Name: visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence
Uploaded: 2018-11-06T13:30:00
Duration: 9 min 36 s
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ヘモグロビンは、医学部とケルン大学の SFB829 からスタートアップの資金によってサポートされます。DFG によってサポートされて C.X. BA 5810/1-1 を与えます。CECAD 研究センター、メモリアルスローンケタ リングがんセンター (ニューヨーク、米国) のイメージング施設に感謝したいと思います。ホアキン グレゴ ベッサ (スペイン国立マドリッド、スペイン心血管研究センター) は、WMIF の胚を取り付けに関する彼の洞察力を感謝いたします。

動物実験を含むすべての実験は、北ライン ヴェストファーレン (NRW-LANUV) に責任がある権限によって承認されました。
1. マウス胚ノードの電子顕微鏡
<ol><li>妊娠中の雌マウスを犠牲 ~ 頚部転位によって E7.5 (2-4 体節期)。手順 1.1 - の図と詳細な説明 1.7 マウス胚研究室マニュアル13で利用可能です。</li>
	<li>皮膚と mesenteries を介して腹部を開け、はさみおよび微細鉗子を使用して子宮を取り外します。</li>
	<li>蒸留水で簡単に子宮をすすぎ、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 を含む小さなきれいなペトリ皿 (6 cm) に置きます。</li>
	<li>解剖顕微鏡、微細鉗子を使用して、[には、無料個別 deciduae または着床する子宮の筋肉を削除します。</li>
	<li>1 組の鉗子で各脱落膜を押し、他のペアを使用して、赤い部分 (将来胎盤) と白い部分 (胚が配置されて) の間縦全層切開を行います。脱落膜の白い部分に沿って垂直方向に表面の穿孔は切開と連続してください。脱落膜を 2 つの半分に水平方向に離れて引っ張るし、慎重に両名の白い部分で胎児をかき出します。</li>
	<li>新鮮な無菌ろ過 PBS で新しいペトリ皿 (35 mm) に胚を転送します。すべての deciduae/胚に対して繰り返します。</li>
	<li>ライヘルトの膜を削除、胚を巻き込む比較的不透明な膜、いじめによってそれぞれの胚からそれまで好きで胎盤円錐 (赤味がかった注入サイト) から始まる靴下。ジェノタイピング、小さな作品を取る (〜 0.1 mm2) この段階での卵黄嚢の。</li>
	<li>化学フードと適切な保護 (手袋) を着て、室温で遠心 (1.5 mL) チューブ フィルター滅菌 PBS で 2.5% グルタルアルデヒドで構成される EM グレード定着剤に胚を転送します。4 ° C で一晩胚を修正します。</li>
	<li>慎重にチューブから胚を触れることがなくグルタルアルデヒド固定液を削除し、適切な廃棄容器に捨てます。胚を 3 回洗浄滅菌フィルターの pbs は、室温で 15 分間。</li>
	<li>5 分間エタノール シリーズで胚を脱水: 50%、70%、85%、100% または無水エタノールで 3 回。エタノールに − 20 ° C で胚を格納したり、次のステップに進みます。</li>
	<li>臨界点の臨界点乾燥機 (CPD) を乾燥のためのバスケットにエタノールで胚を転送します。バスケットを完全にカバーするエタノールで部屋を埋めます。</li>
	<li>慎重に 10 ° C で 10 倍の液体 CO2でフラッシュすることにより、エタノールを交換します。商工会議所が半分になるまで、最後のステップ後液体 CO2を切る。40 ° C を熱圧力 80 バー (臨界点) に達すると、液体 CO2ガスに変わるまで。10 分間待ってから、ゆっくりと約 45 分以上のガスを吹き飛ばします。</li>
	<li>乾燥の CPD に簡単に代わりに、30 分のためのエタノールの胚を 1:1 の比率でヘキサメチルジシラザン (HMDS) を追加します。30 分削除の純粋な HMD にピペットを使用して液体のうち胚の胚を転送し、30 分間乾燥するままにします。 注: 両方の乾燥方法は均等に働いても私たちの手で。</li>
	<li>両面テープの SEM スタブを乾燥胚腹側 (ノード) でマウントするのに細かいブラシを使用します。</li>
	<li>長く細い繊毛を充電するため好まれる金粒子コーティング スパッタ コーティング マシンに胚とスタブを挿入します。120-150 の層を適用する Å;時間は各サンプルに異なります電流に依存しています。</li>
	<li>SEM 顕微鏡に胚とコーティングされたスタブを配置、真空を適用し、萌芽期ノードと倍率 1000 倍から 15 に至るまでに繊毛を持つ脊索細胞観察 000 X。</li>
</ol>2. 全体のマウント蛍光マウス ノードと脊索板の
<ol><li>0.05% で氷冷 PBS を使用してトゥイーン 20 (PBSTw) は、E7.75 で胚を削除し、PBSTw で 35 mm シャーレ氷の上に置いて 1.1 1.7 上記手順に従います。</li>
	<li>化学のフードと適切な保護 (手袋) を着て、下の微量遠心チューブに PBS で 4% パラホルムアルデヒド固定液に胚を転送します。4 ° C で一晩胚を修正します。</li>
	<li>慎重にチューブから胚を触れることがなくパラホルムアルデヒド固定液を削除し、適切な廃棄容器に捨てます。0.2% を含む PBS で胚を 3 回洗浄トリトン X-100 (PBSTr) 室温で 5 分間。ならびにシェーカーにすべての洗浄およびインキュベーション、次の手順を実行します。</li>
	<li>最後の洗浄を削除し、(二次抗体のホスト種) から 10% 熱非動化血清ブロッキング溶液 PBSTr を追加します。2 h からブロックに一晩 (以上) の 4 ° C で nutator</li>
	<li>ブロックを削除し、追加 〜 1 mL ソリューション 1: 500 希釈でたとえば抗体抗 T ブロックで希釈した一次抗体の。4 ° C で nutator の一夜 (またはそれ以上) を孵化させなさい</li>
	<li>一次抗体を削除し、0.02% (20% 株式抗体溶液の 1 mL を 1 μ L) の最終的な集中にアジ化ナトリウムを追加して後で使用のために保存します。抗体は再利用できる ~ 10 回。PBSTr で 2 回胚を洗い、4 ° C で nutator に各 30 分の 3 回洗い、そして</li>
	<li>洗浄を置き換えますで希釈した一次抗体のホスト種に対して、蛍光標識二次抗体 ~ 1: 1000 オーバー ナイト (以上) 4 ° C で nutator に</li>
	<li>二次抗体を削除し、PBSTr、そして PBSTr で 30 分間、3 回洗浄で二回リンスします。</li>
	<li>最後の洗浄を室温で 1 時間の核を染色する F-アクチンと 1: 1000、DAPI 染色する 1: 500 蛍光標識ファロイジンを含む PBSTr に置き換えます。</li>
	<li>PBSTr で二度洗い、室温で 30 分間 PBSTr で 1 回洗浄します。</li>
	<li>PBS の PBSTr を交換し、氷に胚を残します。水グリセリン ベース土台メディア、たとえば、1xPBS で 90% のグリセロール、胚をマウントするための antifade 試薬と coverslips (24 × 24 mm) きれいな正荷電のスライド (60 × 24 mm) を準備します。</li>
	<li>距離で明確なテープの 2 つの部分を入れて 〜 15 mm スライドの明確な部分でお互いから。これは、胚を平坦化、それらを完全につぶしになります (Z 軸) の十分の 3 D 空間が作成されます。</li>
	<li>解剖顕微鏡の下で慎重にスライドする (転送して破損していない胎児に十分なスペースを許可する) にカット P200 ピペットを用いた胚に移動します。</li>
	<li>微細鉗子を使用して、胚を展開する卵黄嚢の横側に 2 つの完全カットを作る。(スライド上を神経管の背側)を腹側 (ノードと脊索板) を持つ胚を配置します。</li>
	<li>胚にメディアをマウントの 50 μ L を追加します。スライドあたり 4-5 胚を配置します。まずタッチ スライド (上部または下部側)、テープの 2 つの部分をまたぐ配置し空気泡を作成を回避しながら微細鉗子または曲がった細い針を用いた胚の上にゆっくりと下ろします、coverslip の側にメディアのマウントを塗りを追加します。</li>
	<li>吸収のワイプを使用して余分なマウント メディアをクリーニングします。プロセスで、coverslip を移動しないように注意してください。</li>
	<li>マニキュアの寛大な量を使用して、それを移動することがなく、coverslip の側面をシールします。</li>
	<li>走査型共焦点顕微鏡の下で観察します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rivera-P&#233;rez, J. A., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+morphogenesis+in+the+early+mouse+embryo.">The dynamics of morphogenesis in the early mouse embryo.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2015).</li><li>Lee, J. D., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+node+and+notochord:+The+cellular+basis+for+the+establishment+and+maintenance+of+left-right+asymmetry+in+the+mouse.">Morphogenesis of the node and notochord: The cellular basis for the establishment and maintenance of left-right asymmetry in the mouse.</a> Developmental Dynamics. 237 (12), 3464-3476 (2008).</li><li>Balmer, S., Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. 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著者が明らかに何もありません。

今回、マウス胚ノードと脊索板を視覚化する SEM および WMIF を実行する方法を示します。Gastrulating マウス胚の小型 ~ E7.5 と表面にこれらの構造の存在は、それらが技術説明2,7、8を使用して研究に最適。T と繊毛のマーカーなどの良い抗体の可用性は、構造、組織、これらの本質的な萌芽期主催者8の形成 WMIF を使用して優れた 3 D 情報を与えます。
マウス萌芽期の開発の非常に急速なペースで進行、ノードと脊索板のみ一過性胚の表面に存在して、のでタイミングはこれらの実験2,3の成功に不可欠。たとえば、2-4 体節胚は長い線毛を成熟したノード ピットの SEM 解析に適しています。はるか以前またはそれ以降の胚 (たとえば、12 h の前に、または後) には、ノードを表面上に存在できない場合があります。WMIF はこの点でもう少し柔軟、構造自体は、開発時にも一時的なタイミングは、ここでは研究者の興味に依存します。
試薬の純度はまたこれらの技術の成功に不可欠特に胚に固執する通常 SEM. 小さな不純物による微細構造を調査結果、巨大なアーティファクト。
SEM の 1 つの胚の固定の 2 つの異なる方法をテストしている 1x PBS で半分 Karnovsky の定着剤 (2.5% グルタルアルデヒド、2% パラホルムアルデヒドと 0.1 M cacodylate バッファー) と単純な 2.5% グルタルアルデヒドを使用します。グルタルアルデヒドと PBS 定着剤手順 1 で説明されているように使うことが望ましい、ただし、我々 と他の人も使用して半分 Karnovsky の定着剤正常に SEM のため
また臨界点乾燥機または HMD のステップ 1 に記載されてを使用して、サンプルの質に差が見られなかったし14は別途報告し SEM のための胚を乾燥の 2 つの方法を比較しました。
我々 は 1% 低融点アガロースの最終的な洗浄ステップが 35 mm ガラス底皿の上にマウントされた後に胚を埋め込むと、それからそれをトッピング テスト ステップ 2 〜 10 μ L のメディアをマウント。この埋め込みメソッドが動作し、胚の元の 3 D 構造と関連付けられた構造を保持ただし、多光子顕微鏡は通常共焦点顕微鏡はそのまま胚に深く達することができないので、供試体をイメージする必要 (~ 1 mm)。
これらの 2 つの手法を使用してノードと脊索のプレートの構造正常な開発の間に、これらの構造の形成に欠陥を示す突然変異体の相補的な情報を与えることと考えています。

原腸陥入とそれに伴う形態形成運動マウス胚1を形成するために重要です。細胞の形状と形態形成における組織の変化は、細胞の運命を調節し、また正確に新たに形成された胚芽層1を多様化する彼らの機能を実行するその後のシグナル伝達経路を許可に位置情報を指示します。発達プログラム2の実行は一時的な構造を整理してシグナル センター ノードと脊索などの形成が欠かせません。発達生物学者はこれらの構造は、携帯電話の記者とライブ前のヴィヴォ細胞および細胞レベル下の動作2 のダイナミクスに従うイメージングの使用であるの最も顕著な形態形成を研究するのにさまざまなテクニックを使用しています。 ,3,4。このレポートは、最適化されたプロトコルの詳細を説明するこれらの技術の 2 つの焦点: 走査電子顕微鏡 (SEM) と全台紙蛍光 (WMIF) が、まだノードの形態形成の研究に尽力脊索板、脊索の前駆体。
マウス胚ノードは原腸陥入と形態形成 (萌芽期日、E7.5 E8) 中後期ヘッド倍上旬頃マウス胚の腹側表面にある細胞のティア ドロップ型のカップ2,5、 6,7。脊索板形態学的ノード3から前方は生まれない。ノードと脊索板内の各セルは、節細胞で、長いが、長さが異なる発達段階2外に突き出ている単一の繊毛によって特徴付けられます。ノードのピットで繊毛の回転は、左右非対称性4を決定するシグナリングのために重要であると示されています。脊索板脊索、隣接する体節と覆っている神経管3のパターンの重要なシグナリング センターの前駆体であります。
場所 (表面)、形状 (カップ) と異なる外側の細胞構造 (繊毛) 所有している属性のため SEM 伝統的に使用されているノードと脊索板を視覚化し、研究の形成と構造の2,7. SEM、ノード自体またはその繊毛形成8,9,10と同様、原腸陥入、形態形成に影響を与える突然変異細胞の繊毛の構造の変化を分析する使用もします。SEM は、生体試料11等の外面のトポロジカルな微細構造を調査する電子の集束ビームを利用する手法です。サンプルは通常固定、乾燥し、スパッタ - 金属被覆走査型電子顕微鏡下で観察のステップ 1 で説明するよう。
WMIF は、3 次元 (3 D) でタンパク質などの遺伝子産物を視覚化する染色法です。組織や臓器全体の生物の WMIF は、3 D で得られた構造の形状と信号の分布に関する空間情報を提供します。技術は、蛍光の抱合体と染色サンプルの修正に基づいています。マウス胎 〜 E7.5 は小さいと透明な WMIF プロトコル ノードと脊索板を視覚化するための理想的な。たとえば、Barchyury (T) がノードと脊索板と胚の発育の良い作業抗体 WMIF T E7.5 E8 の周りの原始線条の程度の核で発現は転写因子は、市販利用可能な汚損プロシージャを可能にして。ノードや脊索板の細胞も、外側に直面し、こうして、根尖狭窄部でマーク F アクチンを蛍光標識ファロイジンと汚されることができる収縮頂端表面によって特徴付けられます。T と F アクチンの WMIF による染色の組み合わせ例としてこれらの試薬を使用して、ノードおよび 3 D gastrulating マウス胚における脊索板の表現ステップ 2 8で説明とを提供します。ただし、ノードと脊索板など FOXA2 の他の印と同様、ARL13B またはアセチル化チューブリンなどの繊毛のマーカーは成長マウス胚3,4で WMIF を実行するも使用できます。
私たちは striatin と相互作用する蛋白質 1 (STRIP1) は通常原腸陥入と8マウス胚の形態形成に不可欠なことを示しています。STRIP1 は striatin と相互作用するホスファターゼと私たちと他の人がアクチン細胞骨格組織8,12に関与するキナーゼ複合体 (STRIPAK) のコア コンポーネントです。Strip1変異胚の主要な欠陥は、(ノードと脊索板) 軸中胚葉の形成と前後の体軸の延長です。代表結果と対応する図に示すようにノードおよび野生型 (WT) とStrip1変異胚における脊索板を分析する SEM と WMIF を使いました。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:843px;" width="842">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">1,1,1,3,3,3 Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td style="width:233px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:163px;">3840</td>
			<td style="width:161px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-T antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Critical Point Dryer</td>
			<td>Blazers Union</td>
			<td>CPD 020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4099,0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutardialdehyde solution 25%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1042390250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4974,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SEM coating unit PS3</td>
			<td>Agar Aids for Electron Microscopy</td>
			<td>PS3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SEM microscope Quantum FEG 250</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (FEI)</td>
			<td>Quantum FEG 250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

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マウスの着床後胚原腸陥入と形態形成の開始後主要な形状変化を経る。形態形成の特徴一時的な主催者は、ノードおよび原始線条を通過した細胞から、脊索板の形成であります。これらのシグナリング センターの適切な形成はボディ計画の開発に不可欠なそれらを可視化する技術がマウス発達生物学者に関心の高い。ノードと脊索板日 (E) 7.5 開発の周りの gastrulating のマウス胚の腹側表面にうそをつきます。ノードは、そのセルを所有、単一細長い繊毛各カップの形の構造です。適切な細胞内局在とノード ピットで繊毛の回転、左右非対称性を決定します。ノード細胞のそれらより短いとはいえ、脊索板セルは、また孤立線毛を所有しています。脊索板とニューラル パターンの重要なシグナリング主催者として機能する脊索を形成します。ノードや脊索板の細胞一過性の表面にある繊毛を持っているので、彼らは走査型電子顕微鏡 (SEM) を使用して視覚化できます。などのテクニックを使用して視覚化する細胞レベルでこれらの構造はノードと脊索板で高発現している蛋白に対する抗体を用いた全台紙蛍光 (WMIF) です。本報告では、マウス胚組織形状と野生型の細胞組織の評価のために、突然変異体の胚の原腸陥入の SEM およびノードと脊索板の WMIF を実行する私たちの最適化されたプロトコルについて述べる。

WT とStrip1変異胚内のノードの形成を調べるために 〜 E7.5、ステップ 1 に記載されていると図 18に示すように SEM を使いました。SEM を使用して外部のトポロジの微細構造の詳細が非常に有益と WT 胚のピット状ノードとは異なり変異体の胚が平坦化され、不規則なノードはすぐに明らかだった。胚の高倍率は、それらを明確に識別されるノード細胞の特性の繊毛を示した。突然変異体の繊毛の明白な低密度は、ノード ピット構造および曲率またはノード細胞の数を減らすの損失に起因する可能性があります。ノードから発せられる表れる脊索板も突然変異体の胚に定期的だった。彼らは彼らの短い繊毛を特定しました。したがって、SEM はStrip1変異体8ノード形態の欠陥を明らかにすることが重要だった。また使いました SEM 従来繊毛9のテンプレートを提供する由来を欠いていた突然変異体の胚のノードに繊毛の不在を表示します。
細胞レベルでStrip1変異胚軸中胚葉形成欠陥を調査するには、手順 2 に記載されている、図 2に示すように WMIF を使用しました。この手法を使用して、ノードと脊索板が簡単に識別 F アクチンと T 染色により。WT ノードと脊索細胞が収縮する F アクチンが濃縮された、明らかにされた T 染色性が核アピカル ドメイン。脊索板、WT に吻方に延長が短く、不規則な突然変異体に。データは、F-アクチン組織が変異胚軸中胚葉8などのさまざまな細菌層の異常を示した。したがって、WMIF は、ノードの欠陥とStrip1変異胚における脊索板形成に関する研究に尽力しました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58321/58321fig1.jpg"> 図 1.Strip1変異マウス胚におけるノードの形態形成における欠陥を明らかにする走査電子顕微鏡観察します。(Top)WT とStrip1変異腹壁胚ノードと脊索板 (能登)8の SEM 解析。WT 胚の低倍率画像の例は、左側に表示されます。(下)上節細胞から突出して長い monocilia を明らかに示すようなノードの中心の高倍率。前方は、すべてのパネルを。スケール バー: 30 μ m.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58321/58321fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58321/58321fig2.jpg"> 図 2.全台紙蛍光Strip1変異胚の異常なノードと細胞レベルで脊索のプレートを示しています。(Top)腹側の 3 D レンダリング (ソフトウェア Volocity) WMIF WT とStrip1変異胚蛍光標識ファロイジン (F アクチン、赤) と T (グリーン) 抗体染色の組み合わせを使用して。(下)染色以上のズームを持つノードに焦点を当て、DAPI を含む上記のより多くの例。前方は、すべてのパネルを。スケール バー: 30 μ m.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58321/58321fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

ノードと走査型電子顕微鏡と蛍光抗体法マウント全体を使用して Gastrulating のマウス胚における脊索板を可視化

いくつかのテクニックを使用して視覚化することができますマウス初期胚のオーガナイザーをシグナリング過渡では脊索板とノードです。ここでは、我々 は詳細にその構造と形態形成を研究する技術の 2 つを行う方法をについて説明: 1) 走査電子顕微鏡 (SEM);2) 全台紙蛍光 (WMIF)。

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

ノードと脊索プレートは、マウス胚発生時に不可欠なオーガナイザーです。今日、我々は、これらの構造を可視化し、研究するために、発達生物学者によって使用される2つの技術を説明する。第1のプロトコルでは、走査型電気顕微鏡、SEM、第2のマウント免疫蛍光全体の方法を示します。ノードと脊索板は、胚の日E7.75で胚の表面に一時的に存在し、強調小さな繊毛が外部に投影され、SEMによる同定と視覚化が可能になる。どちらのプロトコルでも、比較的小さなマウス胚を処理する上で重要なステップを示し、それらを転送してルーティングする方法に焦点を当てます。まず、安楽死させた妊娠マウスの腹部を皮膚と腸間腸を通して開く。はさみと細かい鉗子を使って、子宮を取り除きます。蒸留水で子宮を短時間洗い流し、PBSを含む小さなシャーレに入れます。その後、解剖顕微鏡と細かい鉗子を使用して子宮筋を取り除き、個々のデシドゥイを解放する。解剖顕微鏡の下で、各デシドゥアを鉗子で保持し、別のペアを使用して、赤い部分と白い部分の間に縦方向の完全な厚さの切開を行います。デシドゥアの白い部分に沿って垂直に表面的なパーホレーションを行い、切開に隣接します。次に、デシドゥアを水平に2つの半分に引き離し、デシドゥアの白い部分から慎重に胚を取り除きます。この後、胚を滅菌濾過PBSを含む新しいシャーレに移す。各胚から、外胎盤コーンから始まるReichertの膜を取り除きます。将来のジェノタイピングのために、黄身嚢の小片を取り除きます。化学フードの下で、2.5%グルタルアルデヒドと無菌濾過PBSで構成されるEMグレードの固定を含むマイクロ遠心分離チューブに胚を移します。この後、胚を邪魔することなくチューブから固定を取り除きます。胚を無菌で3回洗浄し、室温で15分間PBSを濾過した。胚をエタノール系列でそれぞれ5分間脱水し、50%70%および85%エタノールをPBSで希釈した。100%エタノールで3回洗浄する。胚を摂氏20度で100%エタノールに保存するか、次のステップに進みます。その後、適切な容器にエンブロヨを移し、残った液体を取り除きます。HMDSとエタノールを胚に対して1対1の割合で30分間加えます。その後、液体を取り出し、30分間純粋なHMDSを加えます。ピペットで胚から液体を取り出し、30分間乾燥させます。小さなブラシと両面テープを使用して、腹側を上にして乾燥した胚をSEMスタブに取り付けます。金粒子コーティング用のスパッタコーティングマシンにスタブを挿入します。SEM粒子の中で最も繊細なステップの1つは、胚をスタブに正しい向きに取り付けることです。胚がテープに着陸すると、向きはもはや変更できません。この後、コーティングされたスタブをSEM顕微鏡に入れ、真空を適用し、繊毛で胚節および脊索板細胞を観察する。E7.75で胚を取り除いた後、氷の上のシャーレでPBSトゥイーンに入れます。化学フードの下で、固定溶液を含むマイクロ遠心分離管に胚を移す。この後、胚に触れないように気をつけて、チューブから固定剤を取り出します。次いで、0.2%トリトンX-100を含むPBSで、エナチングシェーカーで室温で5分間、胚を3回洗浄する。胚から最後の洗浄を取り除き、PBSトリトンを含むブロッキング溶液を10%熱不活化血清で追加します。摂氏4度のヌテレーターで少なくとも2時間胚をブロックする。次に、ブロッキングを除去し、ブロッキング溶液中で希釈した一次抗体の約1ミリリットルを添加する。胚を摂氏4度のヌテーターで一晩インキュベートする。一次抗体を取り除き、後で使用するために保存します。次に、PBSトリトンで胚を2回リンスします。そして、ヌテットターで30分間3回洗います。洗浄を、一次抗体宿主種に対する希釈された蛍光結合二次抗体と交換してください。そして、摂氏4度のヌテーターで一晩インキュベートします。次いで、二次抗体を除去し、PBSトリトンで胚を2回リンスする。PBSトリトンで30分間3回洗浄する前に。最後の洗浄を、希釈された蛍光結合ファロイジンと希釈されたDAPIと汚れを室温で1時間含むPBSトリトンに置き換えます。次に、PBSトリトンで胚を2回リンスする。そして、室温で30分間PBSトリトンでそれらを洗います。この後、PBSトリトンをPBSに置き換え、胚を氷の上に置き換えます。次に、清潔で正に帯電したスライド、カバースリップ、およびグリセロール水溶液ベースの取り付け媒体を準備します。スライド上に2枚の透明テープを15ミリメートル離して置きます。次いで、解剖顕微鏡の下で、改変されたP200ピペットを使用して、胚をスライドに移動させる。細かい鉗子を使用して、卵黄嚢の側面に2つの完全なカットを行い、胚を展開します。次に、腹側を上にして胚を配置します。50マイクロリットルの取り付け培地を胚に加えます。次に、取り付け用メディアのダブをカバースリップに追加します。テープの2つの部分にまたがるそれを置き、曲がった針を使用して胚の上にゆっくりとそれを下げます。吸収性ワイプを使用して、カバースリップを移動しないように、余分な取り付けメディアを取り除きます。次に、カバースリップの側面を密封するためにマニキュアの寛大な量を使用します。最後に、走査型共焦点顕微鏡を用いて胚を観察する。3Dビジュアライゼーションのためにカバースリップを歪める可能性があるため、胚の上に取り付けた後にカバースリップを移動しないことが重要です。走査型電子顕微鏡を用いて、E7.75で1つの変異型マウス胚を取り除いた野生型およびストリップにおける節点の形成が観察された。野生型のピット状の節とは異なり、突然変異胚は平坦化された通常の節と節状のプレートを示した。現在、免疫蛍光に対する全体が、細胞レベルでのストリップ1変異胚におけるノードおよび脊索板形成欠陥を研究するために使用された。データは、彼らが異常であり、突然変異胚でスタントされていることを示した。ノードと節皮質プレートは、胚の表面に一時的にしか存在しないため、SEMの成功にはタイミングが不可欠です。例えば、2~4個のスマイト胚は、長い繊毛を有する成熟した節のSEM分析に適している。純度試薬は、これらの技術の成功のためにも不可欠であり、特に胚に固執する小さな不純物が通常巨大なアーティファクトをもたらすSEMによって超構造を調査する際に不可欠である。我々は、これら2つの技術が、正常な発達中の節および結節板の構造およびこれらの構造の形成における欠陥を示す変異体に関する補完的な情報を与える、と考えている。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

高周波超音波を用いて、マウス胚におけるコントラストイメージング

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) of Healthy and Injured Zebrafish Brain

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健康と負傷ゼブラフィッシュ脳の大規模な走査型透過電子顕微鏡（Nanotomy）

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution electron microscopy. Others and we previously ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

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マルチターゲット発色ホールマウント<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーションにおける遺伝子発現のドメインを比較します<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

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リンパ腺や血球中を調べるための方法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

器官培養とマウスウォルフダクトの全マウント免疫蛍光染色

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

全体のマウント蛍光In Situハイブリダイゼーション、免疫組織の結合されたプロトコルを介してゼブラフィッシュにおける Multiciliated の細胞を可視化します。

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

マウス胚における心臓前駆細胞集団の定量的ホール マウント免疫染色解析

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

大ボリューム内の特定の細胞内標的を見つけるため連続切片的階層構造イメージング

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

全体のマウントの蛍光抗体法と培養マウス卵巣の卵胞の定量化

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

落射蛍光マウント全体を用いたマウス胚発生中に心臓商工会議所発展の分析

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...