Name: visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence
Uploaded: 2018-11-06T13:30:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence at JoVE.com

HB Tıp Fakültesi ve SFB829 Köln Üniversitesi başlangıç fon tarafından desteklenir. C.X. DFG tarafından desteklenmektedir BA 5810/1-1 izni. CECAD araştırma merkezi ve Memorial Sloan Kettering Kanser Merkezi (New York, ABD) görüntüleme olanakları teşekkür etmek istiyorum. Joaquín Grego-Bessa (İspanyolca ulusal merkezi kardiyovasküler araştırma, Madrid, İspanya) embriyo WMIF için montaj üzerinde onun anlayış için teşekkür ediyoruz.

Tüm deneylerin hayvan deneyleri içeren Kuzey Rhein Vestfalya (LANUV-NRW) sorumlu yetkililer tarafından kabul edildi.
1. Tarama elektron mikroskobu fare embriyonik düğümünün
<ol><li>Hamile kadın fare, kurban ~ E7.5 (2-4 somite sahne) servikal çıkığı tarafından. Adımları 1.1 - diyagramları ile ayrıntılı bir açıklama 1.7 fare embriyo laboratuvar kılavuzları13' te kullanılabilir.</li>
	<li>Karın deri ve mesenteries açın ve makas ve iyi forseps kullanarak rahim çıkarın.</li>
	<li>Kısa bir süre içinde distile su rahim durulama ve küçük temiz Petri kabına (6 cm) içeren 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x yerleştirin.</li>
	<li>Bir mikroskop anatomi ve iyi forseps kullanarak altında bireysel deciduae veya implantasyon siteleri ücretsiz için Rahim kasları kaldırın.</li>
	<li>Her decidua forseps bir çift ile tutun ve diğer çift kırmızı bölümü (gelecekteki plasenta) ve beyaz kısmı (embriyo olduğu) arasındaki boyuna bir tam-kalınlık kesi yapmak için kullanın. Decidua beyaz kısmı boyunca dikey olarak yüzeysel delikler kesi ile bitişik olun. Decidua yatay olarak tamamlayan bir başka ayır ve dikkatle decidua beyaz kısmında embriyo dışarı kepçe.</li>
	<li>Taze steril filtre PBS ile yeni Petri kabına (35 mm) embriyo transfer edin. Tüm deciduae/embriyo için yineleyin.</li>
	<li>Reichert'ın membran kaldırmak için embriyo içine çeken nispeten opak bir membran alay tarafından her embriyo o uzakta gibi ectoplacental koni (kırmızımsı implantasyon sitesi) başlayan bir çorap. Genotipleme için küçük bir parça alın (~ 0,1 mm2) Bu aşamada sarısı kesesinin.</li>
	<li>Kimyasal kukuIeta ve uygun koruma (eldiven) giyen altında EM sınıf sabitleştirici % 2.5 oxazolidin steril filtre PBS oda sıcaklığında bir microcentrifuge (1,5 mL) tüp içinde oluşan embriyoların aktarın. Embriyo gecede 4 ° C'de düzeltmek</li>
	<li>Dikkatle embriyo dokunmadan tüpünden oxazolidin sabitleştirici kaldırmak ve uygun bir atık kap içinde. Embriyolar üç kez 15 dakika her oda sıcaklığında steril filtre PBS yıkayın.</li>
	<li>Embriyo 5 min için etanol dizi kurutmak: % 50, % 70, % 85 ve % 100 veya mutlak etanol içinde üç kez. −20 ° C de embriyo etanol depolamak veya doğrudan bir sonraki adıma geçin.</li>
	<li>Kritik noktası (GBM) bir kritik nokta makinesi kurutma için sepetler etanol embriyo transfer edin. Odası sepetleri tamamen karşılamak için etanol ile doldurun.</li>
	<li>Etanol dikkatle sıvı CO2 ile 10 ° C'de 10 kat için temizlenerek değişimi Odası yarı dolu olduğu kadar sıvı CO2 sonra son adım drenaj. İlâ 40 ° C ısı kadar basınç 80 bar (kritik nokta) ulaşır ve sıvı CO2 gaz için değiştirir. 10 dakikadır bekleyin sonra yavaş yavaş gaz kapalı yaklaşık 45 dakika içinde havaya.</li>
	<li>Kurutma için daha kolay bir alternatif CPD için hexamethyldisilazane (HMDS) 1:1 oranında embriyo etanol için 30 dk içinde ekleyin. Sonra embriyo bir pipet kullanarak sıvı dışarı 30 dk. Kaldır için saf HMDS embriyo transfer ve 30 dk kurumaya bırakın. Not: Her iki kurutma yöntem amele aynı derecede de bizim ellerde.</li>
	<li>İnce fırça çift taraflı bant ile bir SEM saplama üzerinde yukarı ventral yüzü (düğüm) kurutulmuş embriyo bağlamak için kullanın.</li>
	<li>Koçanları olan embriyoların bir sputter kaplama Makinası uzun ince kirpikler şarj etmek için tercih edilen altın parçacık kaplama için ekleyin. 120-150 bir tabaka uygulayın Å; zaman her örnek ile değişir mevcut üzerinde bağlıdır.</li>
	<li>Embriyo ile kaplı taslakları bir SEM mikroskobu yerleştirin, vakum uygulamak ve embriyonik düğüm ve 1000 X 15'e kadar büyütme, kirpikler hücrelerle notochordal plaka gözlemlemek 000 X.</li>
</ol>2. bütün Dağı ayirt fare düğüm ve Notochordal plaka
<ol><li>Buz gibi PBS ile % 0.05 kullanarak ara 20 (PBSTw), E7.75, embriyo kaldırmak ve PBSTw 35 mm Petri kabına buz üzerinde yer onları 1.1-1.7 Yukarıdaki adımları izleyin.</li>
	<li>Kimyasal bir başlık ve uygun koruma (eldiven) giyen altında embriyo PBS içinde %4 paraformaldehyde microcentrifuge tüp içinde bir sabitleştirici çözüm aktarın. Embriyo gecede 4 ° C'de düzeltmek</li>
	<li>Dikkatle embriyo dokunmadan tüpünden paraformaldehyde sabitleştirici kaldırmak ve uygun bir atık kap içinde. Embriyolar üç kez % 0,2 içeren PBS yıkama Triton X-100 (PBSTr) Oda sıcaklığında her 5 min için. Bir nutating shaker tüm yıkama ve sonraki kuluçka adımları gerçekleştirin.</li>
	<li>Son yıkama kaldırın ve % 10 ısı inaktive serum (ikincil antikor ana bilgisayar türlerden) ile PBSTr içeren engelleme çözüm ekleyin. 2 h blok için gece (veya daha uzun) bir nutator 4 ° C'de</li>
	<li>Belgili tanımlık kütük parçası kaldırmak ve eklemek ~ çözüm, örneğin bir anti-T antikor 1:500 seyreltme, engelleme seyreltilmiş birincil antikor 1 mL. Gecede (veya daha uzun) bir nutator 4 ° C'de üzerinde kuluçkaya</li>
	<li>Birincil antikor kaldırmak ve sodyum azid %0.02 (1 µL % 20 hisse için 1 mL antikor çözeltisi) son bir konsantrasyon ekleyerek daha sonra kullanmak üzere kaydedin. Antikor yeniden kullanılabilir ~ 10 kat. İki kez PBSTr ile embriyo durulama ve sonra onları bir nutator 4 ° C'de üzerinde her 30 dk için üç kez yıkamak</li>
	<li>Seyreltilmiş birincil antikor ana türler karşı Floresan Birleşik bir ikincil antikor, yıkama yerine ~ 1: 1000 gecede (veya daha uzun) bir nutator 4 ° C'de üzerinde</li>
	<li>İkincil antikor kaldırmak ve iki kez PBSTr, o zaman 30 dk ile PBSTr için üç kez yıkama ile durulayın.</li>
	<li>Son yıkama F-aktin ve 1: 1000 DAPI, çekirdek, oda sıcaklığında 1 h için leke leke 1:500 phalloidin, floresans Birleşik içeren PBSTr ile değiştirin.</li>
	<li>PBSTr iki kez yıkayın ve bir kez, oda sıcaklığında 30 dakika PBSTr ile yıkayın.</li>
	<li>PBSTr PBS ile değiştirin ve embriyoların buz üzerinde bırakın. Temiz olumlu tahsil slaytlar (60 x 24 mm) ve coverslips (24 x 24 mm) ve sulu montaj gliserol tabanlı medya, örneğin, 1xPBS % 90 gliserol ve embriyoların takmak için bir antifade reaktifi hazırlayın.</li>
	<li>Uzaklıkta açık bant iki adet koyun ~ 15 mm birbirinden slayt açık kısmında. Bu embriyoların düzleştirme ama tamamen onlara squishing sağlayacak yeterli 3B alanda (Z boyut) oluşturur.</li>
	<li>Diseksiyon mikroskop altında dikkatli bir şekilde kesilmiş bir P200 pipet (embriyo transfer ve zarar görmediğinden için yeterli alan izin vermek için) kullanarak slayda embriyo taşıyın.</li>
	<li>İyi forseps kullanarak, iki tam kesim sac sarısı embriyo açılmak için yan tarafta yapmak. Ventral yan (düğüm ve notochordal plaka) kadar ile embriyo (slaytta aşağı nöral tüp, dorsal) yerleştirin.</li>
	<li>Medya embriyo üzerinde montaj 50 µL ekleyin. 4-5 embriyo slayt başına yerleştirin. İlk slayt (üst veya alt tarafı) touch, daha sonra iki adet bant straddling yerleştirin ve hava kabarcıkları oluşturma kaçınırken iyi forseps veya bükülmüş ince iğne kullanarak embriyo üzerine yavaşça indirin medya coverslip tarafına montaj bir kurulamak ekleyin.</li>
	<li>Aşırı montaj medya emici bir temizleme işlemi kullanarak temizleyin. Bu süreç içinde coverslip oynatmamaya dikkat et.</li>
	<li>Tırnak cilası bol miktarda kullanarak, coverslip tarafına hareket ettirmeden kapatın.</li>
	<li>Tarama confocal mikroskop altında gözlemlemek.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rivera-P&#233;rez, J. A., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+morphogenesis+in+the+early+mouse+embryo.">The dynamics of morphogenesis in the early mouse embryo.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2015).</li><li>Lee, J. D., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+node+and+notochord:+The+cellular+basis+for+the+establishment+and+maintenance+of+left-right+asymmetry+in+the+mouse.">Morphogenesis of the node and notochord: The cellular basis for the establishment and maintenance of left-right asymmetry in the mouse.</a> Developmental Dynamics. 237 (12), 3464-3476 (2008).</li><li>Balmer, S., Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notochord+morphogenesis+in+mice:+Current+understanding+and+open+questions.">Notochord morphogenesis in mice: Current understanding and open questions.</a> Developmental Dynamics. 245 (5), 547-557 (2016).</li><li>Yoshiba, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilia+at+the+node+of+mouse+embryos+sense+fluid+flow+for+left-right+determination+via+Pkd2.">Cilia at the node of mouse embryos sense fluid flow for left-right determination via Pkd2.</a> Science. , (2012).</li><li>Jurand, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+aspects+of+the+development+of+the+notochord+in+mouse+embryos.">Some aspects of the development of the notochord in mouse embryos.</a> Journal of Embryology and Experimental Morpholog. 32 (1), 1-33 (1974).</li><li>Poelmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+head-process+and+the+formation+of+the+definitive+endoderm+in+the+mouse+embryo.">The head-process and the formation of the definitive endoderm in the mouse embryo.</a> Anatomy and Embryology (Berl). , 41-49 (1981).</li><li>Sulik, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+murine+node+and+notochordal+plate.">Morphogenesis of the murine node and notochordal plate.</a> Developmental Dynamics. 201 (3), 260-278 (1994).</li><li>Bazzi, H., Soroka, E., Alcorn, H. L., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STRIP1,+a+core+component+of+STRIPAK+complexes,+is+essential+for+normal+mesoderm+migration+in+the+mouse+embryo.">STRIP1, a core component of STRIPAK complexes, is essential for normal mesoderm migration in the mouse embryo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (51), 10928-10936 (2017).</li><li>Bazzi, H., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acentriolar+mitosis+activates+a+p53-dependent+apoptosis+pathway+in+the+mouse+embryo.">Acentriolar mitosis activates a p53-dependent apoptosis pathway in the mouse embryo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 1491-1500 (2014).</li><li>Huangfu, D., Liu, A., Rakeman, A. S., Murcia, N. S., Niswander, L., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signalling+in+the+mouse+requires+intraflagellar+transport+proteins.">Hedgehog signalling in the mouse requires intraflagellar transport proteins.</a> Nature. 426 (6962), 83-87 (2003).</li><li>McMullan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy+1928-1965.">Scanning electron microscopy 1928-1965.</a> Scanning. 17 (3), 175-185 (2006).</li><li>Bai, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+set+of+conserved+and+new+regulators+of+cytoskeletal+organization,+cell+morphology+and+migration.">Identification and characterization of a set of conserved and new regulators of cytoskeletal organization, cell morphology and migration.</a> BMC Biology. 9, (2011).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Vintersen Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+the+Mouse+Embryo:+A+Laboratory+Manual,+Fourth+Edition.">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Fourth Edition.</a> Cold Harb Lab Press. , (2014).</li><li>Braet, F., De Zanger, R., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drying+cells+for+SEM,+AFM+and+TEM+by+hexamethyldisilazane:+a+study+on+hepatic+endothelial+cells.">Drying cells for SEM, AFM and TEM by hexamethyldisilazane: a study on hepatic endothelial cells.</a> Journal of Microscopy. 186, 84-87 (1997).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu çalışmada, SEM ve WMIF fare embriyonik düğüm ve notochordal plaka görselleştirmek için gerçekleştirmek nasıl gösterir. Gastrulating fare embriyo küçük boyutunu ~ E7.5 ve bu yapıların yüzeyi varlığı teknikleri açıklanan2,7,8kullanarak eğitim ideal yapan. T ve kirpikler işaretleri gibi iyi antikorlar kullanılabilirliğini yapısı, organizasyonu ve bu temel embriyonik organizatörler8oluşumu WMIF kullanarak mükemmel 3D bilgileri verir.
Fare embriyonik gelişim çok hızlı bir tempoda devam eder ve düğüm ve notochordal plaka sadece geçici embriyo yüzeyinde mevcut oldukları için zamanlama bu deneyler2,3başarı için önemlidir. Örneğin, 2-4 somite embriyo olgun düğüm çukur uzun kirpikler ile SEM çözümlenmesi için iyidir. Çok daha erken ya da daha sonra embriyo (örneğin, 12 h önce veya sonra), düğüm yüzeyinde mevcut olmayabilir. WMIF bu konuda biraz daha esnek ama yapıları kendilerini geliştirme sırasında da geçici ve zamanlama Bu durumda araştırmacıların çıkarları üzerinde bağlıdır.
Reaktifleri saflığı da bu tekniklerin başarısı için çok önemlidir özellikle embriyolar için genellikle sopa SEM Tiny yabancı maddeler tarafından ultrastructure sondalama içinde büyük aktarımında neden.
Embriyo fiksasyon SEM bir için iki farklı yöntem test ettiğimiz yarım Karnovsky'nın sabitleştirici (% 2.5 oxazolidin, % 2 paraformaldehyde ve 0.1 M cacodylate arabellek) ve basit bir % 2.5 oxazolidin 1 x PBS kullanarak. 1. adımda açıklandığı gibi PBS sabitleştirici ve oxazolidin kullanmayı tercih, ancak, biz ve diğerleri de yarım Karnovsky'nın sabitleştirici başarıyla SEM için kullandık
Ayrıca SEM için embriyo kurutma için iki yöntem karşılaştırıldığında ve kritik nokta kurutma makinesi veya 1. adımda açıklandığı gibi HMDS kullanarak örnek kalitesini fark bulundu ve başka bir yerde14bildirdi.
Adım 2 için test ettik % 1 düşük erime özel son yıkama adımda bir 35 mm cam alt çanağı monte sonra embriyo yerleştirmesi ve sonra onunla Tepesi ~ 10 µL montaj orta. Bu gömme yöntemi çalışır ve embriyo orijinal 3D yapısı ve ilişkili yapıları korur; Ancak, multiphoton mikroskop düzenli confocal mikroskop sağlam embriyo derin ulaşamıyorum çünkü örnek görüntü için gereklidir (~ 1 mm).
Biz bu iki teknikleri kullanarak normal gelişim sırasında ve bu yapıların oluşumuna hataları gösteren mutantlar tamamlayıcı bilgileri yapısı düğümü ve notochordal plaka üzerinde verir inanıyorum.

Gastrulasyon ve beraberindeki morfogenetik hareketleri fare embriyo1şekillendirme için önemlidir. Hücresel şekli ve organizasyon morfogenez sırasında değişiklikleri hücre kader düzenleyen ve tam olarak yeni kurulan mikrop katmanlar1çeşitlendirmek için onların işlevleri gerçekleştirmek takip eden sinyal yollar sağlamak konumsal bilgi dikte. Gelişim programı2yürütülmesi için gerekli geçici yapıları düzenleme ve merkezleri düğüm ve notochord gibi sinyal oluşumdur. Gelişimsel biyologlar morfogenez bu yapıların en önemli hücresel gazetecilere ve canlı ex vivo hücre ve hücre altı davranış2 dinamikleri takip için görüntüleme kullanımı olduğu eğitim için çeşitli teknikler kullanmış ,3,4. Bu raporda, biz iki bu teknikler için en iyi duruma getirilmiş Protokolümüze ayrıntılarını açıklayan üzerinde odaklanmak: scanning elektron mikroskobu (SEM) ve bütün Dağı ayirt (WMIF), ve morfogenetik düğüm eğitim hala enstrümantal ve notochordal plaka, notochord habercisi.
Fare embriyonik düğüm gastrulasyon ve morfogenetik (embriyonik gün, E7.5-E8) sırasında geç baş kat aşamaları için erken etrafında fare embriyo ventral yüzeyinde bulunan bir gözyaşı damlası şeklindeki hücreler, bu,2,5, 6,7. Notochordal plaka morfolojik anteriorly düğüm3hayran kalacaksınız. Düğüm ve notochordal plaka her hücrede hangi düğümü hücrelerinde uzundur ama uzunluğu ile gelişimsel sahne2değişir dışına çıkıntı bir tek cilium karakterizedir. Kirpikler düğüm çukurunda dönüşü-sol asimetri4belirleyen sinyal için önemli olduğu gösterilmiştir. Notochordal plaka notochord bitişik somites ve üstteki nöral tüp3desenlendirme için önemlidir sinyal merkezi öncüsüdür.
Konum (yüzey), şekil (kupa) ve farklı dış hücresel yapılar (kirpikler) sahip özniteliklerini nedeniyle SEM düğüm ve notochordal plaka görselleştirmek ve onların oluşumu ve yapısı2, çalışma için geleneksel olarak kullanılmıştır 7. SEM de düğümü kendisini veya gastrulasyon, morfogenez gibi kirpikler oluşumu8,9,10etkiler mutasyonlar hücrelerine üzerinde kirpikler yapısını değişiklikleri incelemek için kullanılır. SEM odaklanmış ışın demeti elektron topolojik ultrastructure biyolojik örnekler11gibi malzemelerin dış yüzeyinin sorgulamaya kullanan bir tekniktir. Örnek genellikle sabit, kurutulmuş ve sonra sputter-metaller gözlem bir taramalı elektron mikroskobu altında için adım 1'de tarif olarak kaplanmış.
WMIF gen ürünleri, proteinler, üç-boyutlu (3D) gibi görselleştirmek için boyama bir tekniktir. WMIF dokuları, organları veya hatta bütün organizmalar kayma dağıtım işaret ve şekli 3D elde edilen yapısının Kılavuzu. Teknik sonra floresan conjugates ile boyama örnek gidermek için temel alır. Fare embriyo ~ E7.5 küçük ve şeffaf ve bu nedenle düğüm ve notochordal plaka görselleştirmek WMIF iletişim kuralları için ideal. Örneğin, Barchyury (T) çekirdek düğüm ve notochordal plaka ve daha az bir ölçüde de E7.5-E8 embriyonik gelişim ve T WMIF tarafından karşı iyi çalışma antikor çevresinde ilkel çizgi ile ifade edilir transkripsiyon faktörü olan ticari olarak kullanılabilir ve boyama işlemi mümkün kılar. Düğüm ve notochordal plaka hücreleri de dış yüzü ve böylece ile floresan Birleşik Phalloidin işaretine F-aktin, apikal boğumların boyanabilen dar apikal yüzeylerinde karakterizedir. Adım 2 8' göstermek gibi bu reaktifler örnek olarak kullanarak, T ve F-aktin WMIF tarafından boyama düğüm ve 3D notochordal tabak gastrulating fare embriyosu içinde bir gösterimini sağlar. Ancak, kirpikler, ARL13B veya acetylated tübülin yanı sıra düğümü ve notochordal plaka, FOXA2 gibi diğer işaretleri gibi işaretleri WMIF gelişmekte olan fare embriyo3,4üzerinde gerçekleştirmek için de kullanılabilir.
Striatin-etkileşim protein 1 (STRIP1) normal gastrulasyon ve morfogenetik fare embriyo8için gerekli olduğunu göstermiştir. STRIP1 striatin-etkileşim fosfatazlar ve kinazlar kompleksleri (STRIPAK), biz ve diğerleri içinde aktin sitoiskeleti organizasyon8,12karıştığı bir çekirdek bileşenidir. Bir büyük Strip1 mutant embriyo aksiyel mesoderm (düğüm ve notochordal plaka) oluşumu ve uzantısı antero-posterior vücut eksen kusurdur. SEM ve WMIF Temsilcisi sonuçları ve karşılık gelen rakamlar gösterdiği gibi düğüm ve vahşi-tipi (WT) ve Strip1 mutant embriyo notochordal plaka analiz etmek için kullandım.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:843px;" width="842">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">1,1,1,3,3,3 Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td style="width:233px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:163px;">3840</td>
			<td style="width:161px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-T antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Critical Point Dryer</td>
			<td>Blazers Union</td>
			<td>CPD 020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4099,0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutardialdehyde solution 25%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1042390250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4974,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SEM coating unit PS3</td>
			<td>Agar Aids for Electron Microscopy</td>
			<td>PS3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SEM microscope Quantum FEG 250</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (FEI)</td>
			<td>Quantum FEG 250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence

Sonrası implantasyon fare embriyo büyük şekil değişikliklerini gastrulasyon ve morfogenetik başlanmasından sonra uğrar. Morfogenez geçici organizatörleri, düğüm ve ilkel çizgi geçti hücrelerden notochordal plaka oluşumunu özelliğidir. Bu sinyal gönderme merkezlerinin uygun oluşumu vücut planı gelişimi için önemlidir ve teknikleri onları görselleştirmek için fare gelişimsel biyologlar yüksek ilgi. Düğüm ve notochordal plaka gastrulating fare embriyo embriyonik gün (E) kalkınma 7.5 ventral yüzeyinde yalan. Düğüm olan hücreleri bir tek ince cilium her sahip Kupası şeklindeki bir yapıdır. Uygun hücre altı yerelleştirme ve düğüm çukurunda kirpikler döndürme-sol asimetri belirler. Notochordal plaka hücreleri daha kısa da olsa bu düğüm hücrelerinin daha tek kirpikler de sahip olmak. Notochordal plaka somitogenesis ve sinirsel desenlendirme için önemli bir sinyal düzenleyici görevi gören notochord oluşturur. Düğüm ve notochordal plaka hücrelerinin yüzeyinde geçici varsa ve kirpikler sahip çünkü onlar Tarama elektron mikroskobu (SEM) kullanarak görüntülenmeyecektir. Görselleştirmek için kullanılan diğer teknikler arasında bu yapıların hücresel düzeyde son derece düğüm ve notochordal plaka ifade edilir proteinler karşı antikor kullanarak bütün Dağı ayirt (WMIF) olduğunu. Bu raporda, SEM ve düğüm ve notochordal plaka WMIF doku şekli ve vahşi-türü hücresel kuruluşta değerlendirmede yardımcı olmak için gelişmekte olan fare embriyo ve gastrulasyon mutant embriyo gerçekleştirmek için en iyi duruma getirilmiş bizim iletişim kurallarını açıklar.

WT ve Strip1 mutant embriyolar düğümünde oluşumunu incelemek için ~ E7.5, 1. adımda açıklandığı ve gösterilen Şekil 18olarak SEM kullanılan biz. SEM kullanarak dış topolojisi ultrastructural ayrıntılarını oldukça bilgilendirici ve çukur şeklindeki düğümünde WT embriyolar, basık ve düzensiz düğüm mutant embriyo vardı hemen açıktı. Embriyoların daha yüksek büyütme karakteristik kirpikler belirsizliğe yer bırakmadan tanımlanan düğüm hücreleri üzerinde gösterdi. Kirpikler mutant içinde belirgin daha düşük yoğunluk düğüm çukur yapısı ve eğrilik veya sayı düğümü hücre kaybı atfedilebilecek olabilir. Düğümden yayılan görünen notochordal plaka da mutant embriyo düzensiz oldu. Onlar daha kısa onların kirpikler ile tanımlanabilir. Bu nedenle, SEM düğüm morfogenez kusurları Strip1 mutantlar8ortaya çıkarmak önemliydi. Biz de kirpikler yokluğu kirpikler9için şablon sağlamak centrioles yoksun mutantlar embriyonik düğümünü göstermek için önceki çalışmalarda SEM kullandık.
Aksiyel mesoderm oluşumu ekranlarda Strip1 mutant embriyo hücresel düzeyde bulunan, biz WMIF olarak 2. adımda açıklanan ve Şekil 2gösterilen çalışırdım. Bu tekniği kullanarak, düğüm ve notochordal plaka kolayca F-aktin ve T boyama tarafından tespit edilmiştir. WT düğüm ve notochordal plaka hücreleri burada F-aktin zenginleştirilmiş ve nükleer T boyama belirgin apikal etki alanları dar. Notochordal plaka rostrally WT genişletilmiş ama kısa ve mutant içinde düzensiz. Verileri F-aktin organizasyon mutant embriyo aksiyel mesoderm8de dahil olmak üzere farklı mikrop katmanlarda anormal olduğunu gösterdi. Böylece, WMIF düğüm hatalarını ve Strip1 mutant embriyo notochordal plaka oluşumunda etkili oldu.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58321/58321fig1.jpg"> Resim 1 . Elektron mikroskobu tarama Strip1 mutant fare embriyo düğüm morfogenez hataları ortaya çıkarır. (Üst) SEM analizleri WT ve Strip1 mutant ventral embriyonik düğümlerin ve notochordal tabak (Noto)8. Örnek WT embriyo düşük büyütme görüntünün sol tarafta gösterilir. (Alt) Üst düğüm hücrelerden projelendirme uzun monocilia ifşa gösterilen düğümlerinin merkezinin daha yüksek büyütme. Önünde bütün panellerde doldu. Ölçek çubukları: 30 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58321/58321fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58321/58321fig2.jpg"> Resim 2 . Bütün Dağı ayirt Strip1 mutant embriyo anormal düğüm ve hücresel düzeyde notochordal plaka gösterir. (Üst) Ventral 3D render (Volocity yazılımı) WMIF floresan Birleşik phalloidin (F-aktin, kırmızı) ve T antikor (yeşil) boyama'nin birleşimiyle WT ve Strip1 mutant embriyo üzerinde. (Alt) Daha fazla örnek daha yüksek zoom ile düğüm üzerinde odaklanan ve DAPI dahil olmak üzere yukarıda gösterilen boyama. Önünde bütün panellerde doldu. Ölçek çubukları: 30 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58321/58321fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence at JoVE.com

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Düğüm ve Notochordal plaka Gastrulating fare embriyo Tarama elektron mikroskobu ve bütün Dağı ayirt kullanarak görselleştirme

Düğüm ve notochordal plaka gelişmekte olan çeşitli teknikler kullanarak görüntülenir fare embriyo organizatörler sinyal geçici. Burada, biz iki çalışma onların yapısı ve morfogenetik bozmak nasıl ayrıntılı olarak tarif: 1) Tarama elektron mikroskobu (SEM); ve 2) bütün Dağı ayirt (WMIF).

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Düğüm ve notochordal plaka fare embriyonik gelişimi sırasında temel organizatörlerdir. Bugün, gelişimbiyologları tarafından bu yapıları görselleştirmek ve incelemek için kullanılan iki tekniği açıklayacağız. İlk protokolde, taramalı elektro mikroskopi, SEM ve ikinci protokole monte immünfloresans nasıl yapılacağını göstereceğiz.Düğüm ve notoraktal plaka geçici embriyo gün E7.75 de embriyo yüzeyinde mevcut, vurgu küçük cilia dışında, onların kimlik ve SEM tarafından görselleştirme sağlayan yansıtMaktadır. Her iki protokolde de, nispeten küçük fare embriyolarının işlenmesinde kritik adımlar göstereceğiz ve bunları nasıl aktarıp yönlendireceğimiz üzerinde odaklanacağız. Başlamak için, deri ve mezenterler aracılığıyla bir ötenazi hamile farenin karın açın.Makas ve ince forceps kullanarak, rahim kaldırın. Rahmi distile suda kısa bir süre durulayın ve PBS içeren küçük bir petri kabına yerleştirin. Sonra, bireysel decidui serbest etmek için rahim kasları kaldırmak için bir diseksiyon mikroskop ve ince forceps kullanın.Diseksiyon mikroskobu altında, her bir kesi bir çift forceps ile tutun ve kırmızı parçası ve beyaz parçası arasında uzunlamasına, tam kalınlıkta kesi yapmak için başka bir çift kullanın. Kesi ile bitişik, yaprak beyaz kısmı boyunca dikey yüzeysel delikler olun. Daha sonra, iki yarıya yatay ayrı yaprak çekin ve dikkatle decidua beyaz kısmından embriyo kaldırın.Bundan sonra, steril filtrelenmiş PBS içeren yeni bir petri kabına embriyolar transfer. Reichert'in zarını her embriyodan çıkarın, ektosental koniden başlayarak. Gelecekteki genotipleme için, sarısı kese küçük bir parça kaldırın.Kimyasal bir başlık altında, embriyoları %2,5 glutaraldehit ve steril filtreli PBS'den oluşan EM sınıfı fiksitif içeren bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bundan sonra, embriyolar rahatsız etmeden tüpten fiksatif kaldırın. Embriyoları steril, filtrelenmiş PBS'de oda sıcaklığında 15 dakika üç kez yıkayın.Embriyoları beşer dakika boyunca %50%70 ve PBS'de seyreltilmiş %85 etanol kullanarak susuz bırakın. %100 etanolde üç kez yıkayın. Embriyoları 20 santigrat derecede %100 etanolde saklayın veya bir sonraki adıma geçin.Bundan sonra, uygun bir gemiye embroyos aktarın ve kalan sıvı kaldırın. 30 dakika boyunca embriyolara bire bir oranında HMDS ve etanol ekleyin. Daha sonra sıvıyı çıkarın ve 30 dakika boyunca saf HMDS ekleyin.Bir pipet ile embriyolar sıvı çıkarın ve onları 30 dakika kurumasını bekleyin. Kurutulmuş embriyoları SEM saplarına monte etmek için küçük bir fırça ve çift taraflı bant kullanın. Altın parçacık kaplama için bir püskürtme kaplama makinesiiçine saplamalar yerleştirin.SEM parçacığının en hassas adımlarından biri, embriyoların doğru yönde saplama üzerine monte etmesidir. Embriyo kasete indikten sonra, oryantasyon artık değiştirilemez. Bundan sonra, bir SEM mikroskobu içine kaplamalı saplamalar yerleştirin, bir vakum uygulamak ve silya ile embriyonik düğümleri ve notochordal plaka hücreleri gözlemlemek.E7.75'teki embriyoları çıkardıktan sonra, pbs tween'de buz üzerinde bir petri kabına yerleştirin. Kimyasal bir başlık altında, fiksatif çözelti içeren bir mikrosantrifüj tüp embriyolar transfer. Bundan sonra, embriyolara dokunmamaya dikkat edin, tüpten fiksatif kaldırın.Daha sonra embriyoları PBS'de %0.2 Triton X-100 içeren embriyoları oda sıcaklığında 5 dakika boyunca üç kez yıkayın. Embriyolardan son yıkamayı çıkarın ve %10 ısı inaktive serumu ile PBS Triton içeren engelleme solüsyonu ekleyin. Embriyoları en az iki saat boyunca bir nutator'da dört santigrat derecede engelleyin.Daha sonra, engelleme kaldırın ve engelleme çözeltisi seyreltilmiş birincil antikor yaklaşık bir mililitre ekleyin. Embriyoları bir gecede bir nutatorla dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Birincil antikor çıkarın ve daha sonra kullanmak için kaydedin.Sonra, pbs Triton ile iki kez embriyoları durulayın. Ve bir nutator üzerinde 30 dakika boyunca üç kez yıkayın. Birincil antikor konak türlerine karşı seyreltilmiş floresans konjuge ikincil antikor ile yıkama değiştirin.Ve bir gece boyunca bir nutator'da dört santigrat derecede kuluçkaya yat. Sonra, ikincil antikor kaldırmak ve iki kez PBS Triton ile embriyoları durulayın. PBS Triton ile 30 dakika boyunca üç kez yıkamadan önce.Son yıkamayı, seyreltilmiş floresan konjuge phalloidin ve seyreltilmiş DAPI ve leke içeren PBS Triton ile oda sıcaklığında bir saat değiştirin. Sonra, PBS Triton'da embriyoları iki kez durulayın. Ve oda sıcaklığında 30 dakika PBS Triton ile yıkayın.Bundan sonra, PBS Triton'u PBS ile değiştirin ve embriyoları buzda bırakın. Sonra temiz hazırlamak, pozitif yüklü slaytlar, kapak fişleri ve sulu gliserol tabanlı montaj ortamı. Slayta birbirinden 15 milimetre uzakta iki adet açık bant yerleştirin.Daha sonra, diseksiyon mikroskobu altında, bir embriyoyu slayta taşımak için değiştirilmiş bir P200 pipeti kullanın. Ince forceps kullanarak, embriyo açmak için sarısı kesesinin lateral taraflarında iki tam kesim yapmak. Daha sonra, ventral tarafı yukarı embriyo pozisyon.Embriyoya 50 mikrolitre montaj ortamı ekleyin. Daha sonra, kapak fişine montaj lı bir ortam ekleyin. Bant iki parça straddling yerleştirin ve bükülmüş bir iğne kullanarak embriyolar üzerine yavaş yavaş indirin.Fazla montaj ortamını kaldırmak için emici bir mendil kullanın ve kapak fişini hareket ettirmemeye özen azalın. Sonra, kapak kayma taraflarını mühürlemek için oje cömert bir miktar kullanın. Son olarak, embriyoları gözlemlemek için bir tarama konfokal mikroskop kullanın.Embriyoların üzerine monte ettikten sonra kapak kaymahareket etmemek çok önemlidir, çünkü 3D görselleştirme için onları bozabilir. Taramalı elektron mikroskobu kullanılarak, e7.75'te bir mutant fare embriyosu ve yabani tipte düğümün oluşumu gözlendi. Vahşi tipçukur şeklindedüğüm aksine, mutant embriyolar düzleştirilmiş ve düzenli bir düğüm ve nodalcordal plaka görüntülenir.Tüm şimdi immünoresans için hücre düzeyinde Strip 1 mutant embriyolarda düğüm ve notochordal plaka oluşumu kusurları çalışmak için kullanılmıştır. Veriler, mutant embriyolarında anormal ve bodur olduklarını gösterdi. Düğüm ve nodalkortal plaka sadece geçici embriyo yüzeyinde mevcut, bu nedenle zamanlama SEM başarısı için gereklidir.Örneğin, iki ila dört somit embriyolar uzun silia ile olgun bir düğüm SEM analizi için iyidir. Saflık reaktifler de bu tekniklerin başarısı için gereklidir, özellikle SEM tarafından ultrayapı probing. Embriyo sopa Küçük yabancı maddeleri genellikle büyük eserler neden.Bu iki tekniğin normal gelişim sırasında düğüm ve nodalkortal plakanın yapısı ve bu yapıların oluşumunda kusurlar gösteren mutantlar hakkında tamamlayıcı bilgi verdiğine inanıyoruz.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Yüksek frekanslı Ultrason Kullanımı Fare Embriyolar Kontrast Görüntüleme

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy Nanotomy of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Sağlıklı ve Yaralı Zebra balığı Beyin büyük ölçekli Tarama Transmisyon Elektron Mikroskobu (Nanotomy)

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution electron microscopy. Others and we previously ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Çoklu hedef Kromojenik Tüm montaj<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme Gen İfade Etki karşılaştırılması için<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Yöntemler Lenf Bezi ve Hemocytes içinde incelemek için<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Organ Kültür ve Fare Wolffian Kanallarının Tüm Dağı Immunoflorasan Boyama

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Zebra balığı bütün Dağı Floresan Situ hibridizasyon ve ayirt kombine bir protokol aracılığıyla Multiciliated hücrelerde görüntülenmesi

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Nicel bütün Dağı ayirt analiz fare embriyo kardiyak progenitör nüfusun

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Geniş hacimli içinde belirli hücresel hedefleri bulmak için seri bölümlerin Multimodal hiyerarşik görüntüleme

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Bütün Dağı ayirt ve kültürlü fare yumurtalıklarda folikül miktar

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

Bütün Mount Epifluorescence kullanarak fare embriyogenez sırasında kalp odası gelişimin analizi

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...