לתת מידע משלים על המבנה של הצומת ואת הלוח nodalcortal במהלך התפתחות נורמלית מוטציות להראות פגמים בהיווצרות של מבנים אלה.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

הדמיה ניגודיות בעכבר עוברים באמצעות תדר גבוהים אולטראסאונד

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy Nanotomy of Healthy and Injured Zebrafish Brain

סריקה הילוכים בקנה מידה גדול מיקרוסקופית אלקטרונים (Nanotomy) של בריאה ונפצעו דג הזברה המוח

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution electron microscopy. Others and we previously ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

רב-יעד Chromogenic כל הר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה להשוואת תחומים ביטוי גנים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

שיטות לבדיקת בלוטת לימפה hemocytes ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

תרבות איברים שלמים הר Immunofluorescence מכתים של עכבר Wolffian צינוריות

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

להמחיש Multiciliated בתאים דג זברה באמצעות פרוטוקול משולב של פלורסנט הר שלמה בחיי עיר הכלאה, Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

ניתוח כמותי Immunofluorescence כולה-הר של אוכלוסיות לב ב העכבר עוברי

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

הדמיה הירארכי עם מודאלים מרובים סעיפים טורי למציאת מטרות תאיות ספציפיים בתוך כמויות גדולות

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Immunofluorescence הר שלמה, זקיק כימות של השחלות תרבותי. העכבר

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

ניתוח התפתחות קאמרית הלב במהלך מופרה העכבר באמצעות כל הר Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...