Name: isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method
Uploaded: 2018-10-23T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method at JoVE.com

ونشكر الدكتور جونباي كبار المسئولين الاقتصاديين وهوا فيفيان للمدخلات العلمية والمناقشة. وأيد هذا العمل "المعهد الوطني للصحة" (NIH) (R01DK107530). وأيد T.N. المعزوفة من اليابان وكالة العلوم والتكنولوجيا. وأيد بمنحه من المعاهد الوطنية للصحة (P30DK078392) لمركز الجهاز الهضمي الأمراض البحوث الأساسية في سينسيناتي جزءا من هذه الدراسة.

ويتضمن هذا البروتوكول استخدام فئران المختبرات. رعاية الحيوان وإجراءات تجريبية أجريت وفقا للإجراءات التي أقرتها لجان الرعاية الحيوانية سينسيناتي الأطفال مستشفى المركز الطبي.
1-عزل خلايا الكبد الأساسي للماوس
<ol><li>التحضير قبل عزلة<ol>
<li>إعداد 450 مل من 40% الكثافة المتدرجة المخ...

على الرغم من أن تم اقتراح العديد من خطوط الخلية الكبدية مخلدة واستخدامها للتحقيق في وظائف الكبد49،50،،من5152، تفتقر عموما إلى هذه الخلايا الهامة والأساسية وظائف خلايا الكبد طبيعية، مثل التعبير عن الزلال (الشك?...

البروتين عنصر هام في تغذية، وحوالي 50% الوزن الجاف لجسم الإنسان يتكون من البروتينات التي لها العديد من الصفات البيولوجية ووظائف1. ونتيجة لذلك، تخليق البروتين أحد الأحداث التي تستهلك معظم الطاقة وتغيير في التمثيل الغذائي البروتين يرتبط جداً مع تطور الأمراض، بما في ذلك الأمراض الأيضية2،،من34. في الكبد، وحسابات تخليق البروتين الحيوي لحوالي 20-30 في المائة من الاستهلاك الإجمالي للطاقة5،6. وباﻹضافة إلى ذلك، وظيفة البروتينات ليس فقط سلبية أو بناء كتل من الكبد، ولكن عوامل نشطة أيضا التوسط في إشارة إينتراسيلولارلي أو اكستراسيلولارلي لتنظيم الأيض الجهازية7. على سبيل المثال، انخفاض مستويات الزلال، الذي يتم تصنيعه ويفرزها الكبد والبروتين الأكثر وفرة في بلازما8، يزيد من خطر النوع 2 السكري التنمية9،10، 11، في حين أن أعلى تركيز ألبومين المصل الحماية ضد تطوير المتلازمة الأيضية12. وعلاوة على ذلك، تشعر بانزعاج أو اضطراب البروتينات الكبدية الافرازية أو الغشاء زمنياً، والتي تعدل التوازن نسبة الكولسترول في الدم، بما في ذلك البروتينات الدهنية، ولدلر، و LRP1، يمكن أن يؤدي إلى تطوير مقاومة الأنسولين، والدهون، أو تصلب الشرايين 13-ولذلك، تحديد الآليات الفيزيولوجية المرضية الجزيئية التي تشارك في اضطرابات التمثيل الغذائي البروتين في الكبد ومضاعفاته الأيضية المرتبطة بها قد تكون مفيدة لاكتشاف رواية الدوائية نهج تؤخر ظهور أو علاج الأمراض الأيضية مثل مقاومة الأنسولين وداء السكري والكبد الدهني غير الكحولية.
تخليق البروتين محكم مرتبط بمركز الطاقة الخلوية (مثلاً، تشكيل واحد ببتيد السندات خلال الخطوة استطالة تخليق البروتين يتطلب سندات phosphodiester 414) وينظم مسارات الجزيئية التي بمعنى جملة بين الخلايا وداخلها توافر المغذيات15،16. أمبير-تنشيط بروتين كيناز (أمبك) هو واحد من أجهزة استشعار الطاقة داخل الخلايا التي تحافظ على التوازن الطاقة17. حالما يتم تنشيط أمبك عندما تصبح أقل مستويات الطاقة الخلوية، تعمل أمبك ولها ركائز المستهدفة لتحفيز مسارات تقويضي وتمنع الابتنائية العمليات بما في ذلك البروتين التوليف18،19. تنظيم تخليق البروتين هو توسط الفسفرة متعددة العوامل الترجمة والبروتينات ريبوسومال20. من المذكرة، الهدف الثدييات من ربمسن 1 معقدة (mTORC1)، محرك رئيسي تخليق البروتين، أحد الأهداف الرئيسية من أمبك21. تنشيط المسار mTORC1 يعزز نمو الخلايا وانتشارها بالبروتين تنشيط الترجمة وأوتوفاجي،من2021. ولذلك، فمن المنطقي أن تنشيط أمبك يمكن أن تمنع mTORC1 بوساطة البروتين التوليف22. وفي الواقع، تفعيل AMPK يصد ومباشرة فوسفوريلاتيس mTORC1 على بقايا ثريونين 2446 (Thr2446) مما أدى إلى المنظمة23 وقمع من البروتين الحيوي24. وعلاوة على ذلك، أمبك يمكن أن تمنع غير مباشر وظيفة mTORC1 الفسفرة والتنشيط من التصلب درني المعقدة 2 (TSC2)25 وهي الجهة المنظمة للمراحل الأولى من تتالي الإشارات mTORC1. وباختصار، التقلبات من هذه المسارات في الكبد وكثيراً ما يرتبط بتطور الأمراض الأيضية ولذلك هناك حاجة ماسة لإنشاء أدوات تجريبية فعالة التحقيق في دور هذه المسارات في تنظيم الطاقة و استقلاب البروتين في خلايا الكبد.
وهناك تشابه أقوى بين الخصائص الوظيفية لخلايا الكبد الأولية المعزولة و في فيفو خلايا الكبد من27،،من26 في المختبر المستمدة من الكبد الخلية خطوط28. وقد ثبت أن خلايا الكبد البشرية الأولية مشاركة 77% التشابه مع خزعات الكبد، بينما تعرض الخلايا HepG2، وهي خلايا سرطانية كبدية المتمايزة جيدا وتستخدم على نطاق واسع للتحقيق في وظائف الكبد، أقل من 48% في سياق ملامح التعبير الجيني29. ولذلك، استعمال خلايا الكبد الأولية، بدلاً من خلايا الثقافة مخلدة، له أهمية حيوية في التحقيق في وظيفة الكبد وعلم وظائف الأعضاء، وتتوفر العديد من البروتوكولات للعزلة والثقافة من خلايا الكبد الأولية خاصة من الفئران30،31. بينما خلايا الكبد في الفئران مفيدة مع عائد أعلى نسبيا من الخلايا، خلايا الكبد الماوس على إمكانيات أكبر في العديد من الجوانب العلمية بسبب توافر واسعة من الفئران المعدلة وراثيا. ومع ذلك، هناك العديد من التحديات التقنية في عزل خلايا صحية ووفيرة من الكبد الأولية من الفئران الخلوية والجزيئية-التقييمات المستندة إلى: أولاً، الإدراج القنية نتخلل في الكبد مع الكواشف المخزن المؤقت من الصعب جداً التعامل مع بسبب الوريد البابي الماوس صغيرة ورقيقة أو أدنى الوريد الأجوف؛ ثانيا، يمكن أن يسبب وقتاً أطول من تلاعب بالخلايا من خلال العزل الحد في الخلية الكمية والنوعية؛ أساليب الفصل الثالث، غير الانزيمية الميكانيكية يمكن أن تسفر عن أضرار جسيمة وإنتاج منخفضة عائد من خلايا الكبد الأولية المعزولة قابلة للتطبيق32،33. في الثمانينات، بدأ كولاجيناز نضح تقنية لعزل خلايا الكبد من الكبد من الحيوانات34. ويستند هذا الأسلوب على نضح كولاجيناز الكبد35،،من3637، ضخ الكبد مع الكالسيوم تشيلاتور حل38،39، الهضم الأنزيمي و الميكانيكية تفكك لحمه الكبد35. في الخطوة الأولى، هو perfused كبد ماوس مع المخزن مؤقت حرة كالسيوم [Ca2 +] يتضمن [Ca2 +] تشيلاتور (حمض tetraacetic الإيثيلنديامين، يدتا). في الخطوة الثانية، هو perfused في الكبد الماوس مع عازلة التي تحتوي على كولاجيناز يتحلل التفاعلات المصفوفة خارج الخلية الخلوية. خلافا للمخزن المؤقت المستخدم في خطوة واحدة، الوجود [Ca2 +] الأيونات في المخزن المؤقت للخطوة الثانية المطلوبة لنشاط كولاجيناز فعالة، قد الكبد هضمها بعد ذلك كذلك بلطف وميكانيكيا فصل استخدام الملقط بين كبسولة الكبد والأنسجة بارينتشيماتوس. أخيرا، تتم إزالة النسيج الضام بالتصفية والطرد المركزي اللاحقة يفصل بين خلايا الكبد سليمة من خلايا غير متني على حد سواء، وتتمثل غير الحية باستخدام الكثافة العازلة التدرج40،41 ،42. في هذه الدراسة، نعرض تقنية التروية كولاجيناز خطوتين معدلة لعزل خلايا الكبد الأولية من كبد ماوس للتحليل تخليق البروتين.
راديولابيلينج البروتينات يستخدم على نطاق واسع قياس مستويات التعبير، معدلات دوران الموظفين، وتحديد التوزيع البيولوجي ل البروتينات43 نظراً لحساسية عالية للكشف عن النشاط الإشعاعي44. ومع ذلك، يتطلب استخدام النظائر المشعة البحوث العالية التي تسيطر عليها ظروف وإجراءات45. تم تطوير طرق بديلة غير المشعة واكتسبت شعبية متزايدة. أن رد الفعل ربط الكيماوي انتقائية مع طريقة الكشف عن بروتين تيتراميثيلرهوداميني (طمره) هو واحد منهم ويقوم على رد الفعل الكيماوي الانتقائي بين أزيد وإضافة مجموعات46، التي يمكن أن تستخدم لتحليل الأحداث الخلوية مثل الكشف عن البروتين الوليدة والفئات الفرعية ل glycoproteins تعديل مع جماعة أزيد. تخليق البروتين الوليدة، يمكن أيضي دمج البروتينات L-أزيدوهوموالانيني (L-اها، هو تعديل لأزيد من الأحماض الأمينية) والكشف عنها بواسطة استخدام الأسلوب الكشف عن البروتين طمره47. باستخدام هذا الإنزيم في خلايا الكبد الماوس الأساسي، نحن تظهر أن معدل توليف البروتين الوليدة مشددة مرتبطة بتوافر ATP من الميتوكوندريا وتفعيل أمبك (الشكل 1).
وباختصار، الاستفادة من خلايا الكبد الماوس الأساسي أمر حاسم للتحقيق في استقلاب البروتين والطاقة والتحديد الكمي تخليق البروتين الوليدة قيمة لاكتساب رؤى في دور الفيزيولوجية من المسارات ذات الصلة بتنمية و علاج للأمراض التي تتمثل.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-tetraacetic acid</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB00505-00025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10X) no calcium, magnesium, phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient buffer</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11885-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1897141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams medium E, no glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12551-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type X</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>039-17864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>Masterflex L/S</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV administration set</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>29081</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A water bath</td>
			<td>REVSCI</td>
			<td>RS-PB-200</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube heater</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Isotemp</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Lab, Inc</td>
			<td>0-39613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>PHOENIX</td>
			<td>10250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved Cotton Tips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>23-400-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri Dish</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Connector (Male Luer Lock Ring)</td>
			<td>Cole-Parmer instrument</td>
			<td>EW-4551807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24G catheters</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>Surflo 24Gx3/4&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;m Filter (CELL STRAINERS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10199-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical-bottom centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical-bottom centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C33370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AHA (L-azidohomoalanine)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (methionine free)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21013024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cystine Dihydrochloride</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C2526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli sample buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P9599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS solution (20%)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL (1M)</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB14044-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Heatblock</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12621-092</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Rotator</td>
			<td>Grant-bio</td>
			<td>PTR-60</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Sonicator</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>GE130PB</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Heavy-Duty Vortex Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-566</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A variable mode laser scanner</td>
			<td>GE Healthcare Life Science</td>
			<td>FLA 9500</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie-dye reagent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>24594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blotting apparatus</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>TC20</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorChem R system</td>
			<td>proteinsimple</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Ampka (T172) antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>2535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total-AMPK antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>5832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>4929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta actin antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-130656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors and forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method

خلايا الكبد خلايا الكبد متني وممارسة وظائف ايضية متعددة، بما في ذلك تجميع وإفراز البروتينات ضروري للتوازن الطاقة الشاملة. خلايا الكبد الأولية المعزولة من الكبد مورين تشكل أداة بيولوجية قيمة لفهم الخصائص الوظيفية أو التغييرات التي تحدث في الكبد. هنا يمكننا وصف أسلوب للعزلة والثقافة من خلايا الكبد الماوس الأساسي قبل تنفيذ أسلوب نضح كولاجيناز خطوتين ومناقشة الاستفادة منها للتحقيق في استقلاب البروتين. هو perfused الكبد من الماوس الكبار التتابع مع حمض tetraacetic جليكول-مكررا (اجتا) وكولاجيناز، متبوعاً بعزل خلايا الكبد مع كثافة المخزن المؤقت التدرج. خلايا الكبد معزولة هذه قابلة للتطبيق على ألواح الثقافة والحفاظ على معظم الخصائص هبت لخلايا الكبد. يمكن استخدام خلايا الكبد هذه التقييمات استقلاب البروتين، بما في ذلك البروتين الوليدة مع الكواشف غير مشعة. ونحن تبين أن خلايا الكبد معزولة يتم التحكم فيها بسهولة وتشمل استقرار أعلى جودة وحجم تخليق البروتين مرتبطة باستقلاب الطاقة عن طريق استخدام رد فعل ربط الكيماوي انتقائية مع بروتين تيتراميثيلرهوداميني (طمره) طريقة الكشف والتحليلات الغربية النشاف. ولذلك، هذا الأسلوب قيمة للتحقيق في تخليق البروتين الوليدة الكبدية مرتبطة بالتوازن الطاقة. يحدد البروتوكول التالي المواد والأساليب لعزل خلايا الكبد الماوس الأساسية عالية الجودة، والكشف عن تخليق البروتين الوليدة.

ويؤدي عزل خلايا الكبد الماوس الأساسي عائد من حوالي 20 × 106 مجموع الخلايا/الماوس. الأشيع، خلايا حية والمرفقة من الكبد الأولية تظهر مضلعة أو نموذجية سداسية في الشكل مع وضوح الحدود غشائي بعد 24 ساعة الحضانة (الشكل 2).
لتأكي...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method at JoVE.com

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

عزل خلايا الكبد الماوس الأساسي لتحليل توليف البروتين الوليدة بأسلوب العلامات غير مشعة L-أزيدوهوموالانيني

نقدم هنا، بروتوكولا لعزل خلايا الكبد الماوس الأساسي صحية ووظيفية. وقدمت إرشادات للكشف عن البروتين الوليدة كبدي من الركازة التوسيم غير المشعة للمساعدة في فهم الآليات الأساسية تخليق البروتين في سياق التوازن الطاقة الأيض في الكبد.

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مختلف مجالات أبحاث الأمراض الأيضية حول التعديلات الجزيئية للطاقة الكبدية والتحلل الحيوي للبروتين في السمنة والكبد الدهني غير الكحولي وداء السكري من النوع الثاني. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يسهل عزل خلايا الكبد الماوس الوظيفية الأولية والكشف عن البروتينات الناشئة الكبدية عن طريق الركيزة وضع العلامات غير النشطة. مظاهرة بصرية من هذا الأسلوب أمر بالغ الأهمية كما خطوة الضخ من الصعب تعلم بسبب الأوعية الدموية الصغيرة ورقيقة الماوس.بالنسبة لضخ الكبد، قم بإدخال قسطرة قياس 24 بعناية في Vena Cava أو IVC فقط عند التشعب مع الوريد الكلوي الأيمن. إزالة إبرة القسطرة الحفاظ على موقف من قنية داخل IVC وربط 24 قنية قياس مع أنبوب التسريب باستخدام الموصل. تبدأ في ضخ الكبد مع HBSS دافئ ناقص في معدل تدفق دائم أربعة ملليلتر بسرعة قطع الوريد الجنبي لاستنزاف الدم الداخلي.بعد 10 دقائق، اثقب كبد الماوس بـ 35 ملليلتر من HBSS بالإضافة إلى مكملاتها مع Collagenase Type X بمعدل تدفق قدره أربعة ملليلترات في الدقيقة، وقط الوريد الزلي لمدة 10 ثوانٍ كل بضع دقائق لتسهيل توزيع الزمر في جميع أنحاء الكبد. عندما تم perfused كل من Collagenase، نقل الكبد إلى أنسجة المختبر قبل وقف المضخة لتجنب تدفق الدم إلى الكبد. استخدام ملقط لإزالة المرارة ومسح بلطف الكبد مع نسيج مختبر جديد لإزالة أي دم.وضع الكبد في طبق بيتري 100 ملليمتر التي تحتوي على خمسة ملليلتر من HBSS الدافئة الطازجة بالإضافة إلى مكملة مع Collagenase واستخدام ملقط شاردة الرؤوس لإزالة بلطف كبسولة الكبد. استخدام ملقط لتفريق بعناية الأنسجة parenchymal وإضافة 15 ملليلتر DMEM الباردة إلى طبق بيتري. هز الكبد الممزق بلطف لإطلاق الخلايا البارينشيمالية المتبقية في الوسط وإضافة 15 ملليلتر آخر من DMEM الباردة إلى الطبق للحصول على بقية الخلايا.ثم تصفية ملاط الأنسجة من خلال مصفاة خلية 100 ميكرون في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر على الجليد. لعزل خلايا الماوس الرئيسية، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تثبيت بيليه في 10 ملليلتر من DMEM الطازجة. طبقة الخلايا بعناية على 40٪ كثافة الانحدار العازلة لفصل التدرج الكثافة، وتجاهل الخلايا من الطبقات العليا والوسطى بعد الطرد المركزي.Resuspend بيليه الكبدية البارينشيمال الأولية مع اثنين إلى ثلاثة ملليلتر من وليام متوسطة E لتجنب جمع الخلايا الميتة من جدار الأنبوب ونقل الخلايا إلى أنبوب جديد 50 ملليلتر. خلط الخلايا مع سبعة إلى ثمانية ملليلتر إضافية من المتوسط وليام E قبل الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في 10، 20، أو 30 ملليلتر من E متوسطة وليام الطازجة اعتمادا على حجم بيليه. بعد العد، بذور ست مرات 10 إلى الخلايا الخامسة إلى كل بئر من لوحة ستة بئر لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات حضانة في 37 درجة مئوية.في نهاية الحضانة، واستبدال المتوسطة مع DMEM تكمل مع 10٪ مصل البقر الجنينية ومكافحة لمكافحة لإزالة الخلايا الميتة وغير المرتبطة والعودة إلى الخلايا الحاضنة بين عشية وضحاها. بالنسبة لوضع العلامات على البروتين الناشئ المعدل من أزيد، أضف 20 إلى 40 ميكروغرامًا من الخلايا إلى 50 ميكرولترات من مخزن التفاعل 2X. جلب حجم إلى 80 ميكرولتررس مع الماء المقطر الأيونية ودوامة حل البروتين لمدة خمس ثوان.إضافة خمسة ميكرولترات من كبريتات النحاس إلى الخلايا دوامة أخرى لمدة خمس ثوان، تليها خمسة ميكرولترات من رد فعل المضافة العازلة واحد مع خمس ثوان من دوامة. بعد حضانة لمدة ثلاث دقائق، إضافة 10 ميكرولترات من رد فعل المعاد تشكيلها العازلة المضافة اثنين إلى الخلايا دوامة ثانية خمس أخرى وتدوير العينة لمدة 20 دقيقة في أربع درجات مئوية على آلة متعددة الدوار محمية من الضوء. في نهاية التناوب، إضافة 300 ميكرولتر من الميثانول إلى lysate، تليها 75 ميكرولتر من الكلوروفورم، و 200 ميكرولترات من الماء المقطر مزدوجة.جمع البروتين المسمى عن طريق الطرد المركزي وإضافة 250 ميكرولترات من الميثانول الطازج إلى بيليه. بعد دوامة، الطرد المركزي وlysate مرة أخرى وتغطية بيليه عارية مع الأنسجة الخالية من الوبر لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لتحليل PAGE، solubilize بيليه المجففة في 20 ميكروليتر من العازلة التحميل دون بيتا mercaptoethanol ودوامة بيليه لمدة 10 دقائق.بعد ذلك، قم بسخين البروتين في كتلة حرارة 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق وتحميل العينة على هلام سلفات دوديسيل صوديوم بنسبة 10٪للكشف عن رباعيات اليرث. ثم استخدم ماسح ليزر وضع متغير للكمية الدقيقة من البروتينات الوليدة المسماة AHA. من الناحية النسيجية، تظهر خلايا الكبد الأولية الحية والمتعلقة عادةً متعددة الأضلاع أو سداسية الشكل مع حدود مبروم محددة بوضوح بعد 24 ساعة من الثقافة.لتأكيد ما إذا كانت الخلايا المعزولة هي خلايا الكبد الأولية، في هذه التجربة، تم مقارنة مستويات التعبير بروتين الألبومين في الخلايا الليفية الجنينية الماوس، خط خلية الكبد الماوس، خلايا الماوس الأولية المعزولة الكبدية الماوس، وكبد الماوس. تم الكشف عن تعبير بروتين الألبومين في خلايا الكبد الماوس الأولية وكبد الماوس، ولكن لم يكن يمكن الكشف عنها في الخلايا الليفية الجنينية الماوس أو خلايا خط خلايا الكبد. كشف العلاج الكبدي الأولي مع 10 ميكرومولار روتينون لمدة أربع إلى ست ساعات عن تحريض قوي من كيناز البروتين المنشط الكبدي AMP كما تم الكشف عنه من خلال زيادة مستويات الفوسفور على البروتين المنشط الكبدي AMP T172 مماثلة لتلك التي لوحظت في الجسم الحي.في الواقع، خمس ساعات من 10 العلاج Micromolar Rotenone كان لها آثار مثبطة عميقة على تخليق البروتين الوليدة في الكبد المعالجة الأولية مقارنة مع خلايا التحكم غير المعالجة كما يتضح من تحليل تفاعل الربط الكيميائي. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إعداد جميع الكواشف والتمهيد المطلوبة مقدمًا. مهدت هذه التقنية الطريق للباحث في مجال الفيزيولوجيا المرضية الأيضية الكبدية لاستكشاف الآلية الجزيئية لتنظيم بروتين الطاقة في السمنة وداء السكري من النوع الثاني في كبد الماوس الأولي المعزول.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Model of Disturbed Flow-Induced Atherosclerosis in Mouse Carotid Artery by Partial Ligation and a Simple Method of RNA Isolation from Carotid Endothelium

نموذج من تصلب الشرايين الناتج عن تدفق ديستيربد في الشريان السباتي الماوس بواسطة الربط الجزئي وطريقة بسيطة لعزل الحمض النووي الريبي من بطانة الشريان السباتي

Despite the well-known close association, direct evidence linking disturbed flow to atherogenesis has been lacking. We have recently used a modified ...

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

في المختبر الثقافة عضوي من أورام القولون ماوس

Several  human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic  integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical ...

Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

تحليل Coculture من تفاعلات البروتين خارج الخلية التي تمس افراز الانسولين من قبل خلايا بيتا في البنكرياس

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

A Modified Method for Heterotopic Mouse Heart Transplantion

وهناك طريقة معدلة لغيري مكاني ماوس القلب Transplantion

Mice are often used as heart transplant donors and recipients in studies of transplant immunology due to the wide range of transgenic mice and reagents ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

طريقة الحصول على خلايا سرطان المبيض الابتدائية من العينات الصلبة

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

العزلة والثقافة من الخلايا البطانية الأولية من الشرايين والأوردة الكلاب

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

صبغة الفلورسنت وصفها من كرات الدم الحمراء والكريات البيض لدراسة ديناميات التدفق في الماوس دوران الشبكية

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

العلاج الجيني بوساطة ناقلات لينتيفيرال من خلايا الكبد فيفو السابقين للزرع الذاتي في الخنازير

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...

Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

بالموجات فوق الصوتية زيادة الابتدائية الكبار العزلة الليفية

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary ...

A Non-Invasive Method for Generating the Cyclic Loading-Induced Intra-Articular Cartilage Lesion Model of the Rat Knee

طريقة غير جراحية لتوليد نموذج آفة الغضروف داخل المفصل الناجم عن التحميل الدوري لركبة الجرذ

The pathophysiology of primary osteoarthritis (OA) remains unclear. However, a specific subclassification of OA in relatively younger age groups is likely ...