Name: isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method
Uploaded: 2018-10-23T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method at JoVE.com

Vi takker Drs. Joonbae Seo og Vivian Hwa for deres videnskabelige input og drøftelser. Dette arbejde blev støttet af National Institute of Health (NIH) (R01DK107530). T.N. blev støttet af PRESTO fra Japan videnskab og teknologi agentur. En del af denne undersøgelse blev støttet af en bevilling fra NIH (P30DK078392) for mave sygdom forskning Core Center i Cincinnati.

Denne protokol indeholder brugen af laboratoriemus. Dyrs pleje og eksperimentelle procedurer blev udført efter procedurer, der er godkendt af dyrs pleje udvalg af Cincinnati børn Hospital Medical Center.
1. isolering af primære mus hepatocytter
<ol><li>Før isolation præparater<ol>
<li>Forberede 450 mL 40% tæthed gradient buffer, som beskrevet i tabel 1 og holde ved 4 ° C (15 mL/mus).</li>
		<li>Forberede 500 mL af Williams' Medium som beskrevet i tabel 1</stro...

Selv om flere udødeliggjort hepatisk cellelinjer har været foreslået og brugt til at undersøge leveren fungerer49,50,51,52, mangler disse celler generelt den vigtige og grundlæggende funktioner af normale hepatocytter, som udtryk for albumin (figur 3). Det er derfor almindeligt anerkendt, at udnytte primære hepatocytter er en værdifuld mulighed for at behand...

Protein er et vigtigt element, ernæringsmæssige og ca. 50% af tørvægt af en menneskelige krop er sammensat af proteiner, som har flere biologiske egenskaber og funktioner1. Derfor, proteinsyntesen er en af de mest energi forbrugende begivenheder og en ændring i protein metabolisme er stærkt forbundet med udviklingen af sygdomme, herunder metaboliske sygdomme2,3,4. I leveren, proteinsyntese tegner sig for ca. 20-30% af samlede energi forbrug5,6. Derudover proteiner funktion som ikke kun passiv eller byggeklodser af leveren, men også aktive signal-mægle faktorer intracellulært eller extracellularly at regulere den systemiske stofskifte7. For eksempel, reducerede niveauer af serum albumin, der syntetiseres og udskilles af leveren og de mest rigelige proteiner i plasma8, øger risikoen for type 2 diabetes udvikling9,10, 11, hvorimod en højere koncentration af serum albumin er beskyttende mod udvikle stofskiftesyndrom12. Desuden kan forstyrret eller afbrydelse af sekretoriske eller membran-bundet hepatisk proteiner, som modulerer kolesterol homøostase, herunder lipoproteiner, LDLR og LRP1, føre til udviklingen af insulinresistens, hyperlipidæmi eller åreforkalkning 13. derfor identifikation af molekylære patofysiologiske mekanismer, der er involveret i protein metabolisme forstyrrelse i leveren og dens tilknyttede metaboliske komplikationer kan være nyttig for at opdage roman farmakologiske tilgange for at forsinke starten eller behandling af metaboliske sygdomme som insulinresistens, diabetes og ikke-alkoholiske fedtlever.
Proteinsyntese er tæt knyttet til cellulære energi status (f.eks.dannelse af en peptidbinding under trinnet brudforlængelse af proteinsyntesen kræver 4 phosphodiester obligationer14) og er reguleret af molekylære processer, der fornemmer Inter - og intra cellular næringsstoftilgængelighed15,16. AMP-aktiveret protein kinase (AMPK) er en af de intracellulære energi sensorer, at opretholde energi homøostase17. Når AMPK aktiveres når cellulære energi niveauer bliver lavere, funktion AMPK og sin målrettede substrater til at stimulere kataboliske veje og hæmme anabolske processer, herunder protein syntese18,19. Regulering af proteinsyntesen er medieret af fosforylering af flere oversættelse faktorer og ribosomale proteiner20. Af note er pattedyr målet på rapamycin komplekse 1 (mTORC1), en vigtig drivkraft i proteinsyntesen, en af de vigtigste mål i AMPK21. Aktivering af mTORC1 pathway øger cellevækst og spredning af stimulerende proteiner oversættelse og autophagy20,21. Derfor er det logisk, at aktivering af AMPK kan hæmme mTORC1-medieret protein syntese22. Aktivering af AMPK modvirker og direkte phosphorylates mTORC1 på Threonin rester 2446 (Thr2446) fører til dets inaktivering23 og undertrykkelse af protein biosyntesen24. Desuden kan AMPK indirekte hæmme mTORC1 funktionen ved fosforylering og aktivering af knolde sklerose komplekse 2 (TSC2)25 , som er opstrøms af mTORC1 signaling kaskade. Kort sagt, dysregulering af disse veje i leveren er ofte knyttet til udviklingen af metaboliske sygdomme og der er derfor et kritisk behov for at etablere effektive eksperimentelle værktøjer til at undersøge rollen, som disse veje i reguleringen af energi og protein metabolisme i hepatocytter.
Der er en større lighed mellem de funktionelle egenskaber af isolerede primære hepatocytter og i vivo hepatocytter end med in vitro- leveren-afledte celle linjer26,27,28. Det er påvist, at primære humane hepatocytter del 77% lighed med der lever biopsier, hvorimod HepG2 celler, som er godt differentieret hepatisk kræftceller og almindeligt anvendt til at undersøge hepatisk funktioner, vise mindre end 48% i forbindelse med genekspression profiler29. Derfor, udnyttelse af primære hepatocytter, snarere end udødeliggjort kultur celler, er af vital betydning i efterforskningen af leverens funktion og fysiologi, og flere protokoller er tilgængelige for isolation og kultur af primære hepatocytter især fra rotter30,31. Mens rotte hepatocytter er nyttigt med et relativt højere udbytte af celler, har mus hepatocytter et større potentiale i mange videnskabelige aspekter på grund af den store tilgængelighed af genetisk moduleret mus. Der er dog flere tekniske udfordringer i isolere sund og rigelige primære hepatocytter fra mus for Cellulær og molekylær-baserede vurderinger: første kanyle indsættelse til perfuse leveren med buffer reagenser er meget vanskeligt at håndtere på grund af den lille og tynd mus portal vene eller ringere vena cava; for det andet kan længere manipulation af celler under isolation medføre reduktion i celle kvantitet og kvalitet; tredje, ikke-enzymatisk mekanisk separation metoder kan resultere i alvorlige skader og producere et lavt udbytte af levedygtige isolerede primære hepatocytter32,33. I 1980 ' erne, blev collagenase perfusion teknik introduceret til isolering af hepatocytter fra lever af dyr34. Denne metode er baseret på collagenase perfusion af lever35,36,37, infusion af leveren med calcium chelator løsning38,39, enzymatisk fordøjelse og mekanisk dissociation af hepatisk parenkym35. I det første skridt, er en mus lever perfunderet med en calcium [Ca2 +] gratis buffer indeholdende en [Ca2 +] chelator (ethylendiamin tetraacetic acid, EDTA). I andet trin af er musen leveren perfunderet med en collagenase-holdige buffer at hydrolysere cellulære-ekstracellulære matrix interaktioner. I modsætning til den buffer, der bruges i trin et, tilstedeværelsen af [Ca2 +] ioner i buffer på det andet trin er nødvendige for effektiv collagenase aktivitet, hvorefter fordøjet leveren har yderligere forsigtigt og mekanisk adskilles ved hjælp af pincet mellem den hepatisk kapsel og parenkyme væv. Endelig, bindevæv er fjernet ved filtrering, og efterfølgende centrifugering adskiller levedygtige hepatocytter fra både ikke-parenkymalt celler og ikke-levende hepatocyt med brug af tæthed gradient buffer40,41 ,42. I den foreliggende undersøgelse viser vi en modificeret totrins collagenase perfusion teknik til at isolere primære hepatocytter fra en mus lever til analyse af proteinsyntesen.
Radiolabeling af proteiner er meget udbredt at kvantificere niveauerne for udtryk, omsætning satser, og fastlægge biologiske fordelingen af proteiner43 som følge af den høje følsomhed påvisning af radioaktivitet44. Anvendelse af radioaktive isotoper kræver imidlertid meget kontrolleret forskning omstændigheder og procedurer45. Alternative ikke-radioaktive metoder er blevet udviklet og har i stigende grad vundet i popularitet. Kemo-selektiv ligatur reaktion med en Tetramethylrhodamine (TAMRA) protein påvisningsmetode er en af dem og er baseret på den kemo-selektiv reaktion mellem et indeholder og alkyn grupper46, som kan udnyttes til at analysere cellulære begivenheder såsom påvisning af spirende proteinsyntesen og underklasser af glykoproteiner modificeret med en indeholder gruppen. For spirende proteinsyntese, kan L-Azidohomoalanine (L-AHA, en indeholder-ændret aminosyre) metabolisk indarbejdet i proteiner og påvises ved hjælp af TAMRA protein opdagelse metode47. Ved hjælp af denne analyse i primære mus hepatocytter, vi viser, den spirende proteinsyntese sats er tæt knyttet til tilgængeligheden af ATP fra mitokondrie og AMPK aktivering (figur 1).
I Resumé, udnyttelse af primære mus hepatocytter er afgørende at undersøge protein og energi metabolisme og kvantificere spirende proteinsyntesen er værdifulde for at få indsigt i den fysiologiske rolle af veje, der er relevante for udviklingen og helbredelse af hepatocyt-relaterede sygdomme.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-tetraacetic acid</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB00505-00025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10X) no calcium, magnesium, phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient buffer</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11885-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1897141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams medium E, no glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12551-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type X</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>039-17864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>Masterflex L/S</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV administration set</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>29081</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A water bath</td>
			<td>REVSCI</td>
			<td>RS-PB-200</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube heater</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Isotemp</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Lab, Inc</td>
			<td>0-39613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>PHOENIX</td>
			<td>10250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved Cotton Tips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>23-400-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri Dish</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Connector (Male Luer Lock Ring)</td>
			<td>Cole-Parmer instrument</td>
			<td>EW-4551807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24G catheters</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>Surflo 24Gx3/4&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;m Filter (CELL STRAINERS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10199-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical-bottom centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical-bottom centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C33370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AHA (L-azidohomoalanine)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (methionine free)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21013024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cystine Dihydrochloride</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C2526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli sample buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P9599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS solution (20%)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL (1M)</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB14044-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Heatblock</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12621-092</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Rotator</td>
			<td>Grant-bio</td>
			<td>PTR-60</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Sonicator</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>GE130PB</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Heavy-Duty Vortex Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-566</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A variable mode laser scanner</td>
			<td>GE Healthcare Life Science</td>
			<td>FLA 9500</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie-dye reagent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>24594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blotting apparatus</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>TC20</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorChem R system</td>
			<td>proteinsimple</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Ampka (T172) antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>2535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total-AMPK antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>5832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>4929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta actin antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-130656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors and forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method

Hepatocytter er parenkymalt celler i leveren og engagere flere metaboliske funktioner, herunder syntese og sekretion af proteiner afgørende for systemisk energi homøostase. Primære hepatocytter isoleret fra murine leveren udgør et værdifuldt biologiske redskab for at forstå de funktionelle egenskaber eller forandringer opstår i leveren. Heri vi beskrive en metode til isolering og kultur af primære mus hepatocytter ved at udføre en to-trins collagenase perfusion teknik og diskutere deres udnyttelse for at undersøge protein metabolisme. Lever af en voksen mus er sekventielt perfunderet med ethylenglycol-bis tetraacetic syre (EGTA) og collagenase, efterfulgt af isolering af hepatocytter med tæthed gradient buffer. Disse isolerede hepatocytter er levedygtige på kultur plader og vedligeholder størstedelen af begavet Karakteristik af hepatocytter. Disse hepatocytter kan bruges til vurdering af protein metabolisme herunder spirende proteinsyntese med ikke-radioaktive reagenser. Vi viser, at de isolerede hepatocytter styres let og omfatte en højere kvalitet og volumen stabilitet af proteinsyntesen knyttet til energimetabolisme ved at udnytte kemo-selektiv ligatur reaktionen med en Tetramethylrhodamine (TAMRA) protein metode til påvisning og western blotting analyser. Derfor, denne metode er værdifuld for at undersøge hepatisk spirende proteinsyntesen knyttet til energi homøostase. Følgende protokol skitserer de materialer og metoder til isolering af høj kvalitet primære mus hepatocytter og påvisning af spirende proteinsyntesen.

Primære mus hepatocytter isolation medfører et udbytte på ca 20 x 106 samlede celler/mus. Histologisk, levende og vedlagte primære hepatocytter vises polygonale eller typiske sekskantede form med klart skitseret hindeagtige grænse efter 24 timers inkubation (figur 2).
For at bekræfte, om isolerede celler primære hepatocytter, forhold vi udtryk niveauer af albumin protein i isolered...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method at JoVE.com

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

Isolering af primære mus hepatocytter for spirende Protein syntese analyse af ikke-radioaktive L-azidohomoalanine mærkning metode

Vi præsenterer her, en protokol til isolering af sunde og funktionelle primære mus hepatocytter. Instruktioner til påvisning af hepatisk spirende proteinsyntese af ikke-radioaktive mærkning substrat blev givet til at hjælpe med at forstå de mekanismer, der ligger til grund proteinsyntesen i forbindelse med energi-stofskifte homøostase i leveren.

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i forskellige metaboliske sygdom forskningsområder om molekylære ændringer af leverenergi og protein biosyntese i fedme, ikke-alkoholiske fedtlever, og type to diabetes. De vigtigste fordele ved denne teknik er, at det letter isoleringen af funktionelle primære mus hepatocytter og afsløring leverproteiner via en ikke-radioaktiv mærkning substrat. Visuel demonstration af denne metode er kritisk, da perfusion trin er svært at lære på grund af de små og tynde mus blodkar.For leverperfusion, omhyggeligt indsætte en 24 gauge kateter i ringere Vena Cava eller IVC lige ved bifurcation med højre nyrevene. Kateteretålen der skal bevare kanylens position i IVC'en, og der tilsluttes en 24 gauge-kanyle med perfusionsrøret ved hjælp af stikket. Begynd perfusing leveren med varm HBSS minus ved en fire milliliter permanent strømningshastighed hurtigt skære milten vene til at dræne det indre blod.Efter 10 minutter, perfuse museleverne med 35 milliliter HBSS plus suppleret med Collagenase Type X med en strømningshastighed på fire milliliter i minuttet, fastspænding milten vene i ca 10 sekunder hvert par minutter for at lette fordelingen af perfusate i hele leveren. Når alle kollagenase er blevet perfunderet, overføre leveren på et laboratorium væv, før du stopper pumpen for at undgå blod tilbagestrøm i leveren. Brug sceinder til at fjerne galdeblæren og forsigtigt tørre leveren med en frisk lab væv til at fjerne blod.Placer leveren i en 100 millimeter petriskål indeholdende fem milliliter frisk varm HBSS plus suppleret med Collagenase og bruge omstrejfende-tippet kraftbefæstet til forsigtigt at fjerne leverkapslen. Brug vicesspærret til forsigtigt at sprede parenkymale væv og tilsæt 15 milliliter kold DMEM til petriskålen. Ryst den iturevne lever forsigtigt for at frigøre de resterende parenkymale celler i mediet og tilsæt yderligere 15 milliliter kold DMEM til skålen for at erhverve resten af cellerne.Derefter filtreres vævsslædeglasset gennem en 100 mikrocellest si i et 50 milliliter konisk rør på is. For at isolere den primære mus hepatocytter, indsamle cellerne ved centrifugering og resuspend pellet i 10 milliliter frisk DMEM. Lag omhyggeligt cellerne over en 40% tæthed gradient buffer for densitet gradient adskillelse, kassere cellerne fra de øvre og midterste lag efter centrifugering.Opsalt den primære parenkymale hepatocyte pellet med to til tre milliliter af Vilhelm's Medium E for at undgå at indsamle døde celler fra væggen af røret og overføre cellerne til en ny 50 milliliter rør. Bland cellerne med yderligere syv til otte milliliter af Vilhelm's E Medium før centrifugering og resuspend pellet i 10, 20, eller 30 milliliter frisk William's Medium E afhængigt af størrelsen af pellet. Efter optælling, frø seks gange 10 til den femte celler til hver brønd af en seks-brønd plade til en to til tre-timers inkubation ved 37 grader Celsius.Ved inkubationens afslutning erstattes mediet med DMEM suppleret med 10% føtalt kvægserum og antianti for at fjerne de døde og ikke-tilknyttede celler og returnere cellerne til inkubatoren natten over. For azide-modificeret spirende protein mærkning, tilsæt 20 til 40 mikrogram celle lysat til 50 mikroliter af 2X reaktion buffer. Bring volumen til 80 mikroliter med destilleret deioniseret vand og vortex proteinopløsningen i fem sekunder.Tilføj fem mikroliter af kobbersulfat til cellerne i yderligere fem sekunder vortex, efterfulgt af fem mikroliter af reaktion buffer additiv en med fem sekunders vortexing. Efter tre minutters inkubation tilsættes 10 mikroliter rekonstitueret reaktionsbuffertilsætningsstof to til cellerne i endnu en fem-sekunders vortex og drej prøven i 20 minutter ved fire grader Celsius på en multi-rotator maskine beskyttet mod lys. Ved rotationens afslutning tilsættes 300 mikroliter methanol til lysatet efterfulgt af 75 mikroklitter chloroform og 200 mikroliter dobbeltdestilleret vand.Opsaml det mærkede protein ved centrifugering, og der tilsættes 250 mikroliter frisk methanol til pellets. Efter vortexing, centrifuge lysate igen og dække den nøgne pellet med en fnugfri væv i 15 minutter ved stuetemperatur. Til PAGE-analyse opløses den tørrede pellet i 20 mikroliter af læssebufferen uden beta-mercaptoethanol og vortex pellet i 10 minutter.Dernæst opvarmes proteinet i en 70 grader Celsius varmeblok i 10 minutter og læg prøven på en 10% natrium dodecyl sulfatgel til tetramethylrhodamin detektion. Brug derefter en laserscanner i variabel tilstand til den præcise kvantisering af de AHA-mærkede spirende proteiner. Histologisk, levende og vedlagte primære hepatocytter synes typisk polygonale eller sekskantede i form med en klart skitseret membranøs grænse efter 24 timers kultur.For at bekræfte, om de isolerede celler er primære hepatocytter, blev albumin proteinudtryksniveauer i dette eksperiment sammenlignet med museembryinfibroblaster, en musehipatomacellelinje, isolerede primære muse-hepatocytter og muselever. Albumin proteinudtrykket blev påvist i primære musebater og muselever, men kunne ikke påvises i hverken museemfofiske fibroblaster eller hepatomacelleceller. Primær hepatocytbehandling med 10 mikromolar Rotenone i fire til seks timer afslørede en robust induktion af hepatisk AMP-aktiveret proteinkinase som påvist ved øget fosforyleringsniveauer på hepatisk AMP-aktiveret proteinkinase T172 svarende til dem, der blev observeret in vivo.Faktisk havde fem timers 10 mikromolar Rotenone-behandling dybtgående hæmmende virkninger på spirende proteinsyntese i behandlede primære hepatocytter sammenlignet med ubehandlede kontrolceller som påvist ved en kemoselectiv ligationsreaktionsanalyse. Mens du forsøger denne procedure, er det vigtigt at huske at forberede alle nødvendige reagenser og medier på forhånd. Denne teknik banede vejen for forskeren inden for hepatisk metabolisk patofysiologi at udforske den molekylære mekanisme af energi protein regulering i fedme og type to diabetes i isolerede primære mus hepatocyte.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Model of Disturbed Flow-Induced Atherosclerosis in Mouse Carotid Artery by Partial Ligation and a Simple Method of RNA Isolation from Carotid Endothelium

Despite the well-known close association, direct evidence linking disturbed flow to atherogenesis has been lacking. We have recently used a modified ...

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

In vitro Organoid Kultur i Primary Mouse tyktarmstumorer

Several  human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic  integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical ...

Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

Cokultur Analyse af Ekstracellulære proteininteraktioner påvirker insulin fra bugspytkirtlens beta-celler

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

A Modified Method for Heterotopic Mouse Heart Transplantion

En modificeret Metode til Heterotop Mouse Heart Transplantion

Mice are often used as heart transplant donors and recipients in studies of transplant immunology due to the wide range of transgenic mice and reagents ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Fremgangsmåde til at opnå primær ovariecancer celler fra Solid Prøver

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Isolering og dyrkning af Primære endotelceller fra Canine arterier og vener

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

Fluorescerende farvestofmærkning af erytrocytter og leukocytter til at studere strømdynamikken i muskelspiralcirkulation

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Lentiviral vektor-medieret genterapi af hepatocytter Ex Vivo til autolog Transplantation hos svin

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...

Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

Ultralyd-forstærket primær voksen fibroblast isolation

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary ...

A Non-Invasive Method for Generating the Cyclic Loading-Induced Intra-Articular Cartilage Lesion Model of the Rat Knee

En ikke-invasiv metode til generering af den cykliske belastningsinducerede intraartikulære brusklæsionsmodel af rotteknæet

The pathophysiology of primary osteoarthritis (OA) remains unclear. However, a specific subclassification of OA in relatively younger age groups is likely ...