Name: visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence
Uploaded: 2018-11-06T13:30:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence at JoVE.com

H.B. støttes av oppstart finansiering fra medisinske fakultet og SFB829 av universitetet i Köln. C.X. støttes av DFG gi BA 5810/1-1. Vi vil gjerne takke Imaging fasilitetene på CECAD forskningssenter og Memorial Sloan Kettering Cancer Center (New York, USA). Vi takker Joaquín Grego-Bessa (spanske National Center for hjerte forskning, Madrid, Spania) for hans innsikt på montering av embryo for WMIF.

Alle eksperimenter med dyreforsøk ble godkjent av de ansvarlige myndighetene i Nord Rhein Westfalen (LANUV-NRW).
1. skanning elektronmikroskop mus embryonale noden
<ol><li>Ofre gravid kvinne musen ~ E7.5 (2-4 somite scenen) av cervical forvridning. En detaljert forklaring med diagrammer av trinnene 1.1 - 1,7 er tilgjengelig i musen embryoet laboratorium håndbøker13.</li>
	<li>Åpne magen gjennom huden og mesenteries og fjern livmor saks og fine tang.</li>
	<li>Skyll livmoren kort i destillert vann og legg den i en liten ren Petriskål (6 cm) som inneholder 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS).</li>
	<li>Under en dissekere mikroskop og ved hjelp av fine pinsett, fjerne livmor muskler for å frigjøre den individuelle deciduae eller implantasjon nettsteder.</li>
	<li>Hold hver decidua med et par pinsett og bruke andre paret for å gjøre en langsgående full-tykkelse snitt mellom røde delen (fremtidige morkaken) og hvit del (der fosteret er plassert). Gjøre overfladisk perforeringer loddrett langs den hvite delen av decidua sammen med innsnitt. Trekk av decidua fra hverandre horisontalt i to halvdeler og nøye scoop ut embryoet i den hvite delen av decidua.</li>
	<li>Overføre embryoet til en ny Petriskål (35 mm) med fersk sterilt-filtrert PBS. Gjenta for alle deciduae/embryoer.</li>
	<li>Fjern Reicherts membran, en relativt ugjennomsiktig membran engulfing fosteret, fra hver fosteret ved erting den som bort en sokk starter på ectoplacental membran (rødlig implantasjon område). For genotyperingteknologi, ta en liten bit (~ 0,1 mm2) av plommesekken på dette stadiet.</li>
	<li>Under kjemiske hette og iført passende beskyttelse (hansker), overføre embryoene til EM klasse bindemiddel består av 2,5% glutaraldehyde i sterilt-filtrert PBS i et microcentrifuge (1,5 mL) rør ved romtemperatur. Fikse embryoene overnatter i 4 ° C.</li>
	<li>Nøye fjerne glutaraldehyde bindemiddel fra tuben uten å berøre embryoene og kast i et riktig avfallsbeholderen. Legg embryoene tre ganger i sterilt-filtrert PBS, i 15 min hver ved romtemperatur.</li>
	<li>Tørke embryo i en etanol serie i 5 min: 50%, 70%, 85% og tre ganger i 100% eller absolutt etanol. Lagre embryoer på −20 ° C i etanol eller gå direkte til neste trinn.</li>
	<li>Overføre embryoene i etanol til kurver for kritisk punkt tørking (CPD) i en kritisk punkt tørketrommel maskin. Fyll kammeret med etanol dekke kurver helt.</li>
	<li>Utveksle etanol ved nøye rødme med flytende CO2 for ti ganger på 10 ° C. Renne av flytende CO2 etter siste trinnet til kammeret er halvfull. Varme opp til 40 ° C før trykket når 80 barer (det kritiske punktet) og den flytende CO2 endres til gass. Vente på 10 min så sakte blåse av gassen over ca 45 min.</li>
	<li>Idet en lettere alternativ å CPD tørking, legge til hexamethyldisilazane (HMDS) i forholdet 1:1 embryo i etanol i 30 min. Deretter overføre embryoene til ren HMDS for 30 min. Fjern embryoene av væsken bruker en pipette, og la dem tørke for 30 min. Merk: Begge tørking metoder arbeidet like bra i våre hender.</li>
	<li>Bruk en fin børste til å montere de tørkede embryoene med ventral side (node) opp på en SEM spire med dobbeltsidig tape.</li>
	<li>Inn en frese belegg maskin for gull partikler belegg, som er foretrukket å lade lange tynne flimmerhårene fødsler med embryoene. Påfør et lag med 120-150 Å; tiden er avhengig av gjeldende, som vil variere med hver prøve.</li>
	<li>Plasser belagt fødsler med embryo i en SEM mikroskop, bruke vakuum og observere embryonale noden og notochordal plate celler med flimmerhårene ved forstørrelser mellom 1000 X 15 000 X.</li>
</ol>2. hele Mount Immunofluorescence musen Node og Notochordal Plate
<ol><li>Iskald PBS med 0,05% Følg mellom 20 (PBSTw), trinnene 1.1-1.7 ovenfor fjerne embryoer på E7.75 og plassere dem i PBSTw i 35 mm Petriskål på is.</li>
	<li>Under kjemiske hette og iført passende beskyttelse (hansker), overføre embryoene til en etappe, den stabiliserende løsning av 4% paraformaldehyde i PBS i et microcentrifuge rør. Fikse embryoene overnatter i 4 ° C.</li>
	<li>Nøye fjerne paraformaldehyde bindemiddel fra tuben uten å berøre embryoene og kast i et riktig avfallsbeholderen. Vask embryoene tre ganger i PBS 0,2 prosent Triton X-100 (PBSTr) i 5 min hver ved romtemperatur. Utføre alle vask og neste inkubasjon trinnene på en nutating shaker.</li>
	<li>Fjerner siste vask og legge blokkerer løsning som inneholder PBSTr med 10% inaktivert serum (fra verten arter av sekundær antistoffer). Kvartal fra 2T til overnatting (eller lengre) på en nutator på 4 ° C.</li>
	<li>Fjerne blokkering og Legg ~ 1 mL av primære antistoffer fortynnet i blokkering løsning, for eksempel et anti-T antistoff på 1:500 fortynning. Ruge over natten (eller lenger) på en nutator på 4 ° C.</li>
	<li>Fjern primær antistoffer og lagre den for senere bruk ved å legge til Natriumazid en siste konsentrasjon på 0,02% (1 µL av 20% aksjer til 1 mL av antistoff løsning). Antistoffer kan gjenbrukes ~ 10 ganger. Skyll embryo to ganger med PBSTr og deretter vaske dem tre ganger i 30 min hver på en nutator på 4 ° C.</li>
	<li>Erstatte vask med et fluorescens-konjugerte sekundære antistoff, mot den primære antistoff vert arten, utvannet på ~ 1:1000 overnatting (eller lengre) på en nutator på 4 ° C.</li>
	<li>Fjern sekundær antistoffer og skyll to ganger med PBSTr, og vask tre ganger for 30 min med PBSTr.</li>
	<li>Erstatt siste vask med PBSTr som inneholder 1:500 fluorescens-konjugerte phalloidin, stain F-utgangen og 1:1000 DAPI, beis kjerner, 1t ved romtemperatur.</li>
	<li>Skyll to ganger i PBSTr og vaskes en gang med PBSTr i 30 min ved romtemperatur.</li>
	<li>Erstatt PBSTr med PBS og la embryoene på is. Forberede ren positivt ladet lysbilder (60 x 24 mm) og coverslips (24 x 24 mm) og vandig glyserol-baserte monterer medier, for eksempel 90% glyserol i 1xPBS og en antifade reagens, montere embryoene.</li>
	<li>Sett to biter av klart bånd i en avstand på ~ 15 mm fra hverandre på klart del av lysbildet. Dermed opprettes 3D plass (i Z-dimensjonen) som ville tillate sammenslåing av embryo, men ikke helt squishing dem.</li>
	<li>Under dissecting mikroskop, Flytt forsiktig embryo bruker en kuttet P200 pipette (for å gi plass til fosteret skal kunne overføres og ikke er skadet) på lysbildet.</li>
	<li>Bruke fine tang, lage to full kutt på lateral sidene av plommesekken å utfolde fosteret. Plass embryoet med ventral side (node og notochordal plate) opp (dorsal av medfødte ned i lysbildet).</li>
	<li>Legge til 50 µL av montering media på fosteret. Sett 4-5 embryo per lysbilde. Legge en skvett av montering media ved siden av dekkglassvæske som første berøring lysbildet (øverst eller nederst side), deretter plassere den på de to stykker av tape og senke den sakte på embryoene med fine tang eller et bøyd tynn nål og unngå å opprette luftbobler.</li>
	<li>Rengjør overflødig montering media med en absorberende tørke. Pass på at du ikke flytter dekkglassvæske i prosessen.</li>
	<li>Med en sjenerøs mengde neglelakk, sel sidene av dekkglassvæske uten å flytte den.</li>
	<li>Observere under skanning AC confocal mikroskop.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rivera-P&#233;rez, J. A., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+morphogenesis+in+the+early+mouse+embryo.">The dynamics of morphogenesis in the early mouse embryo.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2015).</li><li>Lee, J. D., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+node+and+notochord:+The+cellular+basis+for+the+establishment+and+maintenance+of+left-right+asymmetry+in+the+mouse.">Morphogenesis of the node and notochord: The cellular basis for the establishment and maintenance of left-right asymmetry in the mouse.</a> Developmental Dynamics. 237 (12), 3464-3476 (2008).</li><li>Balmer, S., Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notochord+morphogenesis+in+mice:+Current+understanding+and+open+questions.">Notochord morphogenesis in mice: Current understanding and open questions.</a> Developmental Dynamics. 245 (5), 547-557 (2016).</li><li>Yoshiba, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilia+at+the+node+of+mouse+embryos+sense+fluid+flow+for+left-right+determination+via+Pkd2.">Cilia at the node of mouse embryos sense fluid flow for left-right determination via Pkd2.</a> Science. , (2012).</li><li>Jurand, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+aspects+of+the+development+of+the+notochord+in+mouse+embryos.">Some aspects of the development of the notochord in mouse embryos.</a> Journal of Embryology and Experimental Morpholog. 32 (1), 1-33 (1974).</li><li>Poelmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+head-process+and+the+formation+of+the+definitive+endoderm+in+the+mouse+embryo.">The head-process and the formation of the definitive endoderm in the mouse embryo.</a> Anatomy and Embryology (Berl). , 41-49 (1981).</li><li>Sulik, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+murine+node+and+notochordal+plate.">Morphogenesis of the murine node and notochordal plate.</a> Developmental Dynamics. 201 (3), 260-278 (1994).</li><li>Bazzi, H., Soroka, E., Alcorn, H. L., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STRIP1,+a+core+component+of+STRIPAK+complexes,+is+essential+for+normal+mesoderm+migration+in+the+mouse+embryo.">STRIP1, a core component of STRIPAK complexes, is essential for normal mesoderm migration in the mouse embryo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (51), 10928-10936 (2017).</li><li>Bazzi, H., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acentriolar+mitosis+activates+a+p53-dependent+apoptosis+pathway+in+the+mouse+embryo.">Acentriolar mitosis activates a p53-dependent apoptosis pathway in the mouse embryo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 1491-1500 (2014).</li><li>Huangfu, D., Liu, A., Rakeman, A. S., Murcia, N. S., Niswander, L., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signalling+in+the+mouse+requires+intraflagellar+transport+proteins.">Hedgehog signalling in the mouse requires intraflagellar transport proteins.</a> Nature. 426 (6962), 83-87 (2003).</li><li>McMullan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy+1928-1965.">Scanning electron microscopy 1928-1965.</a> Scanning. 17 (3), 175-185 (2006).</li><li>Bai, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+set+of+conserved+and+new+regulators+of+cytoskeletal+organization,+cell+morphology+and+migration.">Identification and characterization of a set of conserved and new regulators of cytoskeletal organization, cell morphology and migration.</a> BMC Biology. 9, (2011).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Vintersen Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+the+Mouse+Embryo:+A+Laboratory+Manual,+Fourth+Edition.">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Fourth Edition.</a> Cold Harb Lab Press. , (2014).</li><li>Braet, F., De Zanger, R., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drying+cells+for+SEM,+AFM+and+TEM+by+hexamethyldisilazane:+a+study+on+hepatic+endothelial+cells.">Drying cells for SEM, AFM and TEM by hexamethyldisilazane: a study on hepatic endothelial cells.</a> Journal of Microscopy. 186, 84-87 (1997).</li></ol>

Forfatterne ikke avsløre.

I dette arbeidet viser vi hvordan du utfører SEM og WMIF å visualisere mus embryonale noden og notochordal plate. Den lille størrelsen på gastrulating mouse embryoer ~ E7.5 og tilstedeværelsen av disse strukturene på overflaten gjør dem ideelle til å studere med teknikker beskrevet2,7,8. Tilgjengeligheten av god antistoffer, for eksempel T og flimmerhårene markører, gir utmerket 3D-informasjon ved hjelp av WMIF på strukturen, organiseringen og dannelsen av disse viktige embryonale arrangørene8.
Fordi mus embryonale utvikling fortsetter på en svært rask tempo og node og notochordal plate finnes bare transiently på overflaten av fosteret, er timing viktig for disse eksperimentene2,3. For eksempel er 2-4 somite embryoer bra for SEM analyse av en moden noden grop med lang flimmerhårene. I mye tidligere eller senere embryoer (for eksempel 12 h før eller etter), kan noden ikke være til stede på overflaten. WMIF er litt mer fleksibel i denne forbindelse men strukturene seg er også forbigående under utvikling og tidspunktet i dette tilfellet avhenger av forskernes interesser.
Renheten av reagensene er også viktig for suksessen til disse teknikkene, spesielt i undersøkelser av ultrastructure av SEM. Tiny urenheter det holde seg til embryoene vanligvis resultere i store gjenstander.
Vi har testet to ulike metoder for fosteret fiksering for SEM bruke halve Karnovsky bindemiddel (2,5% glutaraldehyde, 2% paraformaldehyde og 0.1 M cacodylate buffer) og en enklere 2,5% glutaraldehyde i 1 x PBS. Vi foretrekker å bruke glutaraldehyde og PBS bindemiddel som beskrevet i trinn 1, men vi og andre har også brukt den halve Karnovsky bindemiddel vellykket for SEM.
Vi har også sammenlignet to metoder for tørking embryoene for SEM og fant ingen forskjell i kvaliteten på prøven ved hjelp av en kritisk punkt tørketrommel eller HMDS som beskrevet i trinn 1 og rapportert andre steder14.
Trinn 2, vi testet innebygging av embryo etter siste vask trinnene i 1% lavt Smeltepunkt agarose montert på en 35 mm glass-bottom rett og deretter topping det med ~ 10 µL av montering medium. Denne innebygging metoden fungerer og bevarer den opprinnelige 3D strukturen av embryoet og tilhørende strukturer; multiphoton mikroskop er imidlertid nødvendig å image prøven fordi vanlige AC confocal mikroskop ikke kan nå så dypt inn i intakt embryo (~ 1 mm).
Vi tror at disse to teknikkene gir utfyllende informasjon om strukturen i noden og notochordal platen under normal utvikling og mutanter som viser feil i dannelsen av disse strukturene.

Gastrulation og tilhørende Morfogenetiske bevegelser er avgjørende for å forme det mus embryoet1. Endringene i mobilnettet form og organisasjonen under morphogenesis diktere posisjonelle informasjon for å regulere celle skjebne og også tillate de påfølgende signalveier nøyaktig utføre sine funksjoner til å spre den nyopprettede bakterie lag1. Dannelsen av organisering strukturer og signalering sentre som noden og notochord er viktig for gjennomføring av de utviklingsmessige programmet2. Utviklingsmessige biologer har brukt en rekke teknikker for å studere morphogenesis av disse strukturene, mest bemerkelsesverdige som er bruk av mobilnettet journalister og live ex vivo for å følge dynamikken i mobilnettet og subcellular atferd2 ,3,4. I denne rapporten vi fokusere på å beskrive detaljene for våre optimalisert protokoller for to av disse teknikkene: skanning elektronmikroskop (SEM) og hele mount immunofluorescence (WMIF), som var og er fortsatt instrumental i å studere morphogenesis for noden og notochordal platen, forløperen til notochord.
Mus embryonale noden er en Dråpeformede kopp av celler som er plassert på ventral overflaten av musen embryoet rundt tidlig til sen hodet kaste stadier under gastrulation og morphogenesis (embryonale dag, E7.5-E8)2,5, 6,7. Notochordal platen utgår morphologically peke fra node3. Hver celle i noden og notochordal plate er preget av et enkelt Flimmerhår som stikker på utsiden, som er lengre i noden celler men lengden varierer med utviklingen scene2. Rotasjon av flimmerhårene i noden gropen har vist seg å være viktig for signalering som bestemmer venstre høyre asymmetri4. Notochordal platen er forløperen til notochord, signalnettverk sentrum som er viktig for mønstre av de tilstøtende somites og overliggende medfødte3.
På grunn av attributtene for plassering (overflate), form (cup) og besitter forskjellige ytre cellulære strukturer (flimmerhårene), er SEM tradisjonelt brukt til å visualisere noden og notochordal plate og studere deres dannelse og struktur2, 7. SEM brukes også til å studere endringer i strukturen i noden selv eller flimmerhårene på cellene i mutasjoner som påvirker gastrulation, morphogenesis, samt flimmerhårene formasjon8,9,10. SEM er en teknikk som bruker en fokusert stråle av elektroner avhøre topologisk ultrastructure av den ytre overflaten av materialer som biologiske prøver11. Prøven er vanligvis fast, tørket og deretter frese-belagt med metaller for observasjon under scanning elektron mikroskop som vi beskriver i trinn 1.
WMIF er en flekker teknikk å visualisere genet produkter, for eksempel proteiner, i tre-dimensjoner (3D). WMIF vev, organer eller hele organismer gir romlig informasjon om distribusjon av signalet og formen på den resulterende strukturen i 3D. Teknikken er basert på feste prøven deretter flekker det med fluorescerende conjugates. Mus embryo ~ E7.5 er liten og gjennomsiktig og derfor ideell for WMIF-protokoller for å visualisere noden og notochordal plate. For eksempel transkripsjon faktoren Barchyury (T) er uttrykt i kjerner av node og notochordal plate, og i mindre grad i den primitive strek, rundt E7.5-E8 embryonale utvikling og godt fungerende antistoffer mot T av WMIF er kommersielt tilgjengelig og muliggjøre flekker prosedyren. Cellene i noden og notochordal plate er også preget av trange apikale flater, som vender mot utsiden og dermed kan være farget med fluorescens-konjugerte Phalloidin merket F-utgangen på de apikale constrictions. Bruker disse reagensene som eksempler, gir kombinasjonen av T og F-utgangen farging av WMIF en representasjon av node og notochordal plate i 3D i gastrulating mouse embryoer som vi viser i trinn 2- 8. Markører for flimmerhårene, som ARL13B eller acetylated tubulin, i tillegg til andre markører av node og notochordal plate, for eksempel FOXA2, kan imidlertid også brukes til å utføre WMIF på utvikle musen embryo3,4.
Vi har vist at striatin-samspill protein 1 (STRIP1) er avgjørende for vanlig gastrulation og morphogenesis i musen embryoet8. STRIP1 er en kjernekomponent i striatin-samspill phosphatases og kinaser komplekser (STRIPAK), som vi og andre har innblandet i utgangen cytoskjelett organisasjon8,12. En alvorlig defekt i Strip1 mutant embryoer er i dannelsen av aksial mesoderm (node og notochordal platen) og utvidelse av antero-bakre kropp aksen. Vi har brukt SEM og WMIF for å analysere noden og notochordal plate i vill-type (WT) og Strip1 mutant embryo som vi viser i Representant resultater og tilsvarende tall.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:843px;" width="842">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">1,1,1,3,3,3 Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td style="width:233px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:163px;">3840</td>
			<td style="width:161px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-T antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Critical Point Dryer</td>
			<td>Blazers Union</td>
			<td>CPD 020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4099,0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutardialdehyde solution 25%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1042390250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4974,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SEM coating unit PS3</td>
			<td>Agar Aids for Electron Microscopy</td>
			<td>PS3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SEM microscope Quantum FEG 250</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (FEI)</td>
			<td>Quantum FEG 250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence

Etter implantasjon musen embryoet gjennomgår store figurendringene etter initiering av gastrulation og morphogenesis. Et kjennetegn på morphogenesis er dannelsen av forbigående arrangørene, node og notochordal plate, celler som har gått gjennom den primitive strek. Riktig dannelsen av disse signalnettverk sentre er avgjørende for utviklingen av kroppen planen og teknikker for å visualisere dem er av høy interesse for musen utviklingsmessige biologer. Noden og notochordal plate ligger på ventral overflaten av gastrulating mouse embryoer rundt embryonale dag (E) 7.5 utvikling. Noden er en cup-formet struktur som celler har en enkelt slanke Flimmerhår hver. Riktig subcellular lokalisering og rotasjon av flimmerhårene i noden gropen bestemmer venstre høyre asymmetri. Notochordal plate cellene har enkelt flimmerhårene men kortere enn noden cellene. Notochordal platen danner notochord som fungerer som en viktig signalnettverk arrangør for somitogenesis og nevrale mønstre. Fordi cellene i noden og notochordal plate transiently finnes på overflaten og ha flimmerhårene, kan de visualiseres ved hjelp av skanning elektronmikroskop (SEM). Blant andre teknikker som brukes til å visualisere disse strukturene på cellenivå er hele mount immunofluorescence (WMIF) bruker antistoffer mot proteiner som er svært uttrykt i noden og notochordal plate. I denne rapporten beskriver vi våre optimalisert protokoller for å utføre SEM og WMIF av node og notochordal plate i utviklingsland mouse embryoer å hjelpe i vurderingen av vev form og mobilnettet organisasjon i vill-type og gastrulation mutant embryoer.

Undersøke dannelsen av noden i WT og Strip1 mutant embryoer på ~ E7.5, vi brukte SEM som beskrevet i trinn 1 og vist i figur 18. Ultrastructural detaljer om utenfor topologien bruker SEM var ganske informativ og det var umiddelbart klart at i motsetning til noden pit-formet i WT embryoer mutant embryo hadde en flat og uregelmessig node. Høyere forstørrelse av embryoene viste karakteristiske flimmerhårene på noden celler som identifisert dem entydig. Klart lavere tetthet av flimmerhårene i mutant kan skyldes tap av node grav struktur og kurvatur eller et lavere antall noden celler. Notochordal platen som vises kommer fra noden var også uregelmessig i de muterte embryoene. De var identifiserbar med sin kortere flimmerhårene. SEM var derfor viktig å åpenbare noden morphogenesis mangler i Strip1 mutanter8. Vi har også brukt SEM i tidligere studier for å vise fravær av flimmerhårene i noden embryonale mutanter som manglet centrioles, som gir malen for flimmerhårene9.
For å studere aksial mesoderm formasjon mangler i Strip1 mutant embryoer på cellenivå, brukte vi WMIF som beskrevet i trinn 2 og vist i figur 2. Bruker denne teknikken, var node og notochordal plate lett identifiseres av F-utgangen og T flekker. WT node og notochordal plate celler har trange apikale domener der F-utgangen anriket, og kjernefysiske T flekker var tydelig. Notochordal platen utvidet rostrally i WT men var kort og uregelmessig i mutant. Data viste at F-utgangen organisasjon er unormal i de forskjellige bakterie lag av de muterte embryoene inkludert aksial mesoderm8. Dermed var WMIF instrumental mangler i noden og notochordal plate formasjonen i Strip1 mutant embryoer.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58321/58321fig1.jpg"> Figur 1 . Skanning elektronmikroskop avslører feil i noden morphogenesis i Strip1 mutant mouse embryoer. (Øverst) SEM analyser av WT og Strip1 mutant ventrale embryonale noder og notochordal plater (Noto)8. Et eksempel på en lav forstørrelse bilde av en WT embryoet vises til venstre. (Nederst) Høyere forstørrelser av sentrum av nodene på overdelen avslørende den lange monocilia eller noden cellene. Fremre er opp i alle paneler. Skalere barer: 30 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58321/58321fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58321/58321fig2.jpg"> Figur 2 . Hele mount immunofluorescence viser unormale noden og notochordal plate på cellenivå i Strip1 mutant embryoer. (Øverst) Ventrale 3D-gjengivelse (Volocity programvare) av WMIF på WT og Strip1 mutant embryo bruker en kombinasjon av fluorescens-konjugerte phalloidin (F-utgangen, rød) og T antistoff (grønn) flekker. (Nederst) Flere eksempler på den flekker ovenfor fokuserer på noden med høyere zoom og inkludert DAPI. Fremre er opp i alle paneler. Skalere barer: 30 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58321/58321fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence at JoVE.com

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal Plate i Gastrulating Mouse embryoer skanning elektronmikroskop og hele Mount Immunofluorescence

Noden og notochordal plate er forbigående signalering arrangørene utvikle mouse embryoer som kan visualiseres ved hjelp av flere teknikker. Her vi beskrive i detalj hvordan du utfører to teknikker for å studere struktur og morphogenesis: 1) skanning elektronmikroskop (SEM); og 2) hele mount immunofluorescence (WMIF).

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Noden og notochordal plate er viktige arrangører under mus embryonisk utvikling. I dag vil vi beskrive to teknikker som brukes av utviklingsbiologer for å visualisere og studere disse strukturene. I den første protokollen vil vi demonstrere hvordan du utfører skanning av elektromikroskopi, SEM og i den andre, hele mount immunofluorescence.Noden og den notoordale platen er forbigående tilstede på overflaten av embryoet på embryonisk dag E7.75, understreker at små flimmerhår projiserer til utsiden, noe som tillater identifisering og visualisering av SEM. I begge protokollene vil vi demonstrere kritiske skritt for å håndtere de relativt små museembryoene og fokusere på hvordan man overfører og rute dem. For å begynne, åpne magen til en euthanized gravid mus gjennom huden og mesenteriene.Bruk saks og fine tang, fjern livmoren. Skyll livmoren kort i destillert vann og legg den i en liten petriskål som inneholder PBS. Deretter bruker du et dissekerende mikroskop og fine tang for å fjerne livmormusklene for å frigjøre den enkelte decidui.Under det disseksjonsmikroskopet holder du hvert decidua med et par tang og bruker et annet par til å lage et langsgående snitt med full tykkelse mellom den røde delen og den hvite delen. Gjør overfladiske perforeringer vertikalt langs den hvite delen av decidua, sammenhengende med snittet. Trekk deretter decidua fra hverandre horisontalt i to halvdeler og fjern forsiktig embryoet fra den hvite delen av decidua.Etter dette overfører du embryoene til en ny petriskål som inneholder steril filtrert PBS. Fjern Reicherts membran fra hvert embryo, som starter ved ektoplacental kjegle. For fremtidig genotyping, fjern en liten del av eggeplommesekken.Under en kjemisk hette, overføre embryoene til en mikrocentrifuge rør som inneholder EM klasse fixitive består av 2,5% glutaraldehyd og sterile filtrert PBS. Etter dette fjerner du fikseringstivet fra røret uten å forstyrre embryoene. Vask embryoene tre ganger i steril, filtrert PBS i 15 minutter ved romtemperatur.Dehydrere embryoene i en etanolserie i fem minutter hver, ved hjelp av 50% 70% og 85% etanol fortynnet i PBS. Vask tre ganger i 100% etanol. Oppbevar embryoer i 100% etanol ved 20 grader Celsius, eller fortsett til neste trinn.Etter dette, overfør embroyos til et passende fartøy og fjern eventuell gjenværende væske. Legg HMDS og etanol i forholdet mellom ett og en til embryoene i 30 minutter. Fjern deretter væsken og tilsett ren HMDS i 30 minutter.Fjern væsken fra embryoene med en pipette og la dem tørke i 30 minutter. Bruk en liten børste og dobbeltsidig tape for å montere de tørkede embryoene på SEM stubs, med ventrale sider opp. Sett sstuene inn i en sputter belegg maskin for gull partikkel belegg.Et av de mest delikate trinnene i SEM-partikkelen er å montere embryoene i riktig retning på stubben. Når embryoet lander på båndet, kan ikke orienteringen endres lenger. Etter dette plasserer du de belagte stubene i et SEM-mikroskop, bruker et vakuum og observerer embryonale noder og notochordale plateceller med flimmerhår.Etter å ha fjernet embryoene på E7.75, legg dem i PBS Tween i en petriskål på is. Under en kjemisk hette, overfør embryoene til et mikrocentrifugerør som inneholder fikserende løsning. Etter dette fjerner du fikseringsmiddelet fra røret, og tar vare på å ikke røre embryoene.Vask deretter embryoene tre ganger i PBS som inneholder 0,2% Triton X-100 i 5 minutter ved romtemperatur på en nøtteshaker. Fjern den siste vasken fra embryoene og tilsett blokkeringsløsning som inneholder PBS Triton, med 10% varmeinaktivert serum. Blokker embryoene i minst to timer på en nutator ved fire grader Celsius.Deretter fjerner du blokkeringen og legger til omtrent en milliliter primært antistoff fortynnet i blokkeringsløsning. Inkuber embryoene over natten på en nutator ved fire grader Celsius. Fjern det primære antistoffet og lagre det til senere bruk.Skyll deretter embryoene med PBS Triton to ganger. Og vask dem tre ganger i 30 minutter på en nutator. Erstatt vasken med det fortynnede florescence konjugert sekundært antistoff mot de primære antistoffvertsartene.Og inkuber over natten på en nutator på fire grader Celsius. Fjern deretter det sekundære antistoffet og skyll embryoene med PBS Triton to ganger. Før vask tre ganger i 30 minutter med PBS Triton.Bytt ut den siste vasken med PBS Triton som inneholder fortynnet florescence konjugert falloidin og fortynnet DAPI og flekk i en time ved romtemperatur. Skyll deretter embryoene to ganger i PBS Triton. Og vask dem med PBS Triton i 30 minutter ved romtemperatur.Etter dette erstatter du PBS Triton med PBS og lar embryoene stå på is. Deretter forberede rene, positivt ladede lysbilder, deksel slips og vandig glyserol basert monteringsmedier. Plasser to stykker klar tape 15 millimeter fra hverandre på lysbildet.Deretter, under disseksjonsmikroskopet, bruk en modifisert P200 pipette til å flytte et embryo til lysbildet. Bruk fine tang, gjør to fulle kutt på sidesidene av eggeplommesekken for å utfolde embryoet. Deretter plasserer du embryoet med ventralsiden opp.Tilsett 50 mikroliter monteringsmedier til embryoet. Deretter legger du til en dab med monteringsmedier på dekksslipp. Plasser det straddling de to stykkene tape, og senk den sakte på embryoene ved hjelp av en bøyd nål.Bruk en absorberende klut til å fjerne overflødig monteringsmedier, og vær forsiktig så du ikke flytter dekkseddelen. Deretter bruker du en sjenerøs mengde neglelakk for å forsegle sidene av dekselet slip. Til slutt, bruk et konfokal mikroskop for skanning for å observere embryoene.Det er viktig å ikke flytte dekselet slip etter montering det over embryoene, fordi det kan forvrenge dem for 3D visualisering. Ved hjelp av skanning av elektronmikroskopi ble dannelsen av noden i villtype og stripe av ett mutert museembryo på E7,75 observert. I motsetning til den pit-formede noden i villtypen, viste de muterte embryoene en flat og en vanlig node og nodalcordal plate.Hele nå til immunofluorescence ble brukt til å studere node og notochordal plate formasjon defekter i Strip 1 mutant embryoer på cellenivå. Dataene viste at de var unormale og forkrøplet i mutant embryoer. Noden og nodalcortal platen er bare forbigående tilstede på overflaten av embryoet, derfor er timing avgjørende for sems suksess.For eksempel er to til fire somite embryoer bra for SEM-analyse av en moden node med lang flimmerhår. Renhet reagenser er også avgjørende for suksessen til disse teknikkene, spesielt i sondering ultrastruktur av SEM. Små urenheter som holder seg til embryoet vanligvis resultere i store gjenstander.Vi mener at disse to teknikkene gir komplementær informasjon om strukturen av noden og nodalcortal plate under normal utvikling og i mutanter som viser feil i dannelsen av disse strukturene.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Kontrast Imaging i Mouse Embryoer hjelp Høyfrekvente ultralyd

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy Nanotomy of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Storskala Scanning transmisjonselektronmikroskopi (Nanotomy) av sunn og Skadet Sebrafisk Brain

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution electron microscopy. Others and we previously ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering for Sammenligning av genekspresjon domener i<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryoet

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Metoder for å undersøke lymfekjertel og Hemocytes i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Organ Kultur og Whole Mount Immunofluorescensanalyse Farging av Muse Wolffian Kanaler

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualisere Multiciliated celler i sebrafisk gjennom kombinert protokollen hele Mount fluorescerende In Situ hybridisering og Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitativ hele-mount Immunofluorescence analyse av Cardiac stamfar populasjoner i Mouse embryoer

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Flere hierarkisk Imaging av føljetong delene for å finne konkrete mobilnettet mål i store volumer

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Hele Mount Immunofluorescence og hårsekken kvantifisering av kultivert musen eggstokkene

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

Analyse av Cardiac kammer utvikling under musen Embryogenesis bruke hele Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...