Name: visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence
Uploaded: 2018-11-06T13:30:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence at JoVE.com

M.P. es apoyado por financiación de puesta en marcha de la Facultad de medicina y SFB829 de la Universidad de Colonia. C.X es apoyado por DFG concesión BA 5810/1-1. Nos gustaría dar las gracias a las instalaciones de la proyección de imagen en el centro de investigación CECAD y el Memorial Sloan Kettering Cancer Center (Nueva York, Estados Unidos). Agradecemos a Grego-Bessa de Joaquín (Centro Nacional de Investigación Cardiovascular, Madrid, España) por su penetración en los embriones de montaje para WMIF.

Todos los experimentos que involucran animales de experimentación fueron aprobados por las autoridades responsables en Westfalia Rhein (LANUV-NRW).
1. microscopía electrónica del nodo embrionario de ratón
<ol><li>Sacrificar el ratón hembra embarazado en ~ E7.5 (2-4 etapa de somite) por dislocación cervical. Una explicación detallada con los diagramas de pasos 1.1 - 1.7 está disponible en embrión de ratón laboratorio manuales13.</li>
	<li>Abrir el abdomen a través de la piel y entresijos y extirpar el útero, usando tijeras y pinzas finas.</li>
	<li>Enjuague el útero brevemente en agua destilada y colóquelo en un plato pequeño de Petri limpia (6 cm) que contiene 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS).</li>
	<li>Bajo un microscopio de disección y con unas pinzas finas, retire los músculos uterinos para los sitios de implantación o deciduae individuales.</li>
	<li>Sujete cada decidua con un par de pinzas y usar el otro par para hacer una incisión longitudinal de espesor total entre la parte roja (futura placenta) y la parte blanca (donde se encuentra el embrión). Hacer perforaciones superficiales verticalmente a lo largo de la parte blanca de la decidua contiguo con la incisión. Separe la decidua horizontalmente en dos mitades y con cuidado sacar el embrión en la parte blanca de la decidua.</li>
	<li>Transferir el embrión a una nueva placa de Petri (35 mm) con PBS estéril filtrada fresca. Repita para todos deciduae embriones.</li>
	<li>Membrana de Reichert, una membrana relativamente opaca que envuelve el embrión, de cada embrión de burlas como un calcetín a partir del cono de ectoplacental (sitio de la implantación de color rojizo). Por genotipificación, tome un pedazo pequeño (~ 0,1 mm2) de la vesícula vitelina en esta etapa.</li>
	<li>Bajo una campana química y usar protección adecuada (guantes), transferir los embriones a EM grado fijador compuesto por glutaraldehído al 2.5% en PBS estéril filtrado en un tubo de microcentrífuga (1.5 mL) a temperatura ambiente. Fijar los embriones durante la noche a 4 ° C.</li>
	<li>Retirar el fijador de glutaraldehido del tubo sin tocar los embriones cuidadosamente y deseche en un contenedor de residuos adecuado. Lavar los embriones tres veces en PBS estéril filtrada, durante 15 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Deshidratar los embriones en una serie de etanol de 5 minutos cada uno: 50%, 70%, 85% y tres veces en 100% o etanol absoluto. Almacenar los embriones a −20 ° C en etanol o vaya directamente al paso siguiente.</li>
	<li>Transferencia de los embriones en etanol a cestas para punto crítico (CPD) de secado en una secadora de punto crítico. Llene la cámara con etanol para cubrir completamente las cestas.</li>
	<li>Intercambiar el etanol por cuidadosamente lavado con líquido de CO2 por diez veces a 10 ° C. Drena líquido CO2 después el último paso hasta que la cámara está medio llena. Calentar hasta 40 ° C hasta que la presión alcanza 80 bares (el punto crítico) y el líquido CO2 cambia a gas. Espere 10 minutos y luego lentamente soplar el gas por aproximadamente 45 minutos.</li>
	<li>Como una alternativa más fácil para CPD para secar, añadir hexamethyldisilazane (HMDS) en una proporción de 1:1 a los embriones en etanol durante 30 minutos. Luego transferir los embriones a HMDS puro durante 30 minutos retirar los embriones en el líquido con una pipeta y dejarlos secar durante 30 minutos. Nota: Ambos métodos de secado trabajaban igualmente bien en nuestras manos.</li>
	<li>Use un pincel fino para montar los embriones secos con el lado ventral (nodo) para arriba en un trozo de SEM con cinta de doble cara.</li>
	<li>Inserte los talonarios con los embriones en una máquina de recubrimiento sputter para la capa de la partícula del oro, que es preferida para cargar los cilios largo y finos. Aplicar una capa de 120-150 Å; el tiempo depende de la corriente, que variará con cada muestra.</li>
	<li>Coloque los talones revestidos con los embriones en un microscopio SEM, aplicar vacío y observe el nodo embrionario y las células de la placa notocordal con cilios con aumentos que van desde 1000 X hasta 15, 000 X.</li>
</ol>2. todo inmunofluorescencia de montaje de la placa notocordal y nodo de ratón
<ol><li>Con PBS helado con 0,05% Tween 20 (PBSTw), siga los pasos 1.1-1.7 arriba para sacar los embriones en E7.75 y en PBSTw en una placa de Petri en el hielo de 35 mm.</li>
	<li>Bajo una campana química y usar protección adecuada (guantes), transferencia de los embriones en una solución fijadora de paraformaldehído al 4% en PBS en un tubo de microcentrífuga. Fijar los embriones durante la noche a 4 ° C.</li>
	<li>Retirar el fijador de paraformaldehido del tubo sin tocar los embriones cuidadosamente y deseche en un contenedor de residuos adecuado. Lavar los embriones tres veces en PBS que contenía 0,2% Tritón X-100 (PBSTr) por 5 min a temperatura ambiente. Realizar el lavado y pasos de incubación en un agitador oscilante.</li>
	<li>Retirar el último lavado y añadir solución de bloqueo que contiene PBSTr con 10% de suero inactivado con calor (de la especie del anticuerpo secundario). Bloque de 2 h durante la noche (o más) en un nutator a 4 ° C.</li>
	<li>Retirar el bloqueo y añadir ~ 1 mL del anticuerpo primario diluido en solución, por ejemplo, un anticuerpo anti-T en dilución 1: 500 de bloqueo. Incubar durante la noche (o más) en un nutator a 4 ° C.</li>
	<li>Quitar el anticuerpo primario y guardarlo para utilizarlo más adelante agregando azida sódica a una concentración final de 0,02% (1 μl del stock de 20% a 1 mL de solución de anticuerpo). El anticuerpo puede ser reutilizado ~ 10 veces. Enjuague los embriones dos veces con PBSTr y luego lavarlos tres veces durante 30 minutos cada uno en un nutator a 4 ° C.</li>
	<li>Sustituir el lavado con un anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia, contra la especie primaria del anticuerpo, diluido en ~ 1: 1000 durante la noche (o más) en un nutator a 4 ° C.</li>
	<li>Quite el anticuerpo secundario y enjuague dos veces con PBSTr, a continuación, lave tres veces durante 30 minutos con PBSTr.</li>
	<li>Vuelva a colocar el último lavado con PBSTr que contienen phalloidin conjugado fluorescencia de 1: 500, a la mancha F-actina y 1: 1000 DAPI, para teñir los núcleos, por 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Enjuague dos veces en PBSTr y lavar una vez con PBSTr por 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Reemplace PBSTr con PBS y dejar los embriones en el hielo. Preparar portaobjetos limpio cargado positivamente (60 x 24 mm) y cubreobjetos (24 x 24 mm) y los medios de medio de montaje acuoso basados en glicerol, por ejemplo, 90% de glicerol en 1xPBS y un reactivo antifade, montar los embriones.</li>
	<li>Poner dos trozos de cinta adhesiva transparente a una distancia de ~ 15 mm uno del otro en la parte clara de la diapositiva. Esto creará suficiente espacio 3D (en la dimensión Z) que permita acoplar los embriones pero no totalmente exprimirlos.</li>
	<li>Con un microscopio de disección, mueva cuidadosamente los embriones utilizando una pipeta de P200 corte (para permitir suficiente espacio para que el embrión a transferir y no dañado) a la diapositiva.</li>
	<li>Con unas pinzas finas, hacer dos cortes completos en los laterales de la vesícula vitelina a desarrollarse el embrión. Coloque el embrión con el lado ventral (nodo y placa notocordal) para arriba (dorsal del tubo neural en la diapositiva).</li>
	<li>Añadir 50 μl de medio de montaje sobre el embrión. Coloque los embriones de 4-5 por diapositiva. Añadir un poco de montaje de los medios de comunicación al lado del cubreobjetos que primero toque la corredera (lado superior o inferior), luego coloque a caballo entre los dos trozos de cinta y bájela lentamente hasta los embriones con pinzas finas o una aguja fina doblada evitando crear burbujas de aire.</li>
	<li>Limpiar los medios de montaje exceso utilizando un paño absorbente. Tenga cuidado de no mover el cubreobjetos en el proceso.</li>
	<li>Con una generosa cantidad de esmalte de uñas, sella los lados del cubreobjetos sin moverla.</li>
	<li>Observar bajo un microscopio de barrido confocal.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rivera-P&#233;rez, J. A., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+morphogenesis+in+the+early+mouse+embryo.">The dynamics of morphogenesis in the early mouse embryo.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2015).</li><li>Lee, J. D., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+node+and+notochord:+The+cellular+basis+for+the+establishment+and+maintenance+of+left-right+asymmetry+in+the+mouse.">Morphogenesis of the node and notochord: The cellular basis for the establishment and maintenance of left-right asymmetry in the mouse.</a> Developmental Dynamics. 237 (12), 3464-3476 (2008).</li><li>Balmer, S., Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. 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Los autores no tienen nada que revelar.

En este trabajo demostramos cómo hacer SEM y WMIF para visualizar la placa notocordal y nodo embrionario de ratón. El pequeño tamaño de los embriones gastrulating de ratón ~ E7.5 y la presencia de estas estructuras en la superficie los hacen ideales para el estudio mediante las técnicas descritas2,7,8. La disponibilidad de Buenos anticuerpos como marcadores T y cilios, da excelente información 3D usando WMIF en la estructura, organización y formación de estos organizadores embrionarios fundamentales8.
Porque el desarrollo embrionario del ratón avanza a un ritmo muy rápido y el nodo y la placa notocordal sólo transitoriamente presentes en la superficie del embrión, es esencial para el éxito de estos experimentos2,3. Por ejemplo, 2-4 embriones de somite son buenos para el análisis de SEM de un hoyo del nodo maduro con cilios largos. En embriones mucho antes o después (por ejemplo, 12 h antes o después), el nodo puede no ser presente en la superficie. WMIF es un poco más flexible en este sentido, pero las estructuras ellos mismos también son transitorias durante el desarrollo y el momento en este caso depende de los intereses de los investigadores.
La pureza de los reactivos es también esencial para el éxito de estas técnicas, especialmente en la ultraestructura de sondeo por SEM. Tiny las impurezas que se adhieren a los embriones generalmente resulta en enormes artefactos.
Hemos probado dos métodos de fijación de embriones para SEM uno con fijador de Karnovsky media (glutaraldehído al 2.5%, 2% paraformaldehído y 0.1 M tampón cacodilato) y un más simple glutaraldehído 2.5% en PBS 1 x. Preferimos utilizar el glutaraldehido y PBS fijador como se describe en el paso 1, sin embargo, nosotros y otros han también utilizado fijador de Karnovsky media con éxito para SEM.
También hemos comparado dos métodos de secado de los embriones para SEM y no encontró diferencias en la calidad de la muestra utilizando un secador de punto crítico o HMDS como se describe en el paso 1 y divulgado a otra parte14.
Para el paso 2, probamos incrustar los embriones después de los pasos de lavado final de 1% agarosa de fusión baja montado en un plato de fondo de cristal de 35 mm y luego rematar con ~ 10 μl de medio de montaje. Este método de empotrar funciona y conserva la original estructura 3D del embrión y las estructuras asociadas; sin embargo, un microscopio multifotón es necesaria para la muestra de la imagen porque un microscopio confocal regular no puede llegar tan profundo en los embriones intactos (~ 1 mm).
Creemos que con estas dos técnicas da información complementaria sobre la estructura del nodo y la placa notocordal durante el desarrollo normal como en mutantes que muestran defectos en la formación de estas estructuras.

Gastrulación y los movimientos morfogenéticos que son cruciales para formar el embrión de ratón1. Los cambios en la forma celular y organización durante la morfogénesis dictan información posicional para regular el destino celular y también permitir que las vías de señalización subsiguientes precisamente desempeñar sus funciones para diversificar el recién formado capas germinales1. La formación de estructuras de organización transitoria y señalización de centros como el nodo y el notocordio es esencial para la ejecución del programa de desarrollo2. Biólogos del desarrollo han utilizado una variedad de técnicas para el estudio de la morfogénesis de estas estructuras, más notables de los cuales es el uso de celulares y de los reporteros vivo ex vivo la proyección de imagen para seguir la dinámica en el comportamiento celular y subcelular2 ,3,4. En este informe, nos centramos en describir los detalles de nuestros protocolos optimizados para dos de estas técnicas: Análisis de microscopía electrónica (SEM) y todo Monte inmunofluorescencia (WMIF), que fueron y son todavía instrumentales en el estudio de la morfogénesis del nodo y la placa notocordal, el precursor de la notocorda.
El nodo embrionario de ratón es una taza de las células en forma de lágrima que se encuentra en la superficie ventral del embrión del ratón en el temprano a últimas etapas de la doble cabeza durante gastrulation y morfogénesis (día embrionario, E7.5-E8)2,5, 6,7. La placa notocordal morfológicamente emana anterior el nodo3. Cada célula en el nodo y la placa notocordal se caracteriza por un cilio único que sobresale hacia el exterior, que es mayor en las células del nodo pero cuya longitud varía con la etapa de desarrollo2. La rotación de los cilios en el hoyo de nodo se ha demostrado para ser importantes para la señalización que determina asimetría izquierda-derecha4. La placa notocordal es el precursor de la notocorda, el centro de señalización que es importante para el diseño de los somitas adyacentes y el tubo neural que3.
Debido a los atributos del lugar (superficie), forma (Copa) y que poseen distintas estructuras celulares exteriores (cilios), el SEM se ha utilizado tradicionalmente para visualizar el nodo y la placa notocordal y estudiar su formación y estructura de2, 7. SEM también se utiliza para estudiar los cambios en la estructura del nodo sí mismo o los cilios de sus células en las mutaciones que afectan la gastrulación, morfogénesis, así como la formación de cilios8,9,10. SEM es una técnica que utiliza un haz enfocado de electrones para interrogar la ultraestructura topológica de la superficie externa de materiales tales como muestras biológicas11. La muestra es generalmente fijo, secada y luego Farfulle-recubierta con metales para la observación bajo un microscopio electrónico de barrido como se describe en el paso 1.
WMIF es una técnica de tinción para visualizar productos del gen como las proteínas, en tres dimensiones (3D). WMIF de tejidos, órganos u organismos incluso enteros proporciona información espacial sobre la distribución de la señal y la forma de la estructura resultante en 3D. La técnica se basa en la fijación de la muestra entonces la coloración con los conjugados fluorescentes. Embriones de ratón ~ E7.5 son pequeñas y transparentes y por lo tanto ideal para protocolos WMIF visualizar el nodo y la placa notocordal. Por ejemplo, el factor de transcripción Barchyury (T) se expresa en los núcleos de la placa notocordal y el nodo y en menor medida en la línea primitiva, alrededor E7.5-E8 de desarrollo embrionario y buen trabajo anticuerpos contra T por WMIF son comercialmente disponibles y hacer posible el procedimiento de tinción. Las células de la placa notocordal y nodo también se caracterizan por las superficies apicales estrechas, cara el exterior y así pueden ser manchadas con Phalloidin conjugado fluorescencia marca F-actina en la constricción apical. Usando estos reactivos como ejemplos, la combinación de T y F-actina de tinción por WMIF proporciona una representación de la placa notocordal en 3D en embriones gastrulating de ratón y de nodo como se demuestra en el paso 2 8. Sin embargo, también pueden utilizarse marcadores de cilios, como ARL13B o tubulina acetilada, así como otros marcadores de la placa notocordal, como FOXA2 y nodo para realizar WMIF de ratón en desarrollo embriones de3,4.
Hemos demostrado que la proteína de interacción con striatin 1 (STRIP1) es esencial para gastrulation normal y morfogénesis en el embrión de ratón8. STRIP1 es un componente esencial de la interacción con striatin fosfatasas y complejos de cinasas (STRIPAK), que nosotros y otros han implicado en la actinia citoesqueleto organización8,12. Principales defectos en embriones mutantes Strip1 es en la formación del mesodermo axial (nodo y placa notocordal) y extensión del eje corporal antero-posterior. Hemos utilizado SEM y WMIF para analizar el nodo y la placa notocordal en wild-type (WT) y embriones mutantes Strip1 como se muestra en los Resultados de representante y cifras correspondientes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:843px;" width="842">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">1,1,1,3,3,3 Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td style="width:233px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:163px;">3840</td>
			<td style="width:161px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-T antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Critical Point Dryer</td>
			<td>Blazers Union</td>
			<td>CPD 020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4099,0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutardialdehyde solution 25%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1042390250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4974,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SEM coating unit PS3</td>
			<td>Agar Aids for Electron Microscopy</td>
			<td>PS3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SEM microscope Quantum FEG 250</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (FEI)</td>
			<td>Quantum FEG 250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence

El embrión de ratón tras el implante sufre cambios de forma importante tras el inicio de la gastrulación y la morfogénesis. Un rasgo distintivo de la morfogénesis es la formación de los organizadores transitorias, el nodo y la placa notocordal, de células que han pasado a través de la línea primitiva. La adecuada formación de estos centros de señalización es esencial para el desarrollo del plan corporal y técnicas para visualizarlos son de gran interés para los biólogos del desarrollo del ratón. El nodo y la placa notocordal se encuentran en la superficie ventral de embriones gastrulating de ratón embrionario día 7.5 (E) de desarrollo. El nodo es una estructura en forma de Copa, cuyas células poseen un cilio delgado solo cada. La adecuada localización subcelular y la rotación de los cilios en el hoyo de nodo determina la asimetría izquierda-derecha. Las células de la placa notocordal también poseen cilios sola aunque más cortas que las de las células del nodo. La placa notocordal forma la notocorda, que actúa como un organizador de señalización importante para somitogenesis y patrones neuronales. Porque las células de la placa notocordal y nodo transitoriamente presentes en la superficie y poseen cilios, ellos pueden ser visualizados mediante microscopía electrónica (SEM). Entre otras técnicas utilizadas para visualizar estas estructuras a nivel celular es todo montaje inmunofluorescencia (WMIF) usando los anticuerpos contra las proteínas que se expresaron altamente en el nodo y la placa notocordal. En este informe, describimos a nuestros protocolos optimizados para llevar a cabo la SEM y WMIF de la placa notocordal y nodo en embriones de ratón en desarrollo para ayudar en la evaluación de la forma de tejido y organización celular de tipo salvaje y mutante embriones de gastrulación.

Para examinar la formación del nodo en embriones mutantes WT y Strip1 en ~ E7.5, utilizamos SEM como se describe en el paso 1 y se muestra en la figura 18. Los detalles ultraestructurales de la topología exterior mediante SEM fueron bastante informativos y fue inmediatamente claro que a diferencia del nodo en forma de hoyo en embriones de WT, los embriones mutantes un nodo aplanado e irregular. Aumento mayor de los embriones mostró los característica cilios en las células del nodo que identificaron inequívocamente. La densidad aparente menor de cilios en el mutante podría ser atribuible a la pérdida de estructura del nodo hoyo y curvatura o un menor número de las células del nodo. La placa notocordal que aparece protección del nodo también fue irregular en los embriones mutantes. Eran identificables con sus cilios más cortos. Por lo tanto, era importante para revelar los defectos de la morfogénesis de nodo en Strip1 mutantes8SEM. También hemos utilizado SEM en estudios anteriores para demostrar la ausencia de cilios en el nodo embrionario de mutantes que carecen de centriolos, que proporciona la plantilla para cilios9.
Para estudiar los defectos de formación del mesodermo axial en embriones mutantes Strip1 a nivel celular, utiliza WMIF como se describe en el paso 2 como se muestra en la figura 2. Usando esta técnica, el nodo y la placa notocordal se identificaron fácilmente F-actina y T la coloración. Nodo de peso y las células de la placa notocordal han limitado dominios apicales donde F-actina se enriqueció, y tinción nuclear de T era evidente. La placa notocordal extendido rostral en el WT pero fue corto e irregular en el mutante. Los datos mostraron que la organización de la F-actina es anormal en las diferentes capas germinales de los embriones mutantes como el mesodermo axial8. Así, fue instrumental para el estudio de los defectos en el nodo y la formación de la placa notocordal en embriones mutantes de Strip1 WMIF.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58321/58321fig1.jpg"> Figura 1 . Microscopía electrónica de barrido revela los defectos en la morfogénesis del nodo en embriones de ratón mutante de Strip1 . (Top) Análisis de SEM de la WT y Strip1 mutante ventral embrionaria los nodos y placas notocordal (Noto)8. La izquierda se muestra un ejemplo de una imagen de bajo aumento de un embrión WT. (Parte inferior) Aumentos más altos del centro de los nodos que se muestra en la parte superior revela la larga monocilia que proyecta desde las células del nodo. Anterior es en todos los paneles. Barras de escala: 30 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58321/58321fig1large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58321/58321fig2.jpg"> Figura 2 . Todo Monte inmunofluorescencia muestra el nodo anormal y placa notocordal a nivel celular en embriones mutantes Strip1 . (Top) Ventral Render 3D (software de Volocity) de WMIF en embriones mutantes WT y Strip1 usando una combinación de conjugado fluorescencia phalloidin (F-actina, rojo) y tinción de anticuerpos (verde) T. (Parte inferior) Más ejemplos de la tinción se muestra sobretodo centrándose en el nodo con mayor zoom e incluyendo DAPI. Anterior es en todos los paneles. Barras de escala: 30 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58321/58321fig2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualización de la placa notocordal en embriones de ratón Gastrulating con microscopía electrónica e inmunofluorescencia de Monte todo y nodo

La placa notocordal y nodo son transitorios los organizadores en el desarrollo de embriones de ratón que pueden visualizarse mediante varias técnicas de señalización. Aquí, describimos en detalle cómo realizar dos de las técnicas para estudiar su estructura y morfogénesis: 1) microscopía electrónica de barrido (SEM); y 2) todo Monte inmunofluorescencia (WMIF).

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

El nodo y la placa notochordal son organizadores esenciales durante el desarrollo embrionario de ratón. Hoy describiremos dos técnicas utilizadas por los biólogos del desarrollo para visualizar y estudiar estas estructuras. En el primer protocolo, demostraremos cómo realizar la electro microscopía de escaneo, SEM y en el segundo, inmunofluorescencia de montaje completo.El nodo y la placa notochordal están presentes transitoriamente en la superficie del embrión en el día embrionario E7.75, énfasis pequeños cilios se proyectan hacia el exterior, lo que permite su identificación y visualización por SEM. En ambos protocolos, demostraremos pasos críticos en el manejo de los embriones de ratón relativamente pequeños y nos centraremos en cómo transferirlos y enrutarlos. Para empezar, abre el abdomen de un ratón embarazada eutanizado a través de la piel y los mesenterios.Usando tijeras y fórceps finos, retire el útero. Enjuague brevemente el útero en agua destilada y colóquelo en un pequeño plato de petri que contenga PBS. Luego, usa un microscopio diseccionado y fórceps finos para eliminar los músculos uterinos para liberar el decidui individual.Bajo el microscopio diseccionado, sostenga cada decidua con un par de fórceps y use otro par para hacer una incisión longitudinal de espesor completo entre la parte roja y la parte blanca. Realizar perforaciones superficiales verticalmente a lo largo de la parte blanca de la decidua, contigua con la incisión. Luego, separa la decidua horizontalmente en dos mitades y retira cuidadosamente el embrión de la parte blanca de la decidua.Después de esto, transfiera los embriones a un nuevo plato de petri que contenga PBS filtrado estéril. Retire la membrana de Reichert de cada embrión, comenzando en el cono ectoplacental. Para el genotipado futuro, retire un pequeño pedazo del saco de yema.Bajo una capucha química, transfiera los embriones a un tubo de microcentrífuga que contenga fijación de grado EM compuesto por 2,5% de glutaraldehído y PBS filtrado estéril. Después de esto, retire el fixitivo del tubo sin molestar los embriones. Lave los embriones tres veces en PBS estéril y filtrado durante 15 minutos a temperatura ambiente.Deshidratar los embriones en una serie de etanol durante cinco minutos cada uno, utilizando 50%70% y 85%etanol diluido en PBS. Lavar tres veces en 100% etanol. Almacene los embriones en 100% etanol a 20 grados centígrados, o continúe con el siguiente paso.Después de esto, transfiera los relieves a un recipiente apropiado y retire cualquier líquido restante. Añadir HMDS y etanol en una proporción de uno a uno a los embriones durante 30 minutos. A continuación, retire el líquido y agregue HMDS puro durante 30 minutos.Retire el líquido de los embriones con una pipeta y dé y deje que se sequen durante 30 minutos. Utilice un cepillo pequeño y cinta adhesiva de doble cara para montar los embriones secos en los talones SEM, con los lados ventrales hacia arriba. Inserte los talones en una máquina de recubrimiento de pulverización para el recubrimiento de partículas de oro.Uno de los pasos más delicados de la partícula SEM es montar los embriones en la orientación correcta en el talón. Una vez que el embrión aterriza en la cinta, la orientación ya no se puede cambiar. Después de esto, coloque los talones recubiertos en un microscopio SEM, aplique un vacío y observe los ganglios embrionarios y las células de placa notochordal con cilios.Después de extraer los embriones en E7.75, colóquelos en PBS Tween en un plato de petri sobre hielo. Bajo una capucha química, transfiera los embriones a un tubo de microcentrífuga que contenga solución fijativa. Después de esto, retire el fijador del tubo, teniendo cuidado de no tocar los embriones.A continuación, lave los embriones tres veces en PBS que contenga 0,2%Tritón X-100 durante 5 minutos a temperatura ambiente en una coctelera nutrida. Retire el último lavado de los embriones y añada una solución de bloqueo que contenga PBS Triton, con un 10% de suero inactivado por calor. Bloquee los embriones durante al menos dos horas en un nutator a cuatro grados centígrados.A continuación, retire el bloqueo y añada aproximadamente un mililitro de anticuerpo primario diluido en la solución de bloqueo. Incubar los embriones durante la noche en un nutator a cuatro grados centígrados. Retire el anticuerpo primario y guárdelo para su uso posterior.Luego, enjuague los embriones con PBS Triton dos veces. Y lávelos tres veces durante 30 minutos en un nuttor. Sustituya el lavado por el anticuerpo secundario conjugado de florescencia diluida contra la especie huésped principal de anticuerpos.Y incubar durante la noche en un nutator a cuatro grados centígrados. A continuación, retire el anticuerpo secundario y enjuague los embriones con PBS Triton dos veces. Antes de lavar tres veces durante 30 minutos con PBS Triton.Sustituya el último lavado por PBS Triton que contenga faloide conjugado de florescencia diluida y DAPI diluido y manche durante una hora a temperatura ambiente. Luego, enjuague los embriones dos veces en PBS Triton. Y lávelos con PBS Triton durante 30 minutos a temperatura ambiente.Después de esto, reemplace el PBS Triton con PBS y deje los embriones en hielo. A continuación, prepare diapositivas limpias y cargadas positivamente, resbalones de cubierta y medios de montaje acuosos a base de glicerol. Coloque dos piezas de cinta transparente a 15 milímetros de distancia entre sí en la diapositiva.Luego, bajo el microscopio de disección, utilice una pipeta P200 modificada para mover un embrión a la diapositiva. Usando fórceps finos, haz dos cortes completos en los lados laterales del saco de yema para desplegar el embrión. A continuación, coloque el embrión con el lado ventral hacia arriba.Añadir 50 microlitros de medios de montaje al embrión. A continuación, agregue un toque de soporte de montaje al resbalón de la cubierta. Colóquelo a lo medio de los dos trozos de cinta adhesiva y bájalo lentamente sobre los embriones usando una aguja doblada.Utilice una toallita absorbente para eliminar el exceso de medios de montaje, teniendo cuidado de no mover el resbalón de la cubierta. Luego, usa una generosa cantidad de esmalte de uñas para sellar los lados del resbalón de la cubierta. Por último, utilice un microscopio confocal de exploración para observar los embriones.Es fundamental no mover el resbalón de la cubierta después de montarlo sobre los embriones, ya que puede distorsionarlos para la visualización 3D. Usando microscopía electrónica de barrido, se observó la formación del nodo en un tipo salvaje y despojar a un embrion de ratón mutante en E7.75. A diferencia del nodo en forma de pozo en el tipo salvaje, los embriones mutantes mostraban un nodo aplanado y un nodo regular y una placa nodalcordal.Todo ahora a la inmunofluorescencia se utilizó para estudiar los defectos de formación de placas de nodo y notochordal en embriones mutantes Strip 1 a nivel celular. Los datos mostraron que eran anormales y atrofiados en los embriones mutantes. El nodo y la placa nodalcortal sólo están presentes transitoriamente en la superficie del embrión, por lo tanto, la sincronización es esencial para el éxito del SEM.Por ejemplo, dos a cuatro embriones de somita son buenos para el análisis SEM de un nodo maduro con cilios largos. Los reactivos de pureza también son esenciales para el éxito de estas técnicas, especialmente en el sondeo de la ultraestructura por SEM. Pequeñas impurezas que se adhieren al embrión generalmente resultan en enormes artefactos.Creemos que estas dos técnicas proporcionan información complementaria sobre la estructura del nodo y la placa nodalcortal durante el desarrollo normal y en mutantes que muestran defectos en la formación de estas estructuras.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Imágenes de contraste en embriones de ratón Uso de alta frecuencia de ultrasonido

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy Nanotomy of Healthy and Injured Zebrafish Brain

A gran escala de barrido Microscopía Electrónica de Transmisión (Nanotomy) de pez cebra cerebrales saludables y lesionados

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution electron microscopy. Others and we previously ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

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Multi-objetivo Cromogénico Todo el montaje<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación para comparar dominios de expresión génica en<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Métodos para examinar los nódulos linfáticos y en los hemocitos<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Cultura de órganos y todo el montaje Inmunofluorescencia La tinción de mouse de Wolff Conductos

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualización de las células Multiciliated en el pez cebra a través de un protocolo combinado de todo Monte fluorescente In Situ hibridación e inmunofluorescencia

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Análisis de la inmunofluorescencia de Whole-mount cuantitativa de las poblaciones progenitoras cardiacas en embriones de ratón

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Proyección de imagen multimodal jerárquica de secciones seriadas para encontrar dianas celulares específicas dentro de grandes volúmenes

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Todo Monte inmunofluorescencia y cuantificación del folículo de los ovarios de ratón cultivadas

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

Análisis del desarrollo de la cámara cardiaca durante la embriogénesis de ratón usando todo de Monte de epifluorescencia

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...