Name: visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence
Uploaded: 2018-11-06T13:30:00
Duration: 9 min 36 s
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Hb 인지 의료 교수진 및 쾰른 대학교의 SFB829에서 시작 자금에 의해 지원 됩니다. C.X.은 DFG 지원 바 5810/1-1을 부여. 우리는 CECAD 연구 센터와 기념 슬로 안 Kettering 암 센터 (뉴욕, 미국) 이미징 시설 감사 하 고 싶습니다. WMIF에 대 한 배아를 장착 하는에 그의 통찰력에 감사 호아킨 Grego Bessa (스페인어 국립 센터 심장 혈관 연구, 마드리드, 스페인) 하 고.

모든 실험 동물 실험 관련 북 라인 베스트팔렌 (NRW LANUV)에 책임 있는 권위에 의해 승인 되었다.
1. 마우스 배아 노드 스캐닝 전자 현미경 검사 법
<ol><li>희생에서 임신 여성 마우스 ~ 자 궁 경부 전위에 의해 E7.5 (somite 단계 2-4). 대 한 자세한 설명은 다이어그램 단계 1.1-1.7 마우스 배아 실험실 설명서13에서 제공 됩니다.</li>
	<li>피부와 mesenteries를 통해 복 부를 열고 위와 미세 집게를 사용 하 여 자 궁을 제거 합니다.</li>
	<li>증류수에 간단히 자 궁을 헹 구 고 그것 작은 깨끗 한 페 트리 접시 (6 cm) 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1.</li>
	<li>해 부 현미경 및 미세 집게를 사용 하 여, 개별 deciduae 또는 이식 사이트 무료 자 궁 근육을 제거 합니다.</li>
	<li>한 쌍의 집게와 각 decidua 누른 다른 쌍을 사용 하 여 빨간 부분 (미래 태) 사이의 흰 부분 (태아가 위치한) 경도 전체 두께 절 개를 하 게. 표면 구멍에 decidua의 흰색 부분을 따라 수직으로 절 개 된 연속 확인 합니다. 두 개의 반쪽으로는 decidua 떨어져 가로 당겨 하 고 신중 하 게 푸는 decidua의 흰 부분에 배아 다.</li>
	<li>새로운 페 트리 접시 (35mm) 신선한 살 균 필터링 PBS 가진 배아를 전송 합니다. 모든 deciduae/배아에 대 한 반복 합니다.</li>
	<li>Reichert의 막 제거, 태아를 덮어 상대적으로 불투명 막, 괴 롭 히 고 여 각 배아에서 그것 멀리 양말 ectoplacental 콘 (붉은 이식 사이트)에서 시작. 유전형을 받아 작은 조각 (~ 0.1 m m2) 노 른 자 색이이 단계에서의.</li>
	<li>화학 후드 및 적절 한 보호 장치 (장갑), EM 학년 정착 액 2.5%도 실 온에서 microcentrifuge (1.5 mL) 튜브에 PBS 살 균 필터링에서 구성 된 배아 전송. 4 ° c.에 하룻밤 배아를 수정</li>
	<li>조심 스럽게 배아를 건드리지 않고 튜브에서도 정착 액을 제거 하 고 적절 한 폐기물 컨테이너에서 삭제. 각 실 온에서 15 분에 대 한 살 균 필터링 PBS에 배아 세 번을 씻어.</li>
	<li>5 분에 대 한 에탄올 시리즈에 배아를 탈수: 50%, 70%, 85%, 및 100% 또는 절대 에탄올에 세 번. 에탄올에서 −20 ° C에 배아를 저장 하거나 다음 단계로 바로 진행.</li>
	<li>임계점 (일일) 임계점 건조 기 기계에 건조 대 바구니에 에탄올에 배아를 전송 합니다. 바구니를 완전히 커버 하는 에탄올으로 챔버를 채우십시오.</li>
	<li>신중 하 게 액체 CO2 와 10 ° c.에 10 번 홍 조 하 여 에탄올을 교환 챔버 절반 가득 때까지 마지막 단계 후 액체 CO2 에서 드레인. 압력 80 바 (임계점) 되 고 액체 CO2 가스 변경 때까지 40 ° C까지가 열. 10 분 기다립니다 다음 약 45 분 동안 천천히 가스를 버릴.</li>
	<li>건조에 대 한 일일 비용을 쉽게 대신, 30 분에 대 한 에탄올에 배아를 1: 1의 비율로 hexamethyldisilazane (HMDS)을 추가 합니다. 그런 다음 30 분 제거에 대 한 순수한 HMDS는 피 펫을 사용 하 여 액체에서 배아 배아를 전송 하 고 30 분 동안 건조 그들을 두고. 참고: 두 건조 방법 일 동등 하 게 우리 손에서 잘.</li>
	<li>좋은 브러시를 사용 하 여 이중 양면된 테이프와 sem의 스텁에 복 부 측 (노드)와 말린된 배아를 탑재.</li>
	<li>충전 긴 얇은 속눈썹을 선호 골드 입자 코팅 용 스퍼터 코팅 기계에 배아와 명세서를 삽입 합니다. 120-150의 레이어 적용 Å; 시간 각 샘플 달라 집니다 전류에 따라 달라 집니다.</li>
	<li>배아와 코팅된 명세서 SEM 현미경에, 진공 적용 놓고 배아 노드 및 15, 1000 X에서에서 까지의 배율에서 속눈썹 notochordal 플레이트 세포 관찰 000 X.</li>
</ol>2. 전체 산 면역 형광 마우스 노드 및 Notochordal 플레이트의
<ol><li>0.05% 얼음 처럼 차가운 PBS를 사용 하 여 트윈 20 (PBSTw), 단계 1.1-1.7 위의 E7.75에서 배아를 제거 하 고 35mm 페 트리 접시에 얼음에에서 PBSTw에 배치를 합니다.</li>
	<li>화학 후드 및 적절 한 보호 (장갑)을 착용, microcentrifuge 튜브에 PBS에 4 %paraformaldehyde 통 솔루션에 배아를 전송 합니다. 4 ° c.에 하룻밤 배아를 수정</li>
	<li>조심 스럽게 배아를 건드리지 않고 튜브에서 paraformaldehyde 정착 액을 제거 하 고 적절 한 폐기물 컨테이너에서 삭제. 0.2%를 포함 하는 PBS에 배아 세 번 씻어 실 온에서 각 5 분에 대 한 Triton X-100 (PBSTr). Nutating 통에 모든 세척 및 다음 인큐베이션 단계를 수행 합니다.</li>
	<li>마지막 세척 제거 하 고 차단 솔루션 PBSTr (이차 항 체의 호스트 종)에서 열 비활성화 세럼 10%로 포함 된 추가. 2 h에서 하룻밤 (또는 더 긴)으로 4 ° c.에 nutator에</li>
	<li>차단 제거 하 고 추가 ~ 차단 솔루션, 1: 500 희석에 예를 들어 안티-T 항 체 희석 주 항 체의 1 mL. 4 ° c.에 nutator에 하룻밤 (또는 이상)를 품 어</li>
	<li>1 차적인 항 체를 제거 하 고 0.02% (20% 주식의 항 체 솔루션의 1 mL에 1 µ L)의 최종 농도에 나트륨 아 지 드를 추가 하 여 나중에 사용을 위해 그것을 저장. 항 체를 다시 사용할 수 있습니다 ~ 10 번. PBSTr로 두 번 배아를 헹 구 고 4 ° c.에 nutator에 각 30 분에 대 한 세 번 그들을 씻어합니다</li>
	<li>형광 활용 된 이차 항 체, 1 차적인 항 체 호스트 종에서 희석에 대 한 세척 바꿉니다 ~ 1:1000 하룻밤 (또는 이상) 4 ° c.에 nutator에</li>
	<li>이차 항 체를 제거 하 고 두 번 PBSTr, 다음 PBSTr와 함께 30 분 동안 세 번 세척 린스.</li>
	<li>F-말라와 1:1000 DAPI, 실 온에서 1 h 핵 얼룩 얼룩을 1: 500 형광 활용 된 phalloidin를 포함 하는 PBSTr에 마지막 세척을 바꿉니다.</li>
	<li>PBSTr에 두 번 헹 구 고 실 온에서 30 분 동안 PBSTr로 한 번 씻어.</li>
	<li>PBS를 가진 PBSTr를 대체 하 고 얼음에 배아를 둡니다. 깨끗 한 긍정적으로 위탁 슬라이드 (60 x 24 mm) 및 coverslips (24 x 24 mm)과 수성 글리세롤 기반 설치 미디어, 예를 들어 1xPBS에 90% 글리세롤과 배아를 탑재 하는 antifade 시 약 준비.</li>
	<li>거리에 명확한 테이프의 두 조각을 넣어 ~ 15mm 슬라이드의 명확한 부분에 서로 다른. 이것은 충분 한 3D 공간 (Z 차원) 배아 병합 하지만 완전히 그들을 함부로 대 하지 있도록 만듭니다.</li>
	<li>해 현미경으로 신중 하 게 배아 (전송 하 여 손상 되지 배아에 대 한 충분 한 공간이 있도록) 컷된 P200 피 펫을 사용 하 여 슬라이드를 이동 합니다.</li>
	<li>미세 집게를 사용 하 여 태아를 펼쳐 노 른 골목의 옆 측에 2 개의 전체 컷을 확인 합니다. 최대 복 부 측 (노드 및 notochordal 플레이트)와 태아 (슬라이드에 아래로 신경 튜브의 등 쪽) 놓습니다.</li>
	<li>태아에 미디어를 마운트의 50 µ L를 추가 합니다. 슬라이드 당 4-5 배아를 놓습니다. 먼저 터치 슬라이드 (위쪽 또는 아래쪽 측면), 다음 테이프의 두 가지를 벌리고 배치 되며 기포 생성을 피하는 동안 좋은 집게 또는 구부러진된 정밀한 바늘을 사용 하 여 태아에 천천히 낮은 coverslip의 미디어를 마운트의 소량을 추가 합니다.</li>
	<li>흡수 성 지우기를 사용 하 여 초과 설치 미디어를 청소. 수는 coverslip 과정에서 이동 하지 않도록 주의 하십시오.</li>
	<li>매니큐어의 관대 한 금액을 사용 하 여, 그것을 이동 하지 않고는 coverslip의 측면을 봉인.</li>
	<li>스캐닝 confocal 현미경으로 관찰 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rivera-P&#233;rez, J. A., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+morphogenesis+in+the+early+mouse+embryo.">The dynamics of morphogenesis in the early mouse embryo.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2015).</li><li>Lee, J. D., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+node+and+notochord:+The+cellular+basis+for+the+establishment+and+maintenance+of+left-right+asymmetry+in+the+mouse.">Morphogenesis of the node and notochord: The cellular basis for the establishment and maintenance of left-right asymmetry in the mouse.</a> Developmental Dynamics. 237 (12), 3464-3476 (2008).</li><li>Balmer, S., Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notochord+morphogenesis+in+mice:+Current+understanding+and+open+questions.">Notochord morphogenesis in mice: Current understanding and open questions.</a> Developmental Dynamics. 245 (5), 547-557 (2016).</li><li>Yoshiba, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilia+at+the+node+of+mouse+embryos+sense+fluid+flow+for+left-right+determination+via+Pkd2.">Cilia at the node of mouse embryos sense fluid flow for left-right determination via Pkd2.</a> Science. , (2012).</li><li>Jurand, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+aspects+of+the+development+of+the+notochord+in+mouse+embryos.">Some aspects of the development of the notochord in mouse embryos.</a> Journal of Embryology and Experimental Morpholog. 32 (1), 1-33 (1974).</li><li>Poelmann, R. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+set+of+conserved+and+new+regulators+of+cytoskeletal+organization,+cell+morphology+and+migration.">Identification and characterization of a set of conserved and new regulators of cytoskeletal organization, cell morphology and migration.</a> BMC Biology. 9, (2011).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Vintersen Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+the+Mouse+Embryo:+A+Laboratory+Manual,+Fourth+Edition.">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Fourth Edition.</a> Cold Harb Lab Press. , (2014).</li><li>Braet, F., De Zanger, R., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drying+cells+for+SEM,+AFM+and+TEM+by+hexamethyldisilazane:+a+study+on+hepatic+endothelial+cells.">Drying cells for SEM, AFM and TEM by hexamethyldisilazane: a study on hepatic endothelial cells.</a> Journal of Microscopy. 186, 84-87 (1997).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이 작품은, SEM 및 WMIF는 마우스 배아 노드 및 notochordal 접시를 시각화를 수행 하는 방법을 보여 줍니다. Gastrulating 마우스 배아의 작은 크기 ~ E7.5와 표면에 이러한 구조의 존재 그들을 이상적인 기술 설명된2,,78을 사용 하 여 공부 하 게. 좋은 항 체, T와 속눈썹 표식 등의 구조, 조직 및 이러한 필수 배아 주최8의 형성에 WMIF를 사용 하 여 우수한 3D 정보를 제공 합니다.
마우스 배아 개발은 매우 빠른 속도로 진행 되며 노드 및 notochordal 격판덮개만 정도 태아의 표면에 존재, 때문에 타이밍은 이러한 실험2,3의 성공을 위해 필수적입니다. 예를 들어 2-4 somite 배아는 긴 속눈썹과 성숙한 노드 구 덩이의 SEM 분석을 위해 좋다. 훨씬 이전 또는 이후 배아 (전이나 후에 예를 들어 12 h), 노드는 표면에 않을 수 있습니다. WMIF는이 점에서 좀 더 유연 하지만 스스로 구조는 또한 개발 하는 동안 과도 그리고 타이밍은이 경우에 연구자의 관심 분야에 따라 달라 집니다.
시 약의 순수성도 이러한 기술의 성공을 위해 필수적 이다 특히 열 대권 외의를 일반적으로 배아에 충실 SEM. 작은 불순물에 의해 조사 결과 거 대 한 유물에.
우리는 sem의 하나에 대 한 배아 정착의 두 가지 방법을 테스트 1 x PBS의 절반 Karnovsky의 정착 액 (2.5%도, 2 %paraformaldehyde 0.1 m M cacodylate 버퍼)와 간단 하 게 2.5%도 사용 하 여. 하지만 우리 글 및 PBS 정착 제 1 단계에에서 설명 된 대로 사용 하는 것을 선호, 우리와 다른 사용 해야, 또한 반 Karnovsky의 정착 액 성공적으로 SEM.에 대 한
우리는 또한 sem의 대 한 배아를 건조의 두 가지 방법에 비해 임계점 건조 기 또는 HMDS 1 단계에에서 설명 된 대로 사용 하 여 샘플의 품질에 차이가 발견 고14다른 곳에서 보고.
2 단계에 대 한 우리 1% 낮은 녹는 agarose의 최종 세척 단계 35 m m 유리 하단 접시에 장착 후 배아를 포함 하 고 다음 함께 그것을 토 핑 테스트 ~ 10 µ L 설치 매체의. 이 포함 하는 방법을 작동 하 고 태아의 원래 3 차원 구조 및 관련 된 구조; 그러나, multiphoton 현미경 표본 정기 confocal 현미경 그대로 배아로 깊은 도달할 수 없습니다 있기 때문에 이미지 하는 데 필요한 (~ 1 m m).
우리가 믿습니다 이러한 두 가지 기술을 사용 하 여 상호 보완적인 정보 노드와 notochordal 격판덮개의 구조에 정상적인 개발 하는 동안 이러한 구조의 형성에 결함을 표시 하는 돌연변이에.

Gastrulation와 동반 전체적 움직임은 마우스 배아1형성을 위해 결정적 이다. 세포 모양과 morphogenesis 조직에 변화 세포 운명을 통제 하 고 뒤이어 신호 경로 정확 하 게 새로 형성된 된 세균 레이어1을 다변화 하기 그들의 기능을 수행 하도록 허용 하는 위치 정보를 지정 합니다. 일시적인 구조를 구성 하 고 노드 및 notochord 같은 센터를 신호 형성 발달 프로그램2의 실행을 위해 필수적 이다. 발달 생물학의 이러한 구조, 세포 기자와 라이브 ex vivo 세포 및 subcellular 동작2의 역학에 따라 이미지의 사용은의 가장 주목할 만한 morphogenesis 공부 기술의 다양 한 사용 ,,34. 이 보고서에서 우리는 두 이러한 기술에 대 한 우리의 최적화 된 프로토콜의 세부 묘사에 초점: 스캐닝 전자 현미경 (SEM) 및 전체 마운트 면역 형광 검사 (WMIF)를 노드의 morphogenesis 공부에서 여전히 쓸모 있다 그리고 notochordal 격판덮개는 notochord의 선구자.
마우스 배아 노드는 눈물 모양의 컵 셀의 gastrulation 및 morphogenesis (배아 일, E7.5-E8) 중 후반 머리 배 단계를 초기 주위 마우스 태아의 복 부 표면에 있는2,5, 6,7. Notochordal 플레이트 형태학 상으로 anteriorly 노드3에서 emanates. 노드 및 notochordal 격판덮개에 각 셀 단일 cilium는 노드 셀에 긴 하지만 길이 따라 발달 단계2외부에 돌출 하는 특징 이다. 노드 구 덩이에 속눈썹의 회전 좌우 비대칭4를 결정 하는 신호에 대 한 중요 한 것을 보였다. Notochordal 플레이트 notochord, 인접 somites, overlying 신경 관3의 모방에 대 한 중요 한 신호 센터의 선구자 이다.
위치 (표면), 모양 (컵)와 고유한 외부 세포 구조 (속눈썹) 소지의 특성 때문에 sem의 전통적으로 사용 되었습니다 노드 및 notochordal 접시를 시각화 하 고 그들의 형성과 구조2, 연구 7. SEM는 또한 노드 자체 또는 gastrulation, morphogenesis, 뿐만 아니라 속눈썹 형성8,,910에 영향을 주는 돌연변이 셀에 속눈썹의 구조에 변화를 공부 하는 데 사용 됩니다. Sem의 전자가 생물 표본11등 재료의 외부 표면의 토폴로지 열 대권 외의 집중된 광선을 이용 하는 기술입니다. 샘플은 고정, 건조 하 고 스퍼터 코팅 금속 스캐닝 전자 현미경 관찰에 대 한 1 단계에서에서 설명 하는 대로.
WMIF는 유전자 제품, 단백질, 3 차원 (3D) 등을 시각화 하는 착 색 기술입니다. 조직, 기관 또는 전체 유기 체는 WMIF 신호 및 3d에서 결과 구조의 모양의 분포에 대 한 공간 정보를 제공합니다. 기술은 다음 형광 어원이 같은 말과 얼룩 샘플 고정 기반으로 합니다. 마우스 배아 ~ E7.5는 고 투명 작고 따라서 노드 및 notochordal 접시를 시각화 하기 위해 WMIF 프로토콜에 대 한 이상적인. 예를 들어 Barchyury (T) 핵 노드 및 notochordal 플레이트, 그리고 원시 조 흔, E7.5-E8 배아 개발 및 WMIF에 의해 T에 대 한 좋은 작업 항 체의 주위에 덜 정도로 표현 된다 전사 요소는 상업적으로 사용 가능한 착 절차를 가능 하 게 하 고. 노드 및 notochordal 플레이트의 셀 외부를 직면 하 고 따라서 형광 활용 Phalloidin 마크 F 걸 꼭대기 constrictions로 얼룩이 질 수 있다 압축된 꼭대기 표면 또한 특징입니다. 예제로이 시 약을 사용 하 여, T와 F-말라 WMIF에 의해 착 색의 조합 제공 합니다 노드 및 gastrulating 마우스 배아에 3d에서 notochordal 플레이트의 표현을 우리가 2 단계 8에서 보여줍니다. 그러나, 노드 및 notochordal 플레이트, FOXA2, 등의 다른 마커 뿐만 아니라 ARL13B 또는 acetylated tubulin, 속눈썹의 마커 개발 마우스 배아3,4, WMIF를 수행 하기 위해 또한 사용할 수 있습니다.
우리는 striatin 상호 작용 단백질 1 (STRIP1) 정상 gastrulation 및 마우스 배아8morphogenesis 필수적입니다 나타났습니다. STRIP1 striatin-상호 작용 가수분해 및 kinases 복합물 (STRIPAK), 우리와 다른 걸 골격 조직8,12에 연루가의 핵심 구성 요소입니다. Strip1 돌연변이 체 배아에 주요 결함 축 mesoderm (노드 및 notochordal 플레이트)의 형성과 antero 후부 몸 축의 확장에 있다. 우리는 우리가 대표 결과 에 해당 수치 표시 노드 및 야생-타입 (WT)와 Strip1 돌연변이 배아 notochordal 접시를 분석 하 SEM 및 WMIF를 이용 했다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:843px;" width="842">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">1,1,1,3,3,3 Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td style="width:233px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:163px;">3840</td>
			<td style="width:161px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-T antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Critical Point Dryer</td>
			<td>Blazers Union</td>
			<td>CPD 020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4099,0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutardialdehyde solution 25%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1042390250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4974,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SEM coating unit PS3</td>
			<td>Agar Aids for Electron Microscopy</td>
			<td>PS3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SEM microscope Quantum FEG 250</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (FEI)</td>
			<td>Quantum FEG 250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence

후 이식 마우스 배아 gastrulation 및 morphogenesis 개시 후 주요 모양 변화를 겪 습. Morphogenesis의 특징은 과도 주최, 노드 notochordal 접시, 원시 조 흔을 통해 통과 하는 셀의 형성. 적절 한 형성이 신호 센터의 몸 계획의 개발을 위해 필수적 이며 마우스 발달 생물학에 대 한 높은 관심은 그들을 시각화 하는 기법. 노드 및 notochordal 플레이트 gastrulating 마우스 배아 배아 하루 (E) 7.5 개발의의 복 부 표면에 거짓말. 노드는 그 셀 보유 한 단일 슬림 cilium 각 컵 모양의 구조. 적절 한 subcellular 지 방화 및 노드 구 덩이에 속눈썹의 회전 좌우 비대칭을 결정 합니다. Notochordal 플레이트 셀 또한 노드 셀 보다 짧은 이기는 하지만 단일 속눈썹을가지고. Notochordal 플레이트 notochord somitogenesis 및 신경 패턴에 대 한 중요 한 신호 주최자 역할을 형성 한다. 때문에 노드 및 notochordal 플레이트의 세포 표면에 뚜렷이 존재 하 고 속눈썹을가지고, 그들은 스캐닝 전자 현미경 (SEM)을 사용 하 여 구상 될 수 있다. 시각화 하는 데 사용 하는 다른 기술을 세포 수준에서 이러한 구조 전체 마운트 면역 형광 (WMIF)가 높은 노드 및 notochordal 격판덮개에 표시 된 단백질에 대 한 항 체를 사용 하 여입니다. 이 보고서에서 우리는 우리의 최적화 된 프로토콜의 조직 형태와 야생-타입에서 세포 조직 평가에 도움을 개발 마우스 배아 및 gastrulation 돌연변이 배아 SEM 및 WMIF 노드와 notochordal 플레이트의 수행을 설명 합니다.

시험의 WT와 Strip1 돌연변이 배아에서 노드의 형성 하기 위하여 ~ E7.5, 우리는 1 단계에서에서 설명 하 고 그림 18과 같이 SEM 사용. SEM을 사용 하 여 외부 토폴로지의 ultrastructural 정보 아주 유익 되었고 그것은 즉시 분명 WT 배아에서 구 덩이 모양의 노드를 달리 돌연변이 배아는 평평 하 고 불규칙 한 노드 했다. 배아의 높은 확대에 그들을 명확 하 게 식별 하는 노드 셀 특성 속눈썹을 보여주었다. 돌연변이에 속눈썹의 명백한 낮은 밀도 노드 구 덩이 구조와 곡률 또는 노드 셀의 낮은 수의 손실에 기인 수 있습니다. 노드의 emanating 나타나는 notochordal 플레이트 또한 돌연변이 배아에 일반 했다. 그들은 그들의 짧은 속눈썹을 식별 했다. 따라서, SEM Strip1 돌연변이8노드 morphogenesis 결함을 공개 하는 것이 중요 했다. 우리는 또한 사용 sem의 이전 연구에서 부족 centrioles 속눈썹9에 대 한 서식 파일을 제공 하는 돌연변이의 배아 노드에 있는 속눈썹의 부재를 보여.
공부 하 고 세포 수준에서 Strip1 돌연변이 배아의 축 mesoderm 형성 결함, 우리는 2 단계에서에서 설명 하 고 그림 2에 표시 된 WMIF를 사용. 이 기술을 사용 하 여, 노드 및 notochordal 판 쉽게 확인 되었다 F-말라와 T 얼룩에 의해. WT 노드 및 notochordal 플레이트 셀 F 걸 농축 했다, 그리고 분명 했다 핵 T 얼룩 꼭대기 도메인 막혀서 있다. Notochordal 플레이트는 WT에 rostrally 확장 하지만 짧고 불규칙 돌연변이. 데이터 F 걸 조직 축 mesoderm8을 포함 하 여 돌연변이 배아의 다른 세균 층에서 비정상적인 보여주었다. 따라서, WMIF 노드에 결함 및 Strip1 돌연변이 체 배아에 notochordal 격판덮개 형성 연구 수단이 되었다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58321/58321fig1.jpg"> 그림 1 . Strip1 돌연변이 마우스 배아에서 노드 morphogenesis에서 결함을 보여준다 스캐닝 전자 현미경 검사 법. (맨 위) SEM 분석의 WT와 Strip1 돌연변이 복 부 배아 노드 및 notochordal 플레이트 (노토)8. WT 태아의 낮은 확대 이미지의 예를 들어 왼쪽에 표시 됩니다. (아래) 노드의 노드 셀에서 예상 하는 긴 monocilia를 공개 하는 위에 표시 된 센터의 높은 배율. 앞쪽에서 모든 패널입니다. 스케일 바: 30 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58321/58321fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58321/58321fig2.jpg"> 그림 2 . 전체 산 면역 형광 검사에서는 비정상적인 노드 및 세포 수준에서 notochordal 플레이트 Strip1 돌연변이 배아. (맨 위) 복 부 3D 렌더링 (Volocity 소프트웨어) WMIF WT와 Strip1 돌연변이 배아 형광 활용 된 phalloidin (F 걸, 빨간색)와 T (그린) 항 체 얼룩이 지기의 조합을 사용 하 여에. (아래) 얼룩 높은 줌 노드에 초점과 DAPI를 포함 하 여 위 그림의 더 많은 예제. 앞쪽에서 모든 패널입니다. 스케일 바: 30 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58321/58321fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

노드 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법, 면역 형광 산 전체를 사용 하 여 Gastrulating 마우스 배아에서 Notochordal 접시를 시각화

노드 및 notochordal 플레이트는 일시적 이며, 여러 가지 기술을 사용 하 여 시각 될 수 있는 마우스 배아 개발 주최 신호 여기, 우리가 자세히 설명 두 그들의 구조 및 morphogenesis 연구 기법을 수행 하는 방법: 1) 스캐닝 전자 현미경 (SEM); 그리고 2) 전체 마운트 면역 형광 검사 (WMIF).

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

노드 와 notochordal 플레이트는 마우스 배아 발달 중에 필수 주최자입니다. 오늘, 우리는 발달 생물학자가 이 구조물을 구상하고 연구하기 위하여 이용된 2개의 기술을 기술할 것입니다. 첫 번째 프로토콜에서는, 우리는 스캐닝 전기 현미경 검사법, SEM 및 두 번째, 전체 마운트 면역 형광을 수행하는 방법을 보여줍니다.노드와 notochordal 플레이트는 배아 일 E7.75에서 배아의 표면에 일시적으로 존재하며, 작은 섬모가 외부에 투사되어 SEM에 의한 식별 및 시각화를 허용합니다. 두 프로토콜 모두에서, 우리는 상대적으로 작은 마우스 배아를 처리하는 중요한 단계를 설명하고 전송하고 라우팅하는 방법에 초점을 맞출 것입니다. 시작하려면, 피부와 메자기를 통해 안락사 임신 마우스의 복부를 엽니 다.가위와 미세한 집게를 사용하여 자궁을 제거합니다. 자궁을 증류수에 잠깐 헹구고 PBS가 들어있는 작은 페트리 접시에 놓습니다. 그런 다음 해부 현미경과 미세 한 집게를 사용하여 자궁 근육을 제거하여 개별 데시두이를 해방시하십시오.해부 현미경에서, 집게의 쌍으로 각 데시두아를 잡고 빨간색 부분과 흰색 부분 사이의 세로, 전체 두께 절개를 만들기 위해 다른 쌍을 사용합니다. 절개와 인접한 데시두아의 흰색 부분을 따라 수직으로 피상천을 만듭니다. 그런 다음 데시두아를 수평으로 두 부분으로 끌어당기고 데시두아의 흰색 부분에서 배아를 조심스럽게 제거합니다.그 후, 배아를 멸균 여과 PBS를 포함하는 새로운 페트리 접시로 옮는다. 각 배아에서 라이허트의 멤브레인을 제거하여 자궁 절제콘에서 시작합니다. 미래의 지노티핑을 위해, 노른자 낭의 작은 조각을 제거합니다.화학 후드 하에서, 2.5%의 글루타랄데히드 및 멸균 여과 PBS로 구성된 EM 급 고정제를 함유한 미세원심분리기 튜브로 배아를 이송한다. 그 후 배아를 방해하지 않고 튜브에서 고정을 제거합니다. 배아를 멸균, 여과된 PBS에서 실온에서 15분 동안 세 번 세척합니다.PBS에서 희석된 50%70%와 85%에탄올을 사용하여 각각 5분 동안 에탄올 계열에서 배아를 탈수합니다. 100% 에탄올로 세 번 씻으시면 됩니다. 배아를 섭씨 20도에서 100% 에탄올에 저장하거나 다음 단계로 진행하십시오.그 후, 엠브로요스를 적절한 용기로 옮기고 남은 액체를 제거합니다. 30 분 동안 배아에 1 대 1의 비율로 HMDS와 에탄올을 추가합니다. 그런 다음 액체를 제거하고 30 분 동안 순수 HMDS를 추가하십시오.파이펫으로 배아에서 액체를 제거하고 30 분 동안 건조 할 수 있습니다. 작은 브러시와 양면 테이프를 사용하여 SEM 스텁에 말린 배아를 장착하고 복부 측면을 위로 올릴 수 있습니다. 금 입자 코팅을 위해 스퍼터 코팅 기계에 스텁을 삽입합니다.SEM 입자에서 가장 섬세한 단계 중 하나는 배아를 스텁에 올바른 방향으로 장착하는 것입니다. 배아가 테이프에 닿으면 방향을 더 이상 변경할 수 없습니다. 그 후, 코팅된 스텁을 SEM 현미경으로 배치하고, 진공을 적용하고, 배아 노드와 섬모를 가진 노토코드 플레이트 세포를 관찰한다.E7.75에서 배아를 제거 한 후, 얼음에 페트리 접시에 PBS Tween에 배치합니다. 화학 적 후드에서, 고정 용액을 포함하는 미세 원심 분리기 튜브로 배아를 전송. 그 후, 배아를 만지지 않도록 주의하여 튜브에서 고정을 제거하십시오.이어서, 견과류 셰이커에서 실온에서 0.2%트리톤 X-100을 함유한 PBS에서 배아를 3회 세척한다. 배아에서 마지막 세척을 제거하고 10 %의 열 비활성화 혈청과 PBS 트리톤을 포함하는 차단 용액을 추가합니다. 섭씨 4도에서 영양사에 적어도 2 시간 동안 배아를 차단합니다.다음으로, 차단을 제거하고 차단 용액에 희석된 1차 항체의 약 1밀리리터를 추가한다. 섭씨 4도에서 영양사에 하룻밤 동안 배아를 배양하십시오. 1 차적인 항체를 제거하고 나중에 사용하기 위해 저장하십시오.그런 다음 PBS 트리톤으로 배아를 두 번 헹구는 다. 그리고 견과류에 30 분 동안 세 번 씻으시면. 1차 항체 숙주 종에 대하여 희석된 플로레스시공 컨쥬게이드 이차 항체로 세척을 대체한다.그리고 섭씨 4도에서 영양사에 하룻밤 을 배양. 그런 다음, 이차 항체를 제거하고 PBS 트리톤으로 배아를 두 번 헹구는다. PBS 트리톤으로 30 분 동안 세 번 세척하기 전에.마지막 세척을 희석된 플로레스시펜싱을 함유한 PBS 트리톤으로 교체하고 실온에서 1시간 동안 DAPI와 얼룩을 희석시 보세요. 그런 다음 PBS 트리톤에서 배아를 두 번 헹구는 다. 그리고 실온에서 30 분 동안 PBS 트리톤으로 씻으시면 씻으실 수 있습니다.그 후 PBS 트리톤을 PBS로 교체하고 배아를 얼음 위에 둡니다. 그런 다음 깨끗하고 양전하의 슬라이드, 커버 슬립 및 수성 글리세롤 기반 마운팅 미디어를 준비합니다. 슬라이드에 서로 떨어져 15 밀리미터 투명 테이프의 두 조각을 배치합니다.그런 다음 해부 현미경으로 변형된 P200 파이펫을 사용하여 배아를 슬라이드로 이동시합니다. 미세 한 집게를 사용 하 여, 배아를 전개 하는 노른자 낭의 측면에 두 개의 전체 컷을 확인 합니다. 그런 다음, 복부 측으로 배아를 배치합니다.배아에 50 마이크로리터의 장착 매체를 추가합니다. 그런 다음 커버 슬립에 장착 용지를 넣습니다. 두 개의 테이프를 걸치고 구부러진 바늘을 사용하여 배아에 천천히 낮추습니다.흡수성 와이프를 사용하여 커버 슬립을 움직이지 않도록 주의하여 과도한 장착 매체를 제거하십시오. 그런 다음, 커버 슬립의 측면을 밀봉 하기 위해 매니큐어의 관대 한 금액을 사용 하 여. 마지막으로, 배아를 관찰하기 위해 스캐닝 공초점 현미경을 사용합니다.3D 시각화를 위해 커버를 왜곡할 수 있기 때문에 배아 위에 장착한 후 커버 슬립을 이동하지 않는 것이 중요합니다. 주사 전자 현미경 을 사용하여, 야생 형노드의 형성및 E7.75에서 하나의 돌연변이 마우스 배아를 스트립 관찰하였다. 야생 형의 피트 모양 노드와는 달리 돌연변이 배아는 평평하고 일반 노드 및 노달코탈 플레이트를 표시했습니다.면역형광에 대한 전체는 세포 수준에서 스트립 1 돌연변이 배아에서 노드 및 노토코드 플레이트 형성 결함을 연구하기 위해 사용되었다. 데이터는 돌연변이 배아에서 비정상적이고 기절했다는 것을 보여주었습니다. 노드와 무달음판은 배아의 표면에 일시적으로만 존재하므로 타이밍은 SEM의 성공을 위해 필수적입니다.예를 들면, 2-4개의 somite 태아는 긴 섬모를 가진 성숙한 노드의 SEM 분석에 좋다. 순도 시약은 특히 SEM에 의한 초구조를 탐구하는 데 있어 이러한 기술의 성공을 위해 필수적입니다.우리는 이 두 기술이 정상적인 발달 도중 노드와 결점 판의 구조와 이러한 구조물의 형성에 있는 결점을 보여주는 돌연변이에 상호 보완적인 정보를 준다고 믿습니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

고주파 초음파를 사용하여 마우스 태아에 대비 이미징

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

연구

발생학

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy Nanotomy of Healthy and Injured Zebrafish Brain

건강 및 부상 Zebrafish의 두뇌의 대규모 스캐닝 투과 전자 현미경 (Nanotomy)

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution electron microscopy. Others and we previously ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

멀티 타겟 원체 전체 마운트<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드에서 유전자 발현의 도메인을 비교<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

방법은 림프 글 랜드와 혈구 세포에서를 검사합니다<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

오르간 문화와 마우스 Wolffian 덕트의 전체 마운트 면역 형광 염색법

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Multiciliated 셀 전체 마운트 형광 제자리에서 교 잡 및 면역 형광의 결합 된 프로토콜을 통해 Zebrafish에 시각화

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

마우스 배아에서 심장 조상 인구의 양적 전체 마운트 면역 형광 분석

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

큰 볼륨 내에서 특정 세포 목표를 찾아내기를 위한 직렬 섹션의 복합 계층적 이미징

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

전체 산 면역 형광 및 교양된 마우스 난소의 여 포 정량화

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

전체 산 Epifluorescence를 사용 하 여 마우스 Embryogenesis 동안 심장 챔버의 분석

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...