Name: isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method
Uploaded: 2018-10-23T13:30:00
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Nous remercions les Drs Joonbae Seo et Vivian Hwa pour leur apport scientifique et de la discussion. Ce travail a été soutenu par le National Institute of Health (NIH) (R01DK107530). T.N. était soutenue par le PRESTO de la Japan Science and Technology Agency. Une partie de cette étude a été financée par une subvention du NIH (P30DK078392) pour le digestif Disease Research Core Center à Cincinnati.

Ce protocole comporte l’utilisation de souris de laboratoire. Soins des animaux et des procédures expérimentales ont été effectuées conformément aux procédures approuvées par les comités de protection des animaux de Cincinnati Children Hospital Medical Center.
1. isolation des hépatocytes de souris primaire
<ol><li>Préparations d’isolement préalable<ol>
<li>Préparez 450 mL de tampon gradient de densité 40 % comme indiqué dans le tableau 1 et conserver à 4...

Bien que plusieurs lignées de cellules hépatiques immortalisées ont été proposées et utilisées pour étudier les fonctions du foie49,50,51,52, ces cellules manquent généralement de l’importante et fondamentale fonctions des hépatocytes normaux, comme l’expression d’albumine (Figure 3). Par conséquent, il est largement reconnu qu’utilisant des hé...

Les protéines sont un élément nutritionnel important et environ 50 % du poids sec du corps humain est composé de protéines qui ont plusieurs caractéristiques biologiques et fonctions1. Par conséquent, la synthèse des protéines est l’un des plupart des événements de votre énergie et une altération du métabolisme des protéines est fortement associée à l’apparition de maladies, y compris les maladies métaboliques2,3,4. Dans le foie, biosynthèse protéique représente environ 20 à 30 % de l’énergie totale consommation5,6. En outre, la fonction de protéines non seulement passif ou de blocs de construction de la foie, mais aussi actifs signal-médiation facteurs intracellulaire ou extracellulaire pour réguler le métabolisme systémique7. Par exemple, des niveaux réduits de sérum albumine, qui est synthétisée et sécrétée par le foie et la protéine la plus abondante dans le plasma8, augmente le risque du type 2 diabète développement9,10, 11, alors qu’une concentration plus élevée de l’albumine sérique est protecteur contre le développement de syndrome métabolique12. En outre, perturbés ou perturbation des protéines hépatiques sécrétoires ou liée à la membrane, qui modulent l’homéostasie du cholestérol, notamment des lipoprotéines et LDLR LRP1, peut conduire au développement de la résistance à l’insuline, hyperlipidémie ou l’athérosclérose 13. par conséquent, l’identification des mécanismes pathophysiologiques moléculaires qui sont impliquées dans les troubles de métabolisme de protéines dans le foie et les complications métaboliques associées pourrait être utile pour découvrir le roman pharmacologique approches pour retarder l’apparition ou traiter des maladies métaboliques telles que la résistance à l’insuline, le diabète et non alcooliques du foie gras.
La synthèse des protéines est intimement liée à l’état de l’énergie cellulaire (p. ex., la formation d’une liaison peptidique au cours de l’étape d’élongation de la synthèse des protéines nécessite 4 de liaisons phosphodiester14) et est régulée par des mécanismes moléculaires qui détectent la inter - et intra-cellulaires disponibilité des nutriments15,16. Kinase de protéine activée par l’AMP (AMPK) est l’un des capteurs énergie intracellulaire qui maintiennent de l’homéostasie énergétique17. Une fois AMPK est activé lorsque les niveaux d’énergie cellulaires devient plus faibles, fonctionnent AMPK et ses substrats ciblées pour stimuler les voies cataboliques et inhiber le processus anaboliques y compris la synthèse de protéines18,19. La régulation de la synthèse protéique est médiée par la phosphorylation de multiples facteurs de translation et de protéines ribosomiques20. À noter, la mammifères cible de la rapamycine complexe 1 (mTORC1), des principaux moteurs de la synthèse protéique, est une des cibles principales de l’AMPK21. Activation de la voie mTORC1 améliore la croissance cellulaire et la prolifération de protéines stimulant traduction et autophagie20,21. Il est donc logique que l’activation de l’AMPK peut inhiber la synthèse de protéine induite par le mTORC122. En effet, l’activation de l’AMPK compense et phosphoryle directement mTORC1 sur des résidus thréonine 2446 (Thr2446) conduisant à son inactivation23 et la suppression de la biosynthèse de protéine24. En outre, AMPK peut indirectement mTORC1 la fonction d’inhibition par la phosphorylation et l’activation de la sclérose tubéreuse de Bourneville complexe 2 (TSC2)25 qui est le régulateur en amont de la cascade de signalisation de mTORC1. En bref, le dérèglement de ces voies dans le foie est souvent lié à l’évolution des maladies métaboliques et donc il y a un besoin essentiel d’établir des outils expérimentaux efficaces afin d’étudier le rôle de ces voies dans la régulation de l’énergie et métabolisme des protéines dans les hépatocytes.
Il y a une forte similitude entre les propriétés fonctionnelles des hépatocytes primaires isolés et des hépatocytes in vivo que in vitro dérivées de foie cellules lignes26,27,28. Il a été démontré que des hépatocytes humains primaires partagent 77 % de similarité avec celui des biopsies du foie, tandis que les cellules HepG2, qui sont des cellules cancéreuses hépatiques bien différenciés et largement utilisé pour étudier les fonctions hépatiques, affichent moins de 48 % dans le contexte de les profils d’expression génétique29. Par conséquent, l’utilisation des hépatocytes primaires, plutôt que des cellules de culture immortalisées, est d’une importance vitale dans l’enquête sur la physiologie et la fonction hépatique, et plusieurs protocoles sont disponibles pour l’isolement et la culture des hépatocytes primaires surtout à partir de rats30,31. Tandis que les hépatocytes de rat sont utiles avec un rendement relativement plus élevé de cellules, hépatocytes de souris ont un plus grand risque dans de nombreux aspects scientifiques grâce à la large disponibilité des souris génétiquement modulés. Cependant, il existe plusieurs défis techniques pour isoler les hépatocytes primaires saines et abondantes de souris pour les évaluations de base cellulaire et moléculaire : tout d’abord, l’insertion de la canule à perfuse le foie avec des réactifs de tampon est très difficile à gérer en raison de la veine porte souris petits et minces ou la veine cave inférieure ; en second lieu, un temps plus long de la manipulation des cellules lors de l’isolation peuvent provoquer diminution cellule quantitatif et qualitatif ; méthodes de séparation mécanique troisième, non enzymatique peuvent causer des dommages graves et produire un faible rendement des hépatocytes primaires isolés viables32,,33. Dans les années 1980, collagénase perfusion technique a été introduite pour isoler les hépatocytes des foies des animaux34. Cette méthode repose sur la perfusion du foie35,36,37, infusion du foie avec calcium chélateur solution38,39, digestion enzymatique collagénase et dissociation mécanique du parenchyme hépatique35. Dans un premier temps, un foie de souris est perfusé avec un tampon sans calcium [Ca2 +] contenant un agent chélateur [Ca2 +] (acide éthylènediamine tétraacétique, EDTA). Dans la deuxième étape, le foie de souris est perfusé avec un tampon contenant de collagénase à hydrolyser les interactions cellulaires-extracellulaire. À la différence de la mémoire tampon utilisé dans la première étape, la présence d’ions [Ca2 +] dans la mémoire tampon de la deuxième étape est nécessaire pour l’activité de la collagénase efficace, après quoi le foie digéré doit être doucement et mécaniquement séparée à l’aide de la pince entre la la capsule hépatique et tissu parenchymateux. Enfin, le tissu conjonctif est éliminé par filtrage et ultérieure centrifugation sépare les hépatocytes viables de tant de cellules non parenchymateuses et non-vivant hépatocyte avec l’utilisation de densité gradient tampon40,41 ,42. Dans la présente étude, nous montrons une technique de perfusion de collagénase modifié en deux étapes pour isoler les hépatocytes primaires un foie de souris pour l’analyse de la synthèse protéique.
Le radiomarquage des protéines est largement utilisé pour quantifier les niveaux d’expression, les taux de renouvellement et de déterminer la distribution biologique des protéines43 en raison de la forte sensibilité de détection de radioactivité44. Toutefois, l’utilisation d’isotopes radioactifs exige recherche hautement contrôlée des circonstances et des procédures45. Autres méthodes non radioactif ont été développés et ont gagné de plus en plus en popularité. La réaction de ligature chimio-sélectif avec une méthode de détection de protéines tétraméthylrhodamine (TAMRA) est l’un d'entre eux et est basée sur la réaction de chimio-sélectif entre un azoture et alcyne groupes46, qui peut être utilisé pour analyser les événements cellulaires tels que détection de la synthèse des protéines naissantes et des sous-classes de glycoprotéines modifiés avec un groupe azoture. Pour la synthèse de la protéine naissante, L-Azidohomoalanine (L-AHA, acide aminé modifié d’azide) peut être incorporé dans les protéines métaboliquement et détecté en utilisant la détection la protéine TAMRA méthode47. En utilisant ce dosage dans les hépatocytes de souris primaire, nous montrons que le taux de synthèse de protéine naissante est intimement lié à la disponibilité de l’ATP de mitochondriale et l’activation de l’AMPK (Figure 1).
En résumé, utilisation des hépatocytes de souris primaire est cruciale pour enquêter sur le métabolisme protéique et énergétique et quantifier la synthèse de la protéine naissante est utile pour obtenir un aperçu du rôle physiologique des voies pour l’élaboration et guérison de maladies liées à l’hépatocyte.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-tetraacetic acid</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB00505-00025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10X) no calcium, magnesium, phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient buffer</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11885-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1897141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams medium E, no glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12551-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type X</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>039-17864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>Masterflex L/S</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV administration set</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>29081</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A water bath</td>
			<td>REVSCI</td>
			<td>RS-PB-200</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube heater</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Isotemp</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Lab, Inc</td>
			<td>0-39613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>PHOENIX</td>
			<td>10250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved Cotton Tips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>23-400-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri Dish</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Connector (Male Luer Lock Ring)</td>
			<td>Cole-Parmer instrument</td>
			<td>EW-4551807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24G catheters</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>Surflo 24Gx3/4&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;m Filter (CELL STRAINERS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10199-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical-bottom centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical-bottom centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C33370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AHA (L-azidohomoalanine)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (methionine free)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21013024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cystine Dihydrochloride</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C2526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli sample buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P9599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS solution (20%)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL (1M)</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB14044-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Heatblock</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12621-092</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Rotator</td>
			<td>Grant-bio</td>
			<td>PTR-60</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Sonicator</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>GE130PB</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Heavy-Duty Vortex Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-566</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A variable mode laser scanner</td>
			<td>GE Healthcare Life Science</td>
			<td>FLA 9500</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie-dye reagent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>24594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blotting apparatus</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>TC20</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorChem R system</td>
			<td>proteinsimple</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Ampka (T172) antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>2535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total-AMPK antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>5832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>4929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta actin antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-130656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors and forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method

Les hépatocytes sont des cellules parenchymateuses du foie et engagent plusieurs fonctions métaboliques, y compris la synthèse et la sécrétion de protéines essentielles pour l’homéostasie énergétique systémique. Hépatocytes primaires isolés du foie murine constituent un précieux outil biologique pour comprendre les propriétés fonctionnelles ou les altérations qui se produisent dans le foie. Dans les présentes, nous décrivons une méthode pour l’isolement et la culture des hépatocytes de souris primaire en effectuant une technique de perfusion de collagénase en deux étapes et discuter de leur utilisation pour l’étude du métabolisme des protéines. Le foie d’une souris adulte est séquentiellement perfusé avec acide tétraacétique de l’éthylène glycol-bis (EGTA) et collagénase, suivie de l’isolation des hépatocytes avec le tampon de gradient de densité. Ces hépatocytes isolés sont viables sur des plaques de culture et de maintiennent la majorité des caractéristiques dotés des hépatocytes. Ces hépatocytes peuvent être utilisés pour les évaluations du métabolisme des protéines dont la synthèse de la protéine naissante avec des réactifs non radioactif. Nous montrons que les hépatocytes isolés sont facilement contrôlés et comprennent une plus grande stabilité de qualité et le volume de la synthèse protéique liée au métabolisme de l’énergie en utilisant la réaction de ligature chimio-sélectif avec une protéine tétraméthylrhodamine (TAMRA) méthode de détection et western blot analyses. Par conséquent, cette méthode est utile pour étudier la synthèse des protéines naissantes hépatique liée à l’homéostasie énergétique. Le protocole suivant décrit les matériaux et les méthodes pour la détection de la synthèse de la protéine naissante et l’isolation des hépatocytes de souris primaire de haute qualité.

Isolement des hépatocytes principal de la souris se traduit par un rendement d’environ 20 x 106 total cellules/souris. Sur le plan histologique, direct et attachés les hépatocytes primaires apparaissent polygonales ou typique hexagonal en forme avec clairement décrites limite membraneux après 24 h d’incubation (Figure 2).
Pour vérifier si les cellules isolées sont les hépatocy...

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Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

Isolation des hépatocytes de souris primaire pour analyse-synthèse protéine naissante par méthode d’étiquetage non-radioactifs L-azidohomoalanine

Nous présentons ici un protocole pour l’isolement des hépatocytes de souris primaire sain et fonctionnel. Instructions pour la détection de la synthèse hépatique de protéine naissante de substrat étiquetage non radioactif ont été fournies pour aider à comprendre les mécanismes qui sous-tendent la synthèse protéique dans le contexte de l’homéostasie énergétique du métabolisme dans le foie.

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans divers domaines de recherche sur les maladies métaboliques sur les altérations moléculaires de l’énergie hépatique et la biosynthèse protéique dans l’obésité, le foie gras non alcoolique et le diabète de type deux. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle facilite l’isolement des hépatocytes fonctionnels primaires de souris et la détection des protéines hépatiques naissantes par l’intermédiaire d’un substrat d’étiquetage non radioactif. La démonstration visuelle de cette méthode est critique car l’étape de perfusion est difficile à apprendre en raison des vaisseaux sanguins de souris petits et minces.Pour la perfusion du foie, insérez soigneusement un cathéter de calibre 24 dans le Véna Cava inférieur ou IVC juste à la bifurcation avec la veine rénale droite. Retirez l’aiguille du cathéter en maintenant la position de la canule dans l’IVC et connectez une canule de calibre 24 avec le tube de perfusion à l’aide du connecteur. Commencez à perfuser le foie avec hbss chaud moins à un débit permanent de quatre millilitres rapidement couper la veine splénique pour drainer le sang interne.Après 10 minutes, infuser le foie de souris avec 35 millilitres de HBSS plus complété par collagène de type X à un débit de quatre millilitres par minute, serrant la veine splénique pendant environ 10 secondes toutes les quelques minutes pour faciliter la distribution du perfusate dans tout le foie. Lorsque toute la collagène a été perfusée, transférer le foie sur un tissu de laboratoire avant d’arrêter la pompe pour éviter le flux sanguin dans le foie. Utilisez des forceps pour enlever la vésicule biliaire et essuyez doucement le foie avec un tissu de laboratoire frais pour enlever tout sang.Placer le foie dans une boîte de Pétri de 100 millimètres contenant cinq millilitres de HBSS chaud frais plus complété par de la collagène et utiliser des forceps à pointes parasites pour enlever délicatement la capsule hépatique. Utilisez les forceps pour disperser soigneusement le tissu parenchymal et ajouter 15 millilitres de DMEM froid à la boîte de Pétri. Secouez doucement le foie déchiré pour libérer les cellules parenchymales résiduelles dans le milieu et ajoutez encore 15 millilitres de DMEM froid au plat pour acquérir le reste des cellules.Filtrez ensuite la boue tissulaire à travers une passoire cellulaire de 100 microns dans un tube conique de 50 millilitres sur la glace. Pour isoler les hépatocytes primaires de souris, recueillez les cellules par centrifugation et réutilisez la pastille en 10 millilitres de DMEM frais. Superposez soigneusement les cellules sur un tampon de gradient de densité de 40 % pour la séparation du gradient de densité, en jetant les cellules des couches supérieure et moyenne après centrifugation.Resuspendez la pastille primaire d’hépatocyte parenchymal avec deux à trois millilitres du E moyen de William pour éviter de recueillir des cellules mortes de la paroi du tube et transférer les cellules dans un nouveau tube de 50 millilitres. Mélangez les cellules avec sept à huit millilitres supplémentaires de William’s E Medium avant la centrifugation et résuspendez la pastille en 10, 20 ou 30 millilitres de E moyen de William frais selon la taille de la pastille. Après compter, graine six fois 10 à la cinquième cellule à chaque puits d’une plaque de six puits pour une incubation de deux à trois heures à 37 degrés Celsius.À la fin de l’incubation, remplacer le milieu par du DMEM complété par 10% de sérum bovin fœtal et anti-anti pour enlever les cellules mortes et non attachées et retourner les cellules à l’incubateur pendant la nuit. Pour l’étiquetage des protéines naissantes modifiées par l’azide, ajouter de 20 à 40 microgrammes de lysate cellulaire à 50 microlitres de tampon de réaction 2X. Porter le volume à 80 microlitres avec de l’eau déionisée distillée et vortexer la solution protéique pendant cinq secondes.Ajouter cinq microlitres de sulfate de cuivre aux cellules pour un autre vortex de cinq secondes, suivi de cinq microlitres d’additif tampon de réaction avec cinq secondes de vortex. Après une incubation de trois minutes, ajouter 10 microlitres d’additif tampon de réaction reconstitué deux aux cellules pour un autre vortex de cinq secondes et faire pivoter l’échantillon pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius sur une machine multi-rotateur protégée de la lumière. À la fin de la rotation, ajouter 300 microlitres de méthanol au lysate, suivi de 75 microlitres de chloroforme et de 200 microlitres d’eau distillée double.Recueillir la protéine étiquetée par centrifugation et ajouter 250 microlitres de méthanol frais à la pastille. Après vortex, centrifugeuse le lysate à nouveau et couvrir la pastille nue avec un tissu sans peluche pendant 15 minutes à température ambiante. Pour l’analyse page, solubiliser la pastille séchée dans 20 microlitres de tampon de chargement sans bêta-mercaptoéthanol et vortex la pastille pendant 10 minutes.Ensuite, chauffer la protéine dans un bloc thermique de 70 degrés Celsius pendant 10 minutes et charger l’échantillon sur un gel de sulfate de dodecyl de 10 % pour la détection de la tétraméthylrhodamine. Utilisez ensuite un scanner laser à mode variable pour quantifier avec précision les protéines naissantes étiquetées AHA. Histologiquement, les hépatocytes primaires vivants et attachés apparaissent typiquement polygonaux ou hexagonaux dans la forme avec une frontière membranous clairement décrite après 24 heures de culture.Pour confirmer si les cellules isolées sont des hépatocytes primaires, dans cette expérience, des niveaux d’expression de protéine d’albumine ont été comparés dans les fibroblastes embryonnaires de souris, une ligne cellulaire d’hépatome de souris, les hépatocytes primaires isolés de souris, et les foies de souris. L’expression de protéine d’albumine a été détectée dans les hépatocytes primaires de souris et les foies de souris, mais n’était pas détectable dans les fibroblastes embryonnaires de souris ou les cellules de ligne cellulaire d’hépatome. Le traitement primaire d’hépatocyte avec la rotenone de 10 micromolaire pendant quatre à six heures a indiqué une induction robuste de kinase hépatique de protéine AMP-activée telle que détectée par des niveaux accrus de phosphorylation sur le kinase t172 hépatique d’AMP-activé de protéine semblable à ceux observés in vivo.En effet, cinq heures de traitement de Rotenone de 10 micromolar ont eu des effets inhibiteurs profonds sur la synthèse naissante de protéine dans les hépatocytes primaires traités comparés aux cellules de commande non traitées comme démontré par un essai de réaction de ligature chemosélective. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de préparer tous les reagents et les supports requis à l’avance. Cette technique a ouvert la voie au chercheur dans le domaine de la pathophysiologie métabolique hépatique pour explorer le mécanisme moléculaire de la régulation des protéines énergétiques dans l’obésité et le diabète de type deux dans l’hépatocyte primaire isolé de souris.

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