Name: isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method
Uploaded: 2018-10-23T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method at JoVE.com

Wij danken Drs. Joonbae Seo en Vivian Hwa voor hun wetenschappelijke inbreng en discussie. Dit werk werd gesteund door de National Institute of Health (NIH) (R01DK107530). T.N. werd gesteund door de PRESTO uit het Japan Science and Technology Agency. Een deel van deze studie werd gesteund door een subsidie van NIH (P30DK078392) voor de spijsvertering ziekte Core onderzoekscentrum in Cincinnati.

Dit protocol bevat het gebruik van laboratorium muizen. Verzorging van de dieren en experimentele procedures werden uitgevoerd volgens de procedures die zijn goedgekeurd door de commissies van de verzorging van de dieren van de centrum van de geneeskunde van het ziekenhuis van de kinderen van Cincinnati.
1. isolatie van primaire muisknop hepatocyten
<ol><li>Pre isolatie preparaten<ol>
<li>450 mL 40% dichtheid kleurovergang buffer bereiden zoals beschreven in tabel 1 en blijv...

Hoewel verschillende vereeuwigd hepatische cellijnen zijn voorgesteld en gebruikt voor het onderzoeken van de lever functies49,50,51,52, deze cellen in het algemeen ontbreekt aan de belangrijke en fundamentele functies van de normale hepatocyten, zoals de uitdrukking van albumine (Figuur 3). Het wordt algemeen erkend, daarom, dat met behulp van primaire hepatocyten...

Eiwit is een belangrijk element van de voeding en ongeveer 50% van het drooggewicht van het menselijk lichaam is samengesteld uit eiwitten die verschillende biologische kenmerken en functies1 hebben. Bijgevolg eiwitsynthese is een van de meeste energie verbruikende gebeurtenissen en een verandering in de stofwisseling van eiwit is sterk gekoppeld aan de ontwikkeling van ziekten, met inbegrip van metabole ziekten2,3,4. In de lever, eiwit biosynthese goed voor ongeveer 20 tot 30% van de totale energie verbruik5,6. Ter vermeerdering, eiwitten functie niet alleen passief bouwen van blokken van de lever, maar ook actief signaal-bemiddelen factoren intracellulair of extracellularly te reguleren de systemische metabolisme7. Bijvoorbeeld, de lagere niveaus van serum albumine, die gesynthetiseerd en uitgescheiden door de lever en de overvloedigste eiwitten in het plasma8, verhoogt het risico van type 2 diabetes ontwikkeling9,10, 11, terwijl een hogere concentratie van serum albumine beschermend is tegen metabool syndroom12te ontwikkelen. Bovendien kan gestoord of verstoring van secretoire of membraan-gebonden hepatische eiwitten, die homeostase van cholesterol moduleren, waaronder lipoproteïnen, LDLR en LRP1, leiden tot de ontwikkeling of insulineresistentie, hyperlipidemie, atherosclerose 13. Daarom, de identificatie van moleculaire pathofysiologische mechanismen die bij eiwit verstoring van het metabolisme in de lever en de bijbehorende metabole complicaties betrokken zijn kan zinvol zijn voor het ontdekken van de roman farmacologische benaderingen om begin retard of het metabole ziektes zoals diabetes, insulineresistentie en non-alcoholische vette lever.
Eiwitsynthese is nauw gekoppeld aan de status van de cellulaire energie (b.v., de vorming van één binding van peptide tijdens de stap van de rek van de eiwitsynthese vereist 4 phosphodiester obligaties14) en wordt gereguleerd door moleculaire trajecten die zin Inter - en intra - cellular nutriënten beschikbaarheid15,16. AMP-geactiveerd proteïne kinase (AMPK) is één van de intracellulaire energie-sensoren die energie homeostase17handhaven. Zodra AMPK wordt geactiveerd wanneer de cellulaire energie niveaus lager worden, functioneren AMPK en haar gerichte substraten om te stimuleren katabole pathways en remmen anabole processen, met inbegrip van eiwit synthese18,19. De regulering van de eiwitsynthese wordt gemedieerd door fosforylering van meerdere factoren van de vertaling en ribosomal eiwitten20. Van de nota, de zoogdieren doel van rapamycin complexe 1 (mTORC1), een belangrijke bestuurder van de eiwitsynthese, is een van de hoofddoelen van AMPK21. Activering van de mTORC1-pathway verbetert de celgroei en proliferatie door stimulerende eiwit vertaling en autophagy20,21. Het is daarom logisch dat activering van AMPK mTORC1-gemedieerde eiwit synthese22kan remmen. Inderdaad, activering van AMPK tegengaat en direct kinaseenzym mTORC1 op threonine residu 2446 (Thr2446) leidt tot de inactivatie23 en onderdrukking van de proteïne biosynthese24. Bovendien kunnen AMPK niet indirect mTORC1 functie door fosforylatie en activering van Tubereuze sclerose complex 2 (TSC2)25 die de upstream regulator van mTORC1 signalering trapsgewijs remmen. Kortom, disregulatie van deze trajecten in de lever is vaak gekoppeld aan de ontwikkeling van metabole ziekten en daarom is er dringend behoefte om effectieve experimentele instrumenten voor het onderzoek naar de rol van deze trajecten in de regulering van energie en eiwit metabolisme in hepatocyten.
Er is een sterkere gelijkenis tussen de functionele eigenschappen van geïsoleerde primaire hepatocyten en in vivo hepatocyten dan met in vitro lever afkomstige cel lijnen26,27,28. Het is aangetoond dat primaire menselijke hepatocyten 77% gelijkenis met die van lever biopsieën delen, overwegende dat HepG2 cellen, die goed gedifferentieerde hepatische kankercellen en op grote schaal gebruikt om te onderzoeken van hepatische functies, vertonen die minder dan 48% in het kader van genexpressie profielen29. Daarom gebruik van primaire hepatocyten, in plaats van vereeuwigd cultuur cellen, is van vitaal belang bij het onderzoeken van hepatische functie en fysiologie, en diverse protocollen beschikbaar zijn voor de isolatie en de cultuur van primaire hepatocyten vooral van ratten30,31. Terwijl de rat hepatocyten handig met een relatief hogere opbrengst van cellen zijn, hebben muis hepatocyten een groter potentieel in vele wetenschappelijke aspecten vanwege de brede beschikbaarheid van genetisch gemoduleerde muizen. Er zijn echter verschillende technische uitdagingen in het isoleren van gezonde en overvloedige primaire hepatocyten van muizen voor cellulaire en moleculaire gebaseerde evaluaties: ten eerste, inbrengen van de canule aan het perfuse van de lever met buffer reagentia is zeer moeilijk te behandelen vanwege de kleine en dunne muis portal ader of vena cava inferior; Ten tweede, een langere tijd van de manipulatie van cellen tijdens de isolatie vermindering kan veroorzaken in cel hoeveelheid en kwaliteit; derde, niet-enzymatische mechanische scheidingsmethoden kunnen leiden tot ernstige schade en een lage opbrengst van levensvatbare geïsoleerde primaire hepatocyten32,33. In de jaren 1980, collagenase perfusie techniek geïntroduceerd voor het isoleren van hepatocyten uit de lever van de dieren34. Deze methode is gebaseerd op collagenase perfusie van de lever35,36,,37, infusie van de lever met calcium complexvormer oplossing38,39, enzymatische spijsvertering en mechanische dissociatie van de hepatische parenchym35. In de eerste stap is de lever van een muis met een calcium [Ca2 +] gratis buffer met een [Ca2 +] complexvormer (ethyleendiamine Dinatriumethyleendiaminetetra-azijnzuuroplossing, NA2EDTA) geperfundeerd. In de tweede stap, is de muis lever geperfundeerd met een buffer van collagenase-bevattende te hydrolyseren van de mobiele-extracellulaire matrix interacties. In tegenstelling tot de buffer die wordt gebruikt in stap 1, de aanwezigheid van [Ca2 +]-ionen in de buffer van de tweede stap is vereist voor effectieve collagenase activiteit, waarna de verteerd lever heeft verder zachtjes en mechanisch gescheiden met behulp van de verlostang tussen de hepatische capsule en parenchymateuze weefsel. Ten slotte, bindweefsel wordt verwijderd door te filteren, en latere centrifugeren scheidt levensvatbare hepatocyten uit zowel niet-parenchymal cellen en niet-levende hepatocyte met het gebruik van dichtheid kleurovergang buffer40,41 ,42. In de huidige studie tonen we een gemodificeerde tweestaps collagenase perfusie techniek te isoleren van de primaire hepatocyten uit de lever van een muis voor de analyse van de eiwitsynthese.
De radiolabeling van eiwitten wordt veel gebruikt om te kwantificeren van de expressie-niveaus, omzet tarieven, en bepalen de biologische distributie van eiwitten,43 , vanwege de hoge gevoeligheid van detectie van radioactiviteit44. Echter, vereist het gebruik van radioactieve isotopen onderzoek sterk gecontroleerde omstandigheden en procedures45. Alternatieve niet-radioactieve methoden zijn ontwikkeld en steeds meer aan populariteit hebben gewonnen. De reactie van de chemo-selectieve afbinding met een Tetramethylrhodamine (TAMRA) methode voor de detectie van de eiwitten is een van hen en is gebaseerd op de chemo-selectieve reactie tussen een azide en alkyn groepen46, die kan worden gebruikt voor het analyseren van cellulaire gebeurtenissen zoals opsporen ontluikende eiwitsynthese en subklassen van glycoproteïnen bewerkt met een azide groep. Voor ontluikende eiwitsynthese, zijn L-Azidohomoalanine (L-AHA, een aminozuur azide gemodificeerde) metabolisch opgenomen in eiwitten en opgespoord door middel van de TAMRA eiwit detectie methode47. Met behulp van deze test in primaire muisknop hepatocyten, laten we zien dat het ontluikende eiwit synthese tarief is strak gekoppeld aan de beschikbaarheid van ATP van mitochondriale en AMPK activering (Figuur 1).
Kortom, gebruik van primaire muisknop hepatocyten is cruciaal voor het onderzoeken van het metabolisme van eiwitten en energie en kwantificeren van de ontluikende eiwitsynthese is waardevol voor het verkrijgen van inzicht in de fysiologische rol van trajecten die relevant zijn voor de ontwikkeling en genezen van hepatocyte-gerelateerde ziekten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-tetraacetic acid</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB00505-00025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10X) no calcium, magnesium, phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient buffer</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11885-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1897141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams medium E, no glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12551-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type X</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>039-17864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>Masterflex L/S</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV administration set</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>29081</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A water bath</td>
			<td>REVSCI</td>
			<td>RS-PB-200</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube heater</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Isotemp</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Lab, Inc</td>
			<td>0-39613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>PHOENIX</td>
			<td>10250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved Cotton Tips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>23-400-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri Dish</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Connector (Male Luer Lock Ring)</td>
			<td>Cole-Parmer instrument</td>
			<td>EW-4551807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24G catheters</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>Surflo 24Gx3/4&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;m Filter (CELL STRAINERS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10199-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical-bottom centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical-bottom centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C33370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AHA (L-azidohomoalanine)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (methionine free)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21013024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cystine Dihydrochloride</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C2526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli sample buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P9599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS solution (20%)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL (1M)</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB14044-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Heatblock</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12621-092</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Rotator</td>
			<td>Grant-bio</td>
			<td>PTR-60</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Sonicator</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>GE130PB</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Heavy-Duty Vortex Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-566</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A variable mode laser scanner</td>
			<td>GE Healthcare Life Science</td>
			<td>FLA 9500</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie-dye reagent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>24594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blotting apparatus</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>TC20</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorChem R system</td>
			<td>proteinsimple</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Ampka (T172) antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>2535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total-AMPK antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>5832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>4929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta actin antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-130656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors and forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method

Hepatocyten parenchymal cellen van de lever en in dienst nemen van meerdere metabole functies, met inbegrip van synthese en secretie van eiwitten essentieel voor systemische energie homeostase. Primaire hepatocyten geïsoleerd uit de lymfkliertest lever vormen een waardevolle biologische hulpmiddel om te begrijpen van de functionele eigenschappen of de veranderingen die zich voordoen in de lever. Hierin we beschrijven een methode voor het isoleren en de cultuur van de primaire muisknop hepatocyten door het uitvoeren van een tweestaps collagenase perfusie techniek en hun gebruik voor het onderzoeken van eiwit metabolisme te bespreken. De lever van een volwassen muis is sequentieel geperfundeerd met ethyleenglycol-bis Dinatriumethyleendiaminetetra-azijnzuuroplossing (EGTA) en collagenase, gevolgd door de isolatie van hepatocyten met de dichtheid kleurovergang buffer. Deze geïsoleerde hepatocyten levensvatbaar op cultuur platen zijn en de meerderheid van de begiftigde kenmerken van hepatocyten te handhaven. Deze hepatocyten kunnen worden gebruikt voor de beoordeling van eiwit metabolisme met inbegrip van ontluikende eiwitsynthese met niet-radioactieve reagentia. We laten zien dat de geïsoleerde hepatocyten gemakkelijk worden gecontroleerd en bestaan uit een hogere stabiliteit van de kwaliteit en het volume van eiwitsynthese gekoppeld aan energiemetabolisme door gebruik te maken van de chemo-selectieve afbinding reactie met een Tetramethylrhodamine (TAMRA) eiwit detectiemethode en westelijke bevlekkende analyses. Deze methode is daarom waardevol voor het onderzoeken van hepatische ontluikende eiwitsynthese gekoppeld aan energie homeostase. Het volgende protocol worden de materialen en methoden voor de isolatie van kwalitatief hoogwaardige primaire muisknop hepatocyten en opsporing van ontluikende eiwitsynthese.

Primaire muisknop hepatocyten isolatie resulteert in een opbrengst van ongeveer 20 x 106 totaal cellen/muis. Histologisch, live en bijgevoegde primaire hepatocyten verschijnen veelhoekige of typische zeshoekige vorm met duidelijk omschreven membraanachtig grens na een incubatieperiode van 24 h (Figuur 2).
We vergeleken om te bevestigen of geïsoleerde cellen primaire hepatocyten zijn, exp...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method at JoVE.com

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

Isolatie van primaire muisknop hepatocyten door niet-radioactieve L-azidohomoalanine Labeling methode p.a. ontluikende eiwit synthese

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van gezonde en functionele primaire muisknop hepatocyten. Instructies voor het opsporen van hepatische ontluikende eiwitsynthese door niet-radioactieve labeling substraat werden verstrekt om te helpen begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de eiwitsynthese in het kader van de homeostase van de energie-metabolisme in de lever.

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in verschillende gebieden van metabole ziekte onderzoek over moleculaire veranderingen van leverenergie en eiwit biosynthese in obesitas, niet-alcoholische vette lever, en type twee diabetes. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het de isolatie van functionele primaire muis hepatocyten en detectie leververblijvende eiwitten via een niet-radioactieve etikettering substraat vergemakkelijkt. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang als de perfusie stap is moeilijk te leren vanwege de kleine en dunne muis bloedvaten.Voor leverperfusie, voorzichtig een 24-meter katheter in de Inferieure Vena Cava of IVC net bij de splitsing met de juiste nierader. Verwijder de katheteraaald die de positie van de canule in het IVC behoudt en sluit een 24-meter canule aan met perfusiebuis met behulp van de connector. Begin met het doorsluipen van de lever met warme HBSS-min bij een permanente stroomsnelheid van vier milliliter die snel de miltader snijdt om het interne bloed uit te voeren.Na 10 minuten, doorsnede de muis lever met 35 milliliter HBSS plus aangevuld met Collagenase Type X met een stroomsnelheid van vier milliliter per minuut, klemmen de milt ader voor ongeveer 10 seconden om de paar minuten om de distributie van het perfusaat in de lever te vergemakkelijken. Wanneer alle collagenase is geperfundeerd, breng de lever op een lab weefsel voor het stoppen van de pomp om te voorkomen dat de bloed terugstroom in de lever. Gebruik tangen om de galblaas te verwijderen en veeg de lever voorzichtig af met een vers laboratoriumweefsel om bloed te verwijderen.Plaats de lever in een petrischaaltje van 100 millimeter met vijf milliliter verse warme HBSS plus aangevuld met Collagenase en gebruik verdwaalde tangen om de levercapsule voorzichtig te verwijderen. Gebruik de tangen om het parenchymale weefsel zorgvuldig te verspreiden en voeg 15 milliliter koude DMEM toe aan de petrischaal. Schud de gescheurde lever voorzichtig om de resterende parenchymale cellen los te laten in het medium en voeg nog eens 15 milliliter koude DMEM toe aan de schotel om de rest van de cellen te verwerven.Vervolgens filter de weefseldrijfmest door een 100 micron celzeef in een 50 milliliter conische buis op ijs. Om de primaire muis hepatocyten te isoleren, verzamel de cellen door centrifugatie en resuspend de pellet in 10 milliliter verse DMEM. Leg de cellen voorzichtig over een gradiëntbuffer van 40% voor dichtheidsgradiëntscheiding en gooi de cellen uit de bovenste en middelste lagen na centrifugatie.Resuspend de primaire parenchymale hepatocyte pellet met twee tot drie milliliter van William's Medium E om te voorkomen dat het verzamelen van dode cellen uit de wand van de buis en de overdracht van de cellen in een nieuwe 50 milliliter buis. Meng de cellen met een extra zeven tot acht milliliter van William's E Medium voor centrifugatie en resuspend de pellet in 10, 20, of 30 milliliter verse William's Medium E, afhankelijk van de grootte van de pellet. Na het tellen, zaad zes keer 10 tot de vijfde cellen om elke put van een zes-put plaat voor een twee tot drie uur incubatie bij 37 graden Celsius.Vervang aan het einde van de incubatie het medium door DMEM aangevuld met 10% Foetaal Runderserum en anti-anti om de dode en ongebonden cellen te verwijderen en de cellen 's nachts terug te brengen naar de couveuse. Voeg voor azide-gemodificeerde ontluikende eiwitlabeling 20 tot 40 microgram cellysaat toe aan 50 microliter 2x-reactiebuffer. Breng het volume op 80 microliter met gedestilleerd gedeïsized water en vortex de eiwitoplossing gedurende vijf seconden.Voeg vijf microliter kopersulfaat toe aan de cellen voor nog eens vijf seconden vortex, gevolgd door vijf microliters van reactiebuffer additief een met vijf seconden vortexing. Voeg na een incubatie van drie minuten 10 microliters gereconstitueerde reactiebuffer additief twee toe aan de cellen voor nog eens vijf seconden vortex en draai het monster gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius op een multi-rotator machine beschermd tegen licht. Voeg aan het einde van de rotatie 300 microliter methanol toe aan het lysaat, gevolgd door 75 microliter chloroform en 200 microliter dubbel gedestilleerd water.Verzamel het gelabelde eiwit door centrifugatie en voeg 250 microliters verse methanol toe aan de pellet. Na het vortexen, centrifugeren het lysate opnieuw en bedek de kale pellet met een pluisvrij weefsel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Voor pagina-analyse, oplos de gedroogde pellet in 20 microliter van laadbuffer zonder beta-mercaptoethanol en vortex de pellet gedurende 10 minuten.Verwarm vervolgens het eiwit in een warmteblok van 70 graden Celsius gedurende 10 minuten en laad het monster op een 10% natriumdolkekhylfaatgel voor detectie van tetramethylrhodamine. Gebruik vervolgens een laserscanner in variabele modus voor de precieze kwantificering van de AHA-gelabelde ontluikende eiwitten. Histologisch, levend en bijgevoegd primaire hepatocyten verschijnen typisch veelhoekige of zeshoekige vorm met een duidelijk geschetste membranous grens na 24 uur van cultuur.Om te bevestigen of de geïsoleerde cellen primaire hepatocyten zijn, werden in dit experiment albumine eiwitexpressieniveaus vergeleken in embryonale fibroblasten van muizen, een muizenhepatomacellijn, geïsoleerde primaire muishepatocyten en muislevers. De albumine eiwitexpressie werd gedetecteerd in primaire muishepatocyten en muislevers, maar was niet detecteerbaar in embryonale fibroblasten van muizen of hepatoma cellijncellen. Primaire hepatocyte behandeling met 10 micromolar Rotenone gedurende vier tot zes uur bleek een robuuste inductie van lever-geactiveerde eiwit kinase zoals gedetecteerd door verhoogde fosforylatie niveaus op hepatische AMP-geactiveerde eiwit kinase T172 vergelijkbaar met die waargenomen in vivo.Inderdaad, vijf uur van 10 micromolar Rotenone behandeling had diepgaande remmende effecten op ontluikende eiwitsynthese in behandelde primaire hepatocyten in vergelijking met onbehandelde controlecellen, zoals aangetoond door een chemoselectieve ligatie reactietest. Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om alle vereiste reagentia en mediums op voorhand voor te bereiden. Deze techniek maakte de weg vrij voor de onderzoeker op het gebied van leverabolische pathofysiologie om het moleculaire mechanisme van energie-eiwitregulatie bij obesitas en type twee diabetes in geïsoleerde primaire muishopatocyte te verkennen.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Model of Disturbed Flow-Induced Atherosclerosis in Mouse Carotid Artery by Partial Ligation and a Simple Method of RNA Isolation from Carotid Endothelium

Een model van Disturbed Flow-geïnduceerde atherosclerose in Muis halsslagader op een gedeelte van ligatie en een eenvoudige methode van RNA isolatie van carotis Endotheel

Despite the well-known close association, direct evidence linking disturbed flow to atherogenesis has been lacking. We have recently used a modified ...

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

In vitro organoïde Cultuur van primaire Mouse Colon Tumoren

Several  human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic  integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical ...

Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

Coculture Analyse van extracellulaire eiwit interacties met invloed op de insulinesecretie door bètacellen in de pancreas

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

A Modified Method for Heterotopic Mouse Heart Transplantion

Een gewijzigde methode voor Heterotope Mouse Hart transplantatie

Mice are often used as heart transplant donors and recipients in studies of transplant immunology due to the wide range of transgenic mice and reagents ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Methode voor het verkrijgen van Primary eierstokkankercellen Van Solid Exemplaren

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Isolatie en Cultuur van primaire endotheelcellen van Canine slagaders en aders

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

Fluorescent Dye Etikettering van Erythrocyten en Leukocyten voor het bestuderen van de Flow Dynamics in de retinale circulatie van de muis

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Lentivirale Vector-gemedieerde gentherapie van hepatocyten Ex Vivo voor autologe transplantatie in varkens

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...

Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

Ultrasoon-verhoogde primaire volwassen fibroblast-isolatie

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary ...

A Non-Invasive Method for Generating the Cyclic Loading-Induced Intra-Articular Cartilage Lesion Model of the Rat Knee

Een niet-invasieve methode voor het genereren van het cyclische belastingsgeïnduceerde intra-articulaire kraakbeenlaesiemodel van de rattenknie

The pathophysiology of primary osteoarthritis (OA) remains unclear. However, a specific subclassification of OA in relatively younger age groups is likely ...