Name: isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method
Uploaded: 2018-10-23T13:30:00
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DRS. Joonbae Seo und Vivian Hwa danken wir für ihre wissenschaftlichen Beiträgen und Diskussionen. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Health (NIH) (R01DK107530) unterstützt. T.n. wurde durch das PRESTO aus Japan Science and Technology Agency unterstützt. Ein Teil dieser Studie wurde unterstützt durch einen Zuschuss von NIH (P30DK078392) für die Magen-Darm-Krankheit Forschungszentrum Kern in Cincinnati.

Dieses Protokoll enthält die Verwendung von Labormäusen. Tierbetreuung und experimentelle Verfahren wurden nach Verfahren genehmigt von den Ausschüssen der Tierbetreuung des Cincinnati Children Hospital Medical Center durchgeführt.
1. Isolierung der primäre Maustaste Hepatozyten
<ol><li>Pre-Isolierung-Vorbereitungen<ol>
<li>Bereiten Sie 450 mL 40 % Dichte-Gradienten-Puffer, wie in Tabelle 1 und halten bei 4 ° C (15 mL/Maus) beschrieben.</li>
		<li>500 mL Williams' Medi...

Obwohl mehrere verewigt hepatische Zelllinien vorgeschlagen und Leberfunktionen49,50,51,52untersucht wurden, fehlen diese Zellen in der Regel die wichtige und grundlegende Funktionen des normalen Hepatozyten, z. B. den Ausdruck von Albumin (Abbildung 3). Es ist daher allgemein anerkannt, dass primäre Hepatozyten eine wertvolle Option für die Prüfung von Leber Ph...

Eiweiß ist ein wichtiger Bestandteil der Ernährung und ca. 50 % des Trockengewichts des menschlichen Körpers besteht aus Proteinen, die mehrere biologische Merkmale und Funktionen1haben. Infolgedessen Proteinsynthese ist eines der meisten Energie raubend Ereignisse und eine Veränderung im Eiweißstoffwechsel ist stark verbunden mit der Entwicklung von Krankheiten, einschließlich Stoffwechselerkrankungen2,3,4. In der Leber Protein-Biosynthese entfallen ca. 20 – 30 % der Gesamtenergie Verbrauch5,6. Darüber hinaus Proteine Funktion als nicht nur passiv oder Bausteine der Leber, aber auch aktive Signal vermittelnde Faktoren intrazellulär oder extrazellulär, systemische Stoffwechsel7zu regulieren. Zum Beispiel verringerte Niveaus des Serum-Albumin, das synthetisiert und abgesondert von der Leber und das am häufigsten vorkommende Protein in der Plasma-8, erhöht das Risiko für Typ 2 Diabetes Entwicklung9,10, 11, während eine höhere Konzentration der Serum-Albumin protektiv gegen metabolische Syndrom12zu entwickeln. Darüber hinaus führen gestört oder Unterbrechung der sekretorischen oder Membrane-springen hepatischen Proteine, die Cholesterin-Homöostase, einschließlich Lipoproteine, LDLR und LRP1, modulieren die Entwicklung der Insulin-Resistenz, Hyperlipidämie oder Atherosklerose zu 13. daher die Identifizierung von molekularen pathophysiologischen Mechanismen, die Protein-Stoffwechsel-Störung in der Leber und seine metabolischen Komplikationen beteiligt sind möglicherweise hilfreich für die Entdeckung Roman pharmakologischen nähert sich, um den Ausbruch zu verzögern oder Stoffwechselerkrankungen wie Insulinresistenz, Diabetes und nicht-Alkoholische Fettleber zu behandeln.
Proteinsynthese ist eng an den zellulären Energiezustand (z. B.die Bildung einer Peptidbindung bei der Dehnung Schritt der Proteinsynthese benötigt 4 Phosphodiester-Anleihen14) und wird durch molekulare Signalwege, die Sinn geregelt Inter - und intra - zellulare nährstoffverfügbarkeit15,16. AMP-aktivierte Proteinkinase (AMPK) gehört zu den intrazellulären energiesensoren, die Energie Homöostase17pflegen. Sobald AMPK aktiviert wird, wenn die zelluläre Energie-Level niedriger geworden, funktionieren AMPK und seine gezielte Substrate katabolischen Wege anzuregen und anabole Prozesse einschließlich Protein Synthese18,19zu hemmen. Die Regulierung der Protein-Synthese wird durch Phosphorylierung mehrerer Übersetzung Faktoren und ribosomale Proteine20vermittelt. Der Hinweis ist das Säugetier-Ziel von Rapamycin Komplex 1 (mTORC1), eine wichtige Triebkraft für die Proteinsynthese, eines der wichtigsten Ziele der AMPK21. Aktivierung des mTORC1-Signalwegs steigert das Zellwachstum und Proliferation durch stimulierende Protein Übersetzung und Autophagie20,21. Daher ist es logisch, dass die Aktivierung der AMPK mTORC1-vermittelten Protein Synthese22hemmen kann. In der Tat, Aktivierung der AMPK entgegenwirkt und direkt phosphorylates mTORC1 auf Threonin Rückstände 2446 (Thr2446) führt zu seiner Inaktivierung23 und Unterdrückung der Protein-Biosynthese-24. Darüber hinaus kann AMPK indirekt hemmen mTORC1 Funktion durch Phosphorylierung und Aktivierung des Tuberöse Sklerose Komplex 2 (TSC2)25 ist der upstream Regler von mTORC1 Signalkaskade. Kurzum, Dysregulation dieser Wege in der Leber ist oft in Zusammenhang mit der Entwicklung von Stoffwechselkrankheiten und deshalb gibt es eine kritische Notwendigkeit, wirksame experimentelle Instrumente zur Untersuchung der Rolle dieser Wege bei der Regulierung der Energie zu etablieren und Protein-Stoffwechsel in Hepatozyten.
Es gibt eine stärkere Ähnlichkeit zwischen den funktionellen Eigenschaften der isolierte primäre Hepatozyten und in Vivo Hepatozyten als mit in-vitro- Leber-abgeleitete Zelle Linien26,27,28. Es hat sich gezeigt, dass primären humanen Hepatozyten 77 % Ähnlichkeit mit derjenigen leberbiopsien, teilen während HepG2-Zellen, die sind gut differenzierte hepatische Krebszellen und weit verbreitet, hepatische Funktionen zu untersuchen, weniger als 48 % im Zusammenhang mit der Anzeige Genexpression profile29. Daher die Nutzung der primäre Hepatozyten, anstatt verewigt Zellkulturen, ist von entscheidender Bedeutung bei der Untersuchung der Leberfunktion und Physiologie und mehrere Protokolle stehen für die Isolation und die Kultur der primäre Hepatozyten vor allem von Ratten30,31. Während die Ratte Hepatocytes mit einer relativ höheren Ausbeute von Zellen nützlich sind, haben Maus Hepatozyten ein größeres Potenzial in vielen wissenschaftlichen Bereichen aufgrund der breiten Verfügbarkeit von genetisch modulierter Mäuse. Allerdings gibt es einige technische Herausforderungen gesunde und reichliche primäre Hepatozyten von Mäusen für Zelluläre und molekulare Basis Bewertungen zu isolieren: Erstens Kanüle einführen, die Leber mit Puffer Reagenzien durchspülen ist sehr schwierig zu handhaben wegen der kleinen und dünnen Maus Pfortader oder minderwertige Vena Cava; Zweitens kann eine längere Zeit der Manipulation von Zellen während der Isolation reduzierte Zelle Quantität und Qualität verursachen; Dritten, nicht-enzymatische Mechanische Trennverfahren können zu schweren Schäden führen und produzieren einen niedrigen Ertrag von lebensfähigen isolierte primäre Hepatozyten32,33. In den 1980er Jahren wurde Kollagenase Perfusion Technik zur Isolierung von Hepatozyten aus der Leber von Tieren34eingeführt. Diese Methode basiert auf Kollagenase Perfusion der Leber35,36,37, Infusion von der Leber mit Kalzium Chelator Lösung38,39, enzymatischen Verdauung und mechanische Dissoziation der hepatischen Parenchym35. In einem ersten Schritt ist eine Maus-Leber mit ein Kalzium [Ca2 +] freie Puffer mit ein [Ca2 +] Chelator (Ethylenediamine Tetraacetic Säure, EDTA) durchströmt. Im zweiten Schritt wird die Maus Leber mit Kollagenase-haltigen Puffer, um die Mobilfunk-extrazelluläre Matrix Interaktionen hydrolyseneigung durchströmt. Im Gegensatz zu den Puffer in Schritt 1 verwendet, das Vorhandensein von [Ca2 +] Ionen im Puffer des zweiten Schrittes ist erforderlich für effektive Kollagenase Aktivität, nach denen die verdaute Leber hat weiter sanft und mechanisch getrennt werden mit Pinzette zwischen die Hepatische Kapsel und parenchymatösen Gewebe. Zu guter Letzt Bindegewebe wird durch Filterung entfernt, und anschließende Zentrifugation trennt tragfähige Hepatozyten aus sowohl nicht-parenchymal Zellen und nicht-lebenden Hepatozyten mit dem Einsatz von Dichte Gradienten Puffer40,41 ,42. In der vorliegenden Studie zeigen wir eine modifizierte zweistufige Kollagenase Perfusion Technik, primäre Hepatozyten aus einer Maus Leber für die Analyse von Protein-Synthese zu isolieren.
Die enzymatische Proteine ist verbreitet zu quantifizieren Ausdruck Niveaus, Fluktuation, und die biologischen Verteilung von Proteinen43 wegen der hohen Empfindlichkeit der Erkennung von Radioaktivität44ermitteln. Allerdings erfordert die Verwendung von radioaktiven Isotopen streng kontrollierte Forschung Umstände und Verfahren45. Alternative nicht-radioaktiven Methoden wurden entwickelt und haben zunehmend an Popularität gewonnen. Die Chemo-selektive Unterbindung Reaktion mit einer Tetramethylrhodamine (TAMRA) Protein Erkennungsmethode ist einer von ihnen und basiert auf die Chemo-selektiven Reaktion zwischen einem azid und Alkinen Gruppen46, die genutzt werden können, wie z. B. zelluläre Ereignisse zu analysieren Erkennung von entstehenden Protein-Synthese und Unterklassen von Glykoproteinen modifiziert mit einer azid-Gruppe. Für die im Entstehen begriffene Proteinsynthese kann L-Azidohomoalanine (L-AHA, eine azid-modifizierte Aminosäure) metabolisch in Proteine aufgenommen und mithilfe der TAMRA Protein Erkennung Methode47erkannt. Durch die Verwendung dieser Assay in primäre Maustaste Hepatozyten, wir zeigen, dass die entstehenden Protein-Synthese-Rate von Mitochondrien, die Verfügbarkeit von ATP eng ist und die AMPK Aktivierung (Abbildung 1).
Zusammenfassend lässt sich sagen, Nutzung der primäre Maustaste Hepatozyten ist entscheidend für die Untersuchung von Protein und Energie-Stoffwechsel und Quantifizierung der im Entstehen begriffenen Proteinsynthese ist wertvoll für Einblicke in die physiologische Rolle von Wege für die Entwicklung und Heilung von Hepatozyten-Erkrankungen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-tetraacetic acid</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB00505-00025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10X) no calcium, magnesium, phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient buffer</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11885-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1897141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams medium E, no glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12551-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type X</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>039-17864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>Masterflex L/S</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV administration set</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>29081</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A water bath</td>
			<td>REVSCI</td>
			<td>RS-PB-200</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube heater</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Isotemp</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Lab, Inc</td>
			<td>0-39613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>PHOENIX</td>
			<td>10250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved Cotton Tips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>23-400-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri Dish</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Connector (Male Luer Lock Ring)</td>
			<td>Cole-Parmer instrument</td>
			<td>EW-4551807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24G catheters</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>Surflo 24Gx3/4&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;m Filter (CELL STRAINERS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10199-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical-bottom centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical-bottom centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C33370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AHA (L-azidohomoalanine)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (methionine free)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21013024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cystine Dihydrochloride</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C2526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli sample buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P9599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS solution (20%)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL (1M)</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB14044-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Heatblock</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12621-092</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Rotator</td>
			<td>Grant-bio</td>
			<td>PTR-60</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Sonicator</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>GE130PB</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Heavy-Duty Vortex Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-566</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A variable mode laser scanner</td>
			<td>GE Healthcare Life Science</td>
			<td>FLA 9500</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie-dye reagent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>24594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blotting apparatus</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>TC20</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorChem R system</td>
			<td>proteinsimple</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Ampka (T172) antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>2535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total-AMPK antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>5832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>4929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta actin antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-130656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors and forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method

Hepatozyten parenchymal Zellen der Leber sind und mehrere metabolische Funktionen, einschließlich der Synthese und Sekretion von Proteinen essentiell für systemische energiehomöostase zu engagieren. Primäre Hepatozyten isoliert aus der murinen Leber bilden ein wertvolles biologische Tool um zu verstehen, die funktionellen Eigenschaften oder Veränderungen in der Leber auftreten. Hierin haben wir beschreiben eine Methode zur Isolierung und Kultur der primäre Maustaste Hepatozyten durch eine zweistufige Kollagenase Perfusion Technik durchführen und besprechen ihre Nutzung für die Untersuchung von Protein-Stoffwechsel. Die Leber einer Erwachsenen Maus ist mit Ethylenglykol-Bis Tetraacetic Säure (EGTA) und Kollagenase, gefolgt von der Isolation der Hepatozyten mit dem Dichte-Gradienten-Puffer nacheinander durchströmt. Diese isolierten Hepatozyten sind lebensfähig auf Kultur-Platten und pflegen die meisten dotierten Merkmale der Hepatozyten. Diese Hepatozyten können für die Beurteilung der Protein-Stoffwechsel, einschließlich der im Entstehen begriffenen Proteinsynthese mit nicht-radioaktiven Reagenzien verwendet werden. Wir zeigen, dass die isolierte Hepatozyten leicht gesteuert werden und eine höhere Qualität und Volumen Stabilität der Verbindung mit Energie-Stoffwechsel umfassen durch die Nutzung der Chemo-selektive Unterbindung Reaktion mit einem Tetramethylrhodamine (TAMRA) Protein-Protein-Synthese Nachweisverfahren und western Blot Analysen. Daher ist diese Methode wertvolle für die Untersuchung von hepatischen im Entstehen begriffenen Proteinsynthese energiehomöostase verbunden. Das folgende Protokoll werden die Materialien und Methoden für die Isolierung von qualitativ hochwertigen primäre Maustaste Hepatozyten und Erkennung der im Entstehen begriffenen Proteinsynthese.

Primäre Maustaste Hepatozyten Isolation ergibt sich eine Rendite von ca. 20 x 106 total Zellen/Maus. Histologisch, live und angefügte primäre Hepatozyten erscheinen polygonalen oder typische sechseckige Form mit klar umrissen membranöse Begrenzung nach 24 h Inkubation (Abbildung 2).
Um zu bestätigen, ob isolierte Zellen primäre Hepatozyten sind, verglichen wir Ausdruck Niveaus des P...

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Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

Isolierung der primäre Maustaste Hepatozyten für entstehende Protein Synthese Analyse von nicht-radioaktiven L-Azidohomoalanine Kennzeichnung Methode

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Isolierung von gesunden und funktionalen primäre Maustaste Hepatozyten. Anweisungen für die Erkennung von hepatischen im Entstehen begriffenen Proteinsynthese durch nicht-radioaktiven Kennzeichnung Substrat wurden zum besseren Verständnis der Mechanismen, die Protein-Synthese im Rahmen des Energie-Stoffwechsel-Homöostase in der Leber.

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

Diese Methode kann helfen, schlüsselhafte Fragen in verschiedenen Bereichen der Stoffwechselkrankheit Forschung Über molekulare Veränderungen der Leberenergie und Proteinbiosynthese bei Fettleibigkeit, alkoholfreie Fettleber, und Typ-2-Diabetes zu beantworten. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie die Isolierung von funktionellen primären Maushepatozyten und detektionshepatische aufkeimende Proteine über ein nicht radioaktives Etikettiersubstrat erleichtert. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da der Perfusionsschritt aufgrund der kleinen und dünnen Mausblutgefäße schwer zu erlernen ist.Für Leberperfusion, legen Sie vorsichtig einen 24 Gauge Katheter in die inferior Vena Cava oder IVC nur an der Bifurkation mit der rechten Nierenvene. Entfernen Sie die Katheternadel, die die Position der Kanüle innerhalb des IVC beibehält, und schließen Sie eine 24 Gauge Kanüle mit Perfusionsrohr mit dem Stecker an. Beginnen Sie, die Leber mit warmen HBSS minus bei einem vier Milliliter permanenten Durchfluss schnell schneiden die Milzvene, um das innere Blut abfließen.Nach 10 Minuten durchdringen Sie die Mausleber mit 35 Millilitern HBSS plus ergänzt mit Kollagenase Typ X bei einer Durchflussrate von vier Millilitern pro Minute, wobei die Milzvene alle paar Minuten etwa 10 Sekunden lang geklemmt wird, um die Verteilung des Perfusaten in der Leber zu erleichtern. Wenn die gesamte Kollagenase durchdren wurde, übertragen Sie die Leber auf ein Laborgewebe, bevor Sie die Pumpe anhalten, um einen Blutrückfluss in die Leber zu vermeiden. Verwenden Sie Zangen, um die Gallenblase zu entfernen und sanft die Leber mit einem frischen Laborgewebe zu wischen, um Blut zu entfernen.Legen Sie die Leber in eine 100-Millimeter-Petrischale mit fünf Millilitern frischwarmen HBSS plus ergänzt mit Collagenase und verwenden Streuner-SpitzenZange, um die Leberkapsel sanft zu entfernen. Verwenden Sie die Zange, um das parenchymale Gewebe sorgfältig zu dispergieren und fügen Sie 15 Milliliter kalte DMEM auf die Petrischale. Schütteln Sie die zerrissene Leber sanft, um die verbleibenden parenchymalen Zellen in das Medium freizusetzen und fügen Sie weitere 15 Milliliter kaltes DMEM in die Schale, um den Rest der Zellen zu erwerben.Dann filtern Sie die Gewebeschlämme durch ein 100 Mikron Zellsieb in eine 50 Milliliter konische Röhre auf Eis. Um die primären Maushepatozyten zu isolieren, sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet in 10 Milliliter frischem DMEM wieder auf. Schichtung der Zellen über einen Gradientenpuffer mit einer Dichte von 40 % für die Trennung des Dichtegradienten, wodurch die Zellen nach der Zentrifugation aus der oberen und mittleren Schicht verworfen werden.Setzen Sie das primäre parenchymale Hepatozytenpellet mit zwei bis drei Millilitern Von Williams Medium E wieder auf, um das Sammeln abgestorbener Zellen von der Rohrwand zu vermeiden und die Zellen in eine neue 50-Milliliter-Röhre zu übertragen. Mischen Sie die Zellen mit weiteren sieben bis acht Millilitern von Williams E Medium vor der Zentrifugation und setzen Sie das Pellet in 10, 20 oder 30 Milliliter frischer William es Medium E je nach Größe des Pellets wieder auf. Nach dem Zählen, Samen sechs mal 10 bis die fünfte Zelle zu jedem Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte für eine zwei- bis dreistündige Inkubation bei 37 Grad Celsius.Ersetzen Sie am Ende der Inkubation das Medium durch DMEM, ergänzt durch 10%Fetal Bovine Serum und Anti-Anti, um die toten und nicht angeschlossenen Zellen zu entfernen und die Zellen über Nacht in den Inkubator zurückzuführen. Zur Azid-modifizierten Proteinbeschriftung 20 bis 40 Mikrogramm Zelllysat zu 50 Mikroliter 2X Reaktionspuffer hinzufügen. Bringen Sie das Volumen auf 80 Mikroliter mit destilliertem deionisiertem Wasser und wirbeln Sie die Proteinlösung für fünf Sekunden.Fügen Sie fünf Mikroliter Kupfersulfat zu den Zellen für einen weiteren Wirbel von fünf Sekunden hinzu, gefolgt von fünf Mikrolitern Reaktionspufferadditiv eins mit fünf Sekunden Wirbel. Nach einer dreiminütigen Inkubation 10 Mikroliter rekonstituiertes Reaktionspufferadditiv zwei für einen weiteren Wirbel von fünf Sekunden in die Zellen geben und die Probe 20 Minuten bei vier Grad Celsius auf einer lichtgeschützten Multirotatormaschine drehen. Am Ende der Rotation 300 Mikroliter Methanol in das Lysat geben, gefolgt von 75 Mikroliter Chloroform und 200 Mikroliter doppelt destilliertem Wasser.Sammeln Sie das markierte Protein durch Zentrifugation und fügen Sie 250 Mikroliter frisches Methanol in das Pellet. Nach dem Wirbeln das Lysat wieder zentrieren und das blanke Pellet bei Raumtemperatur 15 Minuten lang mit einem fusselfreien Gewebe bedecken. Für die PAGE-Analyse das getrocknete Pellet in 20 Mikroliter Ladepuffer ohne Beta-Mercaptoethanol auflösen und das Pellet 10 Minuten lang wirbeln.Als nächstes erhitzen Sie das Protein in einem 70 Grad Celsius Wärmeblock für 10 Minuten und laden Sie die Probe auf ein 10%Natrium-Dodecylsulfat-Gel für den Tetramethylrhodaminnachweis. Verwenden Sie dann einen Laserscanner mit variablem Modus für die präzise Quantifizierung der aHA-markierten entstehenden Proteine. Histologisch erscheinen lebende und angehängte primäre Hepatozyten typischerweise polygonal oder hexagonal in Form mit einer klar umrissenen membranösen Grenze nach 24 Stunden Kultur.Um zu bestätigen, ob es sich bei den isolierten Zellen um primäre Hepatozyten handelt, wurden in diesem Experiment Albumin-Protein-Expressionsniveaus in embryonalen Fibroblasten der Maus, einer Maus-Hepatom-Zelllinie, isolierten primären Maushepatozyten und Mauslebern verglichen. Die Albumin-Proteinexpression wurde in primären Maushepatozyten und Mauslebern nachgewiesen, war aber weder in embryonalen Fibroblasten der Maus noch in Häpatom-Zelllinienzellen nachweisbar. Die primäre Hepatozytenbehandlung mit 10 mikromolarem Rotenon für vier bis sechs Stunden ergab eine robuste Induktion der hepatischen AMP-aktivierten Proteinkinase, die durch erhöhte Phosphorylierungsniveaus an der hepatischen AMP-aktivierten Proteinkinase T172 ähnlich der in vivo beobachteten nachgewiesen wurde.Tatsächlich hatten fünf Stunden mit 10 mikromolarer Rotenone-Behandlung tiefgreifende hemmende Auswirkungen auf die aufkeimende Proteinsynthese in behandelten primären Hepatozyten im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen, wie ein chemoselektiver Ligationsreaktionstest zeigt. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, alle erforderlichen Reagenzien und Medien im Voraus vorzubereiten. Diese Technik ebnete dem Forscher auf dem Gebiet der hepatischen metabolischen Pathophysiologie den Weg, um den molekularen Mechanismus der Energieproteinregulation bei Adipositas und Typ-2-Diabetes bei isoliertem primären Maushepatozyten zu erforschen.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Forschung

Medizin

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